專利名稱：使病毒和細(xì)菌失活的聚合涂料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及使病毒和細(xì)菌失活的聚合涂料(也稱為“涂料(paint)”)，及其使用方法。
本申請(qǐng)要求2006年11月8日提交的U.S.S.N.60/864,967的優(yōu)先權(quán)。
政府支持
本發(fā)明在由美國(guó)軍隊(duì)通過(guò)MIT的士兵納米技術(shù)研究所授予的合同DAAD-19-02-D-0002的政府支持下進(jìn)行。政府在本發(fā)明中具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
存在對(duì)能夠殺滅有害微生物的材料的濃厚興趣，特別是對(duì)能夠用于涂布日常生活中人們所接觸的常用物體(例如門(mén)把手、兒童玩具、電腦鍵盤(pán)、電話等)的表面的材料以使得所述常用物體抗菌并因此不能傳播病毒和細(xì)菌感染。由于普通材料不是抗微生物的，需要將其改性。例如，用聚(乙二醇)和某些其他的合成聚合物化學(xué)改性的表面盡管不能殺滅微生物卻能抗微生物(Bridgett，M.J.等人，S.P.(1992)Biomaterials 13，411-416。Arciola，C.R.等人、Alvergna，P.、Cenni，E.&Pizzoferrato，A.(1993)Biomaterials 14，1161-1164。Park，K.D.、Kim，Y.S.、Han，D.K.、Kim，Y.H.、Lee，E.H.B、Suh，H.& Choi，K.S.(1998)Biomaterials 19，851-859。)也可參見(jiàn)Swanson的美國(guó)專利No.5,783,502，其描述了將織物基材改性以使病毒(特別是脂質(zhì)包被病毒)失活的試劑和方法，其中所述基材通過(guò)光化學(xué)固定含有季銨基團(tuán)和烴鏈的親水聚合物而改性，從而得到在與基材接觸時(shí)能夠破壞脂質(zhì)包被病毒的局部表面活性物質(zhì)。Surfacine Development Co.的WO1999/40791描述了一種組合物，當(dāng)將其施用至基材時(shí)，該組合物在基材表面上形成粘附、透明的水不可溶聚合膜，所述膜可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供持久的抗菌和抗病毒作用而無(wú)須再次施用。據(jù)稱該涂料通過(guò)接觸殺傷機(jī)理而提供表面消毒作用，且不會(huì)將其組分釋放至在導(dǎo)致溶液消毒的水平上的接觸溶液中。所述組合物包含有機(jī)雙胍聚合物和抗菌金屬材料的組合。所述聚合物必須能夠可逆地結(jié)合或絡(luò)合金屬材料，并使金屬材料緩慢進(jìn)入與其接觸的微生物的細(xì)胞膜中。
或者，能向材料中注入抗菌劑，如抗菌素、季銨化合物、銀離子或碘，所述抗菌劑能隨時(shí)間緩慢釋放至環(huán)境溶液中并殺滅其中的微生物(Medlin，J.(1997)Environ.Health Persp.105，290-292；Nohr，R.S.& Macdonald，G.J.(1994)J.Biomater.Sci，Polymer Edn.5，607-619Shearer，A.E.H.等人(2000)Biotechnol.Bioeng.67，141-146。)。Shikani等人的美國(guó)專利No.5,437,656描述了一種與碘溶液絡(luò)合的金屬上的抗感染涂層。也參見(jiàn)Green等人的美國(guó)專利No.6,939,569和Tiller等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.2003/0091641，后者描述了殺菌組合物，該殺菌組合物包含如疏水聚陽(yáng)離子型的聚合化合物，所述聚合化合物能共價(jià)結(jié)合至基材材料上或被噴霧、浸漬、浸涂、涂敷、結(jié)合或粘附至基材上。
盡管這些策略已在含有細(xì)菌的水溶液中得以驗(yàn)證，不期望它們?cè)谌狈σ后w介質(zhì)的條件下可有效抵抗空氣中播散的細(xì)菌。對(duì)于基于釋放的材料特別是如此，當(dāng)浸出抗菌劑用盡時(shí)，所述基于釋放的材料也可容易失效。
感染是許多侵入性手術(shù)、治療和診斷過(guò)程的常見(jiàn)并發(fā)癥。對(duì)于涉及可植入醫(yī)藥設(shè)備的過(guò)程，由于細(xì)菌病毒能形成菌膜，該菌膜能使微生物免于被患者的免疫系統(tǒng)清除并免于藥物作用，因此避免感染特別成問(wèn)題。由于這些感染難以用抗菌素治療，常常需要移去設(shè)備，這對(duì)于患者是損傷性的，且增加了醫(yī)療成本。
由于已公知與消除基于菌膜的感染相關(guān)的困難，已開(kāi)發(fā)出許多技術(shù)以處理表面或液槽表面從而預(yù)防或減少菌膜形成。例如，已利用各種方法用抗菌素(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,107,121、4,442,133、4,895,566、4,917,686、5,013,306、4,952,419、5,853,745和5,902,283)和其他抑菌化合物(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,605,564、4,886,505、5,019,096、5,295,979、5,328,954、5,681,575、5,753,251、5,770,255和5,877,243)涂布醫(yī)療設(shè)備的表面。
盡管努力維持抗菌狀態(tài)，但感染性生物體在醫(yī)療環(huán)境中仍然普遍存在。這些生物體的存在能導(dǎo)致住院患者和醫(yī)務(wù)人員的感染。稱為院內(nèi)感染的這些感染常常涉及比在醫(yī)院外遇到的生物體更具毒力和更不常見(jiàn)的生物體。此外，在醫(yī)院獲得的感染更可能涉及已對(duì)許多抗菌素形成抵抗力的生物體。盡管例行采用清潔和抗菌療法，感染性生物體易于移生于醫(yī)療環(huán)境中的多種表面，特別是那些暴露于潮濕空氣中的或浸入液體中液體的表面。甚至如手套、防護(hù)衣和防護(hù)罩的阻擋層材料也能將感染傳播至穿用者或在醫(yī)療環(huán)境中的其他人。盡管經(jīng)過(guò)滅菌和清洗，在醫(yī)療環(huán)境中的多種金屬和非金屬材料能保留危險(xiǎn)的被菌膜封住的生物體，因此能被傳遞至其他宿主。
任何用于減少醫(yī)療環(huán)境中的菌膜形成的試劑必須對(duì)使用者是安全的。某些殺微生物劑在用量足以干擾菌膜時(shí)也能損害宿主組織。引入局部組織區(qū)域的抗菌素能引發(fā)抗性生物體的形成，該抗性生物體能隨后形成菌膜群落，該菌膜群落的浮游微生物也同樣對(duì)特定的抗菌素具有抵抗性。任何抗菌膜劑或防污劑必須還不干擾醫(yī)療設(shè)備的增進(jìn)健康的特性。選擇某些材料以使特定類型的操縱器具有可操作性、柔軟度、水密性、拉伸強(qiáng)度或抗壓持久性，這些特性不會(huì)因加入的用于抗菌效應(yīng)的試劑而改變。
另一個(gè)問(wèn)題是，可能加至可植入設(shè)備的表面以抑制污染和菌膜形成的材料可是致血栓的。一些可植入材料本身是致血栓的。例如，已表明，與金屬、玻璃、塑料或其他類似表面接觸能引起血液凝集成血凝塊。因此在植入之前將已知具有抗凝效應(yīng)的肝素化合物施用至某些醫(yī)療設(shè)備。然而，在藥品庫(kù)中幾乎沒(méi)有已知即具有抗菌效應(yīng)又具有抗凝效應(yīng)的藥品。這兩種效應(yīng)的結(jié)合對(duì)處理位于血流中的那些醫(yī)療設(shè)備(如心臟瓣膜、人工泵設(shè)備(“人工心臟”或左心室輔助設(shè)備)、血管移植假體和血管支架)特別有價(jià)值。在這些環(huán)境中，凝塊形成能妨礙血液通過(guò)管線的流動(dòng)，并能進(jìn)一步破碎成碎片(稱作栓子)，所述碎片向下游輸送，可能阻斷遠(yuǎn)端組織和器官的循環(huán)。
由于抗病毒產(chǎn)品極少且沒(méi)有通常的抗病毒產(chǎn)品，因此病毒是比細(xì)菌更大的問(wèn)題。病毒流行病能迅速傳播并通過(guò)空氣、水或經(jīng)由直接污染而傳播。例如，流感病毒造成其中一種人類最流行的感染通常在一年內(nèi)，約15％的美國(guó)人口被感染，導(dǎo)致多達(dá)40,000例患者死亡和200,000例患者住院治療(http://www.cdc.gov/flu)。此外，假使具有1918年西班牙流感大流行的估計(jì)死亡率(Wood等人(2004)Nature RevMicrobiol 2842-847)的流感大流行(當(dāng)人類對(duì)其不具有免疫力的新的病毒毒株獲得易于感染人類的能力時(shí))可能在全世界范圍殺滅7500萬(wàn)人。
通常流感病毒(如同許多其他疾病)在由感染者呼出或排出的含有病毒的氣溶膠粒子附著在隨后被其他人接觸的表面上時(shí)進(jìn)行傳播(Wright等人，(2001)在Fields Virology，第4版，eds.Knipe DM，HowleyPM(Lippincott，Philadelphia，PA)，第1533-1579頁(yè))。因此，如果用使流感病毒失活的“涂料”涂布人們遇到的常用物品時(shí)，原則上能預(yù)防這種感染傳播。
因此，存在能夠使得殺滅通常表面的細(xì)菌和/或病毒的需求。
因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供材料和其使用方法，從而殺滅表面的病毒和細(xì)菌。


發(fā)明內(nèi)容
已開(kāi)發(fā)出能以與油漆相同的方式(例如通過(guò)刷涂、噴霧或浸涂)非共價(jià)地施用至如金屬、塑料、玻璃、聚合物的固體表面和其他基材(如織物、紗布、繃帶、紙巾和其他纖維)從而殺滅其表面的病毒和細(xì)菌的疏水聚合涂料。
聚合物優(yōu)選為疏水的、水不溶的、帶電荷的，且能為線性或分支的。優(yōu)選的聚合物包括聚乙烯亞胺的線性或分支的衍生物。較高分子量的聚合物更殺病毒。優(yōu)選的聚合物的重均分子量為20千道爾頓以上，優(yōu)選50千道爾頓以上，更優(yōu)選100千道爾頓以上，更優(yōu)選200千道爾頓以上，且最優(yōu)選750千道爾頓以上。如實(shí)施例所證實(shí)，合適的聚合物包括217千道爾頓的聚乙烯亞胺(PEI)，其由市售的500千道爾頓的聚(2-乙基-2-唑啉)通過(guò)酸水解，然后通過(guò)十二烷基化被季銨化，接著被甲基化而制得(如Klibanov等人的Biotechnology Progress，22(2)，584-589，2006中所描述)。該聚合物的結(jié)構(gòu)顯示如下
能使用的其他疏水聚陽(yáng)離子型涂料包括如下顯示的聚合物
涂料聚合物能溶解于溶劑中，優(yōu)選如丁醇的有機(jī)溶劑中，并例如通過(guò)刷涂或噴霧將所述溶液施用至基材，然后干燥以除去溶劑。
如實(shí)施例所證實(shí)，用分支的或線性N，N-十二烷基，甲基-PEI和其他疏水PEI衍生物涂敷玻片，導(dǎo)致在數(shù)分鐘內(nèi)以基本上是100％的效率殺滅流感病毒(病毒滴度降低至少2-對(duì)數(shù)(2-log)，更優(yōu)選3-對(duì)數(shù)(3-log)，最優(yōu)選至少4-對(duì)數(shù)(4-log))，以及空氣中播散的人類病原菌大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。對(duì)于大多數(shù)涂料聚離子而言，顯示該殺病毒作用在接觸時(shí)發(fā)生，即僅通過(guò)固定在玻片表面的聚合物鏈而殺病毒；盡管對(duì)于其他涂料聚離子而言，從涂敷表面浸出的聚離子可有助于殺病毒活性。已闡明衍生化的PEI的結(jié)構(gòu)與被涂敷表面所得的殺病毒活性之間的關(guān)系。聚合物應(yīng)足夠疏水以在水中不溶，并由此保持覆蓋在基材表面。正電荷似乎是有利的，但并不是必需的，如帶負(fù)電荷和兩親性離子型疏水聚合物所顯示。顯示被涂布的玻片對(duì)如下具有殺病毒性流感病毒A/WSN/33(H1N1)和流感病毒A/Victoria/3/75(H3N2)毒株、A/Wuhan/359/95(H3N2)樣野生型流感病毒和抗奧塞米韋(oseltamivir)變種Glul19Val、和A/turkey/Minnessota/833/80(H4N2)野生型流感病毒和三種抗神經(jīng)氨酸酶抑制劑變種Glul19Asp、Glul19Gly和Arg292Lys。



圖1A為分支PEI的N-十二烷基化和隨后的N-甲基化的圖示。對(duì)于標(biāo)記為“1a-c”的所得產(chǎn)物而言，字母a、b和c用于表明N，N-十二烷基，甲基-聚陽(yáng)離子分別由750千道爾頓、25千道爾頓和2千道爾頓PEI制得。圖1B含有五(5)種合成的線性PEI基聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如實(shí)施例所描述。對(duì)于標(biāo)記為“2a-c”的聚合物而言，字母a、b和c表明N，N-十二烷基，甲基-聚陽(yáng)離子分別由217千道爾頓、21.7千道爾頓和2.17千道爾頓的PEI制得。對(duì)于標(biāo)記為“3”、“4”、“5”或“6”的聚合物，僅使用217千道爾頓的PEI。
圖2為在室溫下用“結(jié)構(gòu)2a”涂敷玻片的流感病毒(WSN株)失活的時(shí)程(分鐘)圖。
圖3為在室溫下暴露不同時(shí)間段(5、30或120分鐘)之后，用“結(jié)構(gòu)2a”、“結(jié)構(gòu)4”或“結(jié)構(gòu)5”涂敷的玻片的抗流感病毒(WSN毒株)的殺病毒活性圖。

具體實(shí)施例方式 I.殺病毒聚合涂料 A.聚合物 定義 兩親性分子或化合物為本領(lǐng)域公知的術(shù)語(yǔ)，其中分子或化合物的一部分是親水的，另一部分是疏水的。兩親性分子或化合物具有可溶于水溶液的一部分，和不可溶于水溶液的一部分。
術(shù)語(yǔ)“親水的”和“疏水的”為本領(lǐng)域公知的，并分別指親水的和憎水的。通常，親水物質(zhì)溶于水，疏水物質(zhì)不溶于水。
本文通常使用的術(shù)語(yǔ)“水不可溶的”指在室溫或體溫下在標(biāo)準(zhǔn)條件下聚合物在水中的溶解度大約是0.1％(重量/重量)以下。
術(shù)語(yǔ)“配體”指在受體位點(diǎn)結(jié)合的化合物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜原子”指除了碳或氫之外的任何元素的原子。優(yōu)選的雜原子為氮、氧、磷、硫和硒。
術(shù)語(yǔ)“吸電子基團(tuán)”是本領(lǐng)域公知的，且表示取代基從相鄰原子吸引價(jià)電子的趨勢(shì)，即取代基相比于相鄰原子是電負(fù)性的。吸電子能力水平的量化由哈米特西格瑪(插入西格瑪)常數(shù)給出。該著名常數(shù)在許多文獻(xiàn)中描述(例如，J.March，Advanced Organic Chemistry，McGraw Hill Book Company，New York，(1977版)，第251-259頁(yè))。哈米特常數(shù)值對(duì)于給電子基團(tuán)通常為負(fù)數(shù)(對(duì)NH2，σ[P]＝-0.66)，且對(duì)于吸電子基團(tuán)通常為正數(shù)(對(duì)硝基，σ[P]＝0.78)，其中σ[P]表示順式取代。示例的吸電子基團(tuán)包括硝基、?；?、甲?；⒒酋；⑷谆?、氰基、氯等。示例的給電子基團(tuán)包括氨基、甲氧基等。
術(shù)語(yǔ)“烷基”指飽和脂肪族基團(tuán)，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)族)、烷基取代的環(huán)烷基，和環(huán)烷基取代的烷基。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈上具有30個(gè)或更少的碳原子(例如對(duì)于直鏈C1-C30，對(duì)于支鏈C3-C30)，且更優(yōu)選20個(gè)或更少的碳原子。同樣地，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有3-10個(gè)碳原子，且更優(yōu)選在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有5、6或7個(gè)碳。
除非另外說(shuō)明碳的數(shù)目，本文所用的“較低烷基”指如上所述的烷基，但在其主鏈結(jié)構(gòu)中具有1至10個(gè)碳，更優(yōu)選1至6個(gè)碳原子。同樣地，“較低烯基”和“較低炔基”具有類似的鏈長(zhǎng)。優(yōu)選的烷基為較低烷基。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本文指定為“烷基”的取代基為較低烷基。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳烷基”指由芳基(例如芳基或雜芳基)取代的烷基。
術(shù)語(yǔ)“烯基”和“炔基”指長(zhǎng)度和可能的取代類似于上述烷基，但分別含有至少一個(gè)雙鍵或三鍵的不飽和脂族基團(tuán)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳基”包括5-、6-和7元單環(huán)芳基(其可包括0至4個(gè)雜原子)，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。那些在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有雜原子的芳基也稱為“芳基雜環(huán)”或“雜芳族”。芳環(huán)能在一個(gè)或多個(gè)環(huán)的位置由如上所述的取代基取代，例如鹵素、疊氮、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞胺基、酰胺基、膦酸酯、亞膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。術(shù)語(yǔ)“芳基”也包括具有兩個(gè)或兩個(gè)以上環(huán)的多環(huán)體系，其中兩個(gè)相鄰環(huán)共用兩個(gè)或兩個(gè)以上碳(所述環(huán)為“稠環(huán)”)，其中至少一個(gè)環(huán)為芳族，例如，另一個(gè)環(huán)可為環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。
術(shù)語(yǔ)鄰、間和對(duì)分別適用于1，2-、1，3-和1，4-雙取代苯。例如，名稱1，2-二甲基苯和鄰-二甲基苯是同義的。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”或“雜環(huán)基團(tuán)”指3-至10-元環(huán)結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選3-至7-元環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)包括1至4個(gè)雜原子。雜環(huán)也可為多環(huán)。雜環(huán)基團(tuán)包括，例如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、呫噸、吩噁噻、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲羅啉、吩嗪、吩吡嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、四氫呋喃、四氫噻吩、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺，如丙內(nèi)酰胺和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等。雜環(huán)能在一個(gè)或多個(gè)位置由如上所述的這種取代基取代，例如鹵素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞胺基、酰胺基、膦酸酯、亞膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
術(shù)語(yǔ)“多環(huán)基”或“多環(huán)基團(tuán)”指兩個(gè)或兩個(gè)以上環(huán)(例如環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)，其中兩個(gè)相鄰環(huán)共用兩個(gè)或兩個(gè)以上碳，例如，所述環(huán)為“稠環(huán)”。通過(guò)非相鄰原子結(jié)合的環(huán)稱作“橋聯(lián)”環(huán)。多環(huán)的每一個(gè)環(huán)能由如上所述的這種取代基取代，例如鹵素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞胺基、酰胺基、膦酸酯、亞膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；?、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”指其中環(huán)上的每個(gè)原子為碳的芳環(huán)或非芳環(huán)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“硝基”指-NO2；術(shù)語(yǔ)“鹵素”指代-F、-Cl、-Br或-I；術(shù)語(yǔ)“巰基”指-SH；術(shù)語(yǔ)“羥基”指-OH；且術(shù)語(yǔ)“磺?；敝?SO2-。
術(shù)語(yǔ)“胺基”和“氨基”是本領(lǐng)域公知的，并均指未取代和取代的胺基。
術(shù)語(yǔ)“酰氨基”是本領(lǐng)域公知的，并指能由如下通式表示的部分
其中R9如上所述，且R’11代表氫、烷基、烯基或--(CH2)m--R8，其中m和R8如上所述。
術(shù)語(yǔ)“酰胺基”是本領(lǐng)域公知為氨基取代的羰基，并包括能由如下通式表示的部分
其中R9、R10如上所述。
術(shù)語(yǔ)“烷硫基”指具有連結(jié)其上的硫基的上述烷基。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述“烷硫基”部分由-S-烷基、--S-烯基、--S-炔基和--S--(CH2)m--R8中的一個(gè)所表示，其中R8如上所述。代表性的烷硫基基團(tuán)包括甲硫基、乙硫基等。
術(shù)語(yǔ)“羰基”是本領(lǐng)域公知的，并包括能由如下通式表示的部分
其中X為鍵或代表氧或硫，且R11代表氫、烷基、烯基、--(CH2)m--R8或醫(yī)藥可接受的鹽，R’11代表氫、烷基、烯基或--(CH2)m--R8，其中m和R8如上所述。當(dāng)X為氧且R11或R’11不是氫時(shí)，該式表示“酯”。當(dāng)X為氧，且R11如上所述時(shí)，本文指該部分為羧基，且特別是當(dāng)R11為氫時(shí)，該式表示“羧酸”。當(dāng)X為氧，且R’11為氫時(shí)，該式表示“甲?；薄Ｍǔ?，當(dāng)上式的氧原子被硫代替時(shí)，該式表示“硫羰基”基團(tuán)。當(dāng)X為硫且R11或R’11不是氫時(shí)，該式表示“硫酯”。當(dāng)X為硫且R11為氫時(shí)，該式表示“硫羧酸”。當(dāng)X為硫且R11’為氫時(shí)，該式表示“硫甲酸酯”。在另一方面，當(dāng)X為鍵，且R11不是氫時(shí)，上式表示“酮”基團(tuán)。當(dāng)X為鍵且R11為氫時(shí)，上式表示“醛”基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”(alkoxyl)或“烷氧基”(alkoxy)指具有連結(jié)其上的氧基的上述烷基。代表性的烷氧基基團(tuán)包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等?！懊选睘閮蓚€(gè)烴通過(guò)一個(gè)氧共價(jià)連接。因此，使得烷基為醚的烷基取代基為或類似于烷氧基，如可由--O-烷基、--O-烯基、--O-炔基、--O-(CH2)m--R8中的一個(gè)表示，其中m和R8如上所述。
術(shù)語(yǔ)“磺酸酯”是本領(lǐng)域公知的，并包括能由如下通式表示的部分
其中R41為電子對(duì)、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。
術(shù)語(yǔ)三氟甲磺?；?、甲苯磺?；⒓谆酋；腿』酋；潜绢I(lǐng)域公知的，并分別指指三氟甲磺?；?、對(duì)甲苯磺?；⒓谆酋；腿』酋；?。術(shù)語(yǔ)三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和全氟丁基磺酸酯是本領(lǐng)域公知的，并分別指三氟甲磺酸酯、對(duì)甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和全氟丁基磺酸酯官能團(tuán)和含有所述官能團(tuán)的分子。
術(shù)語(yǔ)“硫酸酯”是本領(lǐng)域公知的，并包括能由如下通式表示的部分
其中R41如上所述。
術(shù)語(yǔ)“磺?；被睘楸绢I(lǐng)域公知的，并包括能由如下表示的部分
術(shù)語(yǔ)“磺酰胺基”為本領(lǐng)域公知的，并包括能由如下表示的部分
本文所用的術(shù)語(yǔ)“磺?；敝改苡扇缦峦ㄊ奖硎镜牟糠?
其中R44為氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“亞砜基”指能由如下通式表示的部分
其中R44選自氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。
可對(duì)烯基和炔基基團(tuán)進(jìn)行類似的取代以產(chǎn)生，例如，氨基烯基、氨基炔基、酰胺基烯基、酰胺基炔基、亞胺基烯基、亞胺基炔基、硫代烯基、硫代炔基、羰基取代的烯基或炔基。
本文所用的每一個(gè)表述的定義，例如烷基、m、n等，當(dāng)表述在任何結(jié)構(gòu)中發(fā)生超過(guò)一次時(shí)，其定義獨(dú)立于在另外的相同結(jié)構(gòu)中的定義。
應(yīng)了解“取代”或“用…取代”包括的暗示條件是該取代根據(jù)取代原子核取代基的允許價(jià)態(tài)，且該取代導(dǎo)致穩(wěn)定的化合物，例如，該化合物不會(huì)通過(guò)如重排、成環(huán)、消除等自發(fā)發(fā)生轉(zhuǎn)換。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“取代的”意在包括所有可允許的有機(jī)化合物的取代基。在廣泛方面而言，可允許的取代基包括有機(jī)化合物的非環(huán)狀的和環(huán)狀的、分支的和非分支的、碳環(huán)的和雜環(huán)的、芳族和非芳族取代基。說(shuō)明性的取代基包括，例如本文上述的那些。對(duì)于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)化合物，可允許的取代基能為一種或多種且為相同或不同的。為了本發(fā)明的目的，如氮的雜原子可具有氫取代基和/或滿足雜原子價(jià)態(tài)的任何本文所述的可允許的有機(jī)化合物的取代基。本文所述的該聚合物不以任何方式通過(guò)可允許的有機(jī)化合物的取代基進(jìn)行限制。
本文所用的詞組“保護(hù)基團(tuán)”指保護(hù)潛在反應(yīng)活性的官能團(tuán)免于不期望的化學(xué)轉(zhuǎn)換的臨時(shí)取代基。這種保護(hù)基團(tuán)的例子包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚，以及醛和酮的分別的縮醛和縮酮。保護(hù)基團(tuán)化學(xué)領(lǐng)域已被綜述(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in OrganicSynthesis，第2版，WileyNew York，1991)。
疏水的、水不可溶的聚合物 用于形成本文描述的涂料的聚合物優(yōu)選為疏水、水不可溶、帶電的，且能為線性或分支的。優(yōu)選的聚合物包括聚乙烯亞胺的線性或分支的衍生物。所述聚合物可為正電性的、負(fù)電性的，或兩親性離子型的。
發(fā)現(xiàn)沉積的聚合物的分子量對(duì)于表面的抗病毒和抗菌性能是重要的。較高分子量的聚合物通常更殺病毒。優(yōu)選的聚合物的重均分子量為20千道爾頓以上，優(yōu)選50千道爾頓以上，更優(yōu)選100千道爾頓以上，更優(yōu)選200千道爾頓以上，且最優(yōu)選750千道爾頓以上。
如實(shí)施例所顯示，合適的聚合物包括217千道爾頓的聚乙烯亞胺(PEI)，其由市售的500千道爾頓的聚(2-乙基-2-唑啉)通過(guò)酸水解，然后通過(guò)十二烷基化被季銨化，接著被甲基化而制得(如Klibanov等人的Biotechnology Progress，22(2)，584-589，2006中所描述)。該聚合物的結(jié)構(gòu)顯示如下
能使用的其他疏水聚陽(yáng)離子型涂料包括如下所示的聚合物
上述聚合物的預(yù)期相等物包括與其相對(duì)應(yīng)的、具有與其相同的一般性能的聚合物其中對(duì)取代基進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)單的變化，該變化不會(huì)顯著不利地影響所得聚合涂料的殺菌或殺病毒效力。通常，化合物可通過(guò)在例如如下描述的通用反應(yīng)圖解中說(shuō)明的方法，或通過(guò)該方法的修改，使用易于得到的原料、試劑和常規(guī)合成過(guò)程制得。在這些反應(yīng)中，有可能使用本身已知但并未提及的變體。
所述聚合物的分子量為至少10,000克/摩爾，更優(yōu)選100,000克/摩爾，且最優(yōu)選150,000克/摩爾。
在特定具體實(shí)施方案中，施用至表面的化合物由式I表示
其中R在每種情況下單獨(dú)表示氫、烷基、烯基、炔基、?；?、芳基、羧酸酯、烷氧基羰基、芳氧基羰基、羧酰胺基、烷氨基、酰氨基、烷氧基、酰氧基、羥烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、(烷氨基)烷基、硫基、烷硫基、硫烷基、(烷硫基)烷基、氨甲?；?、尿素、硫脲、磺?；?、磺酸酯、磺酰胺基、磺酰基氨基或磺酰氧基； R’在每種情況下獨(dú)立地表示烷基、連接至表面的烷叉基，或連接至表面的酰基； Z在每種情況下獨(dú)立地表示Cl、Br或I；和 n為小于或等于約1500的整數(shù)。
B.溶劑 所述聚合物優(yōu)選為疏水和水不可溶的，并因此溶解于如丁醇、乙醇、甲醇、丁烷，或氯甲烷的有機(jī)溶劑中以施用。聚合物溶液應(yīng)含有有效量的聚合物以在待涂布的表面上制備殺病毒的且可選殺菌的涂層。
C.待涂布的基材和設(shè)備 “涂層”指類似于油漆的任何臨時(shí)的、半永久的或永久的層、覆蓋物或表面。所述涂層應(yīng)具有足夠的厚度以使得涂料施用的表面為殺病毒的且可選殺菌的。
聚合物溶液能施用至多種基材以形成涂層。合適的基材包括，例如，金屬、陶瓷、聚合體，和天然纖維和合成纖維。物體表面能用聚合涂料涂布以形成具有殺病毒和可選殺菌性能的涂層，所述聚合涂料由含有有效量的疏水、水不可溶的聚合物聚合物的聚合物溶液形成。
涂料能施用至需要是殺病毒的和可選殺菌的任何材料或物體的表面。通常，需要是殺病毒的和可選殺菌的物體包括個(gè)人操作的物體或與個(gè)人接觸的物體。
待涂布的物體包括但不限于家庭用品，包括兒童玩具、浴室裝置、臺(tái)面和桌面、手柄、電腦、衣服、紙產(chǎn)品、窗戶、門(mén)或內(nèi)墻。
在另一具體實(shí)施方案中，待涂布的表面為軍事裝備的物體表面。
涂層也可用于農(nóng)業(yè)環(huán)境中，包括動(dòng)物飼養(yǎng)和灌溉設(shè)備，和加工設(shè)備。例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于雞飼養(yǎng)或加工的設(shè)備的涂層可用于抑制禽流感的傳播。
待涂布的其他合適的表面包括用于醫(yī)療環(huán)境的物體的表面，其包括但不限于紙巾、植入物、繃帶或創(chuàng)傷敷料、手術(shù)簾或醫(yī)療設(shè)備。
“敷料”指施用至損傷或其它情況的用于預(yù)防或治療感染的任何繃帶或覆蓋物。例子包括用于慢性創(chuàng)傷(如壓瘡、靜脈阻塞性潰瘍和燒傷)或急性創(chuàng)傷的創(chuàng)傷敷料，和經(jīng)皮設(shè)備(如IV或鎖骨下血管)上的以旨在降低由于微生物入侵造成的血管敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)的敷料。例如，組合物可施用至經(jīng)皮穿刺位點(diǎn)，或可摻入直接在進(jìn)入位點(diǎn)施用的粘附敷料材料中。
“植入物”為旨在置入人體內(nèi)的非活組織的任何物體。植入物包括天然衍生的物體，其已被處理使得它們的活組織死亡。舉例來(lái)說(shuō)，能處理骨移植物除去它們的活細(xì)胞，但保持它們的形狀以充當(dāng)患者骨生長(zhǎng)的型板。再舉例來(lái)說(shuō)，能處理天然存在的珊瑚產(chǎn)生為特定整形外科和牙科治療而施用至體內(nèi)的羥磷灰石制劑。植入物也可為包含人工組分的制品。術(shù)語(yǔ)“植入物”適用于整個(gè)旨在置于人體內(nèi)的醫(yī)療設(shè)備。
“醫(yī)療設(shè)備”指插入或植入接受者或施用至接受者表面的非天然存在的物體。醫(yī)療設(shè)備能由多種生物相容的材料制得，包括通常不會(huì)在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的金屬、陶瓷、聚合物、凝膠和液體。醫(yī)療設(shè)備包括侵入性手術(shù)、治療或診斷過(guò)程中使用的手術(shù)刀、針、剪刀和其他器械；可植入醫(yī)療設(shè)備，包括人工血管、導(dǎo)管和其他用于將液體從患者體內(nèi)去除或傳遞至患者體內(nèi)的設(shè)備、人工心臟、人工腎、骨科針、托基(plate)和植入物；導(dǎo)管和其他管(包括導(dǎo)尿管和膽道管、氣管內(nèi)管、外周可插入中心靜脈導(dǎo)管、透析導(dǎo)管、長(zhǎng)期埋入式中心靜脈導(dǎo)管外周靜脈導(dǎo)管、短期中心靜脈導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管、肺導(dǎo)管、漂浮導(dǎo)管(Swan-Ganzcatheter)、導(dǎo)尿管、腹膜導(dǎo)管)、導(dǎo)尿設(shè)備(包括長(zhǎng)期導(dǎo)尿設(shè)備、組織結(jié)合導(dǎo)尿設(shè)備、人工尿道括約肌、尿道擴(kuò)張器)、分流器(包括心室或動(dòng)-靜脈分流器)；假體(包括乳房假體、陰莖假體、血管移植假體、心臟瓣膜、人工關(guān)節(jié)、人工喉、耳蝸植入物)、血管導(dǎo)管口、創(chuàng)口引流管、腦積水分流器、起搏器和可植入除顫器等。其他例子對(duì)于本領(lǐng)域從業(yè)者是顯而易見(jiàn)的。
在醫(yī)療環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的表面也包括醫(yī)療裝置件的內(nèi)面和外面、在保健護(hù)理機(jī)構(gòu)中的人員穿著或攜帶的醫(yī)療裝備。這種表面能包括用于醫(yī)療步驟或用于準(zhǔn)備在呼吸治療(包括氧的施用、在噴霧器中溶解的藥物的施用和麻醉劑的施用)中所用的醫(yī)療裝置、管和罐的區(qū)域內(nèi)的臺(tái)面和裝置。也包括那些旨在在醫(yī)療環(huán)境中用作針對(duì)感染生物體的生物阻擋層的表面，如手套、圍裙和面罩。其他這種表面能包括不要求旨在無(wú)菌的醫(yī)療或牙科設(shè)備的手柄和電纜。此外，這種表面能包括那些在通常遇到血液或體液或其他危險(xiǎn)生物材料的區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的管和其他裝置的非無(wú)菌外表面。
可涂布與液體接觸的表面，這些與液體接觸的表面包括用于將加濕的氧氣傳輸至患者的容器和管以及牙科治療機(jī)的水管。
與健康相關(guān)的其他表面包括那些在水的純化、水的儲(chǔ)存和水的傳輸中涉及的物品以及那些在食物加工中涉及的物品的內(nèi)面和外面。與健康相關(guān)的表面能也包括那些在提供營(yíng)養(yǎng)、衛(wèi)生或疾病預(yù)防中涉及的家庭用品的內(nèi)面和外面。例子能包括家用食物加工設(shè)備、照料嬰兒使用的材料、棉球和馬桶缸。
聚合物涂料也能摻入膠劑、接合劑或粘合劑中，或摻入用于在體內(nèi)使結(jié)構(gòu)固定或?qū)⒅踩胛镎辰Y(jié)至身體結(jié)構(gòu)的其他材料中。例子包括用于在體內(nèi)添加整形外科和牙科假體的聚甲基丙烯酸甲酯和其相關(guān)化合物。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，能將化合物施用至或摻入旨在永久保留在位置上以代替或恢復(fù)重要功能的特定醫(yī)療設(shè)備上，如心室心房、腦室腹膜和透析分流器，和心臟瓣膜。
能涂布的其他醫(yī)療設(shè)備包括起搏器和人工可植入除顫儀、輸液泵、血管移植假體、支架、縫合材料和外科絲網(wǎng)。
能涂布旨在將使身體部位的結(jié)構(gòu)恢復(fù)穩(wěn)定性的可植入裝置。例子包括用于代替骨或關(guān)節(jié)或牙齒的可植入裝置。
某些可植入設(shè)備旨在用于化妝品或整形應(yīng)用中的恢復(fù)或增強(qiáng)身體的外形。例子包括乳房假體、用于顱面外科整形的植入物和組織擴(kuò)張器。
可插入設(shè)備包括那些由合成材料制得的施用至身體或通過(guò)天然或人工進(jìn)入位點(diǎn)部分插入體內(nèi)的物體。施用至身體的物品的例子包括隱形眼鏡、造口器具、人工喉、氣管內(nèi)和氣管管、胃造口管、膽管引流管和導(dǎo)管。可涂布的導(dǎo)管的一些例子包括腹膜透析管、導(dǎo)尿管、腎造口管和恥骨弓上管。存在的可涂布的其他導(dǎo)管類裝置包括外科引流管、胸管和輸血管(hemovac)。
可涂布敷料材料和用于將敷料粘結(jié)至皮膚的膠劑或粘合劑。
上述這些例子用于說(shuō)明化合物應(yīng)用的多樣性。其他例子易于由這些領(lǐng)域的技術(shù)人員所預(yù)想。上述給出的例子代表具體實(shí)施方案，其中將技術(shù)理解為可應(yīng)用的。其他具體實(shí)施方案對(duì)于這些和相關(guān)領(lǐng)域的從業(yè)者而言是顯而易見(jiàn)的。具體實(shí)施方案可適合于結(jié)合目前采用的殺菌劑治療方案以增強(qiáng)它們的抗菌效力或成本有效的使用。負(fù)載化合物的適當(dāng)載體的選擇由特定使用的特性確定。
II.應(yīng)用和使用方法 通常將聚合物涂料通過(guò)如下方式施用至待涂布的表面將聚合物溶解在適當(dāng)?shù)?，?yōu)選有機(jī)溶劑中，然后通過(guò)噴霧、刷涂、浸漬、涂敷或其他類似技術(shù)施用。涂料沉積在表面上并通過(guò)非共價(jià)相互作用與表面結(jié)合。
在一些具體實(shí)施方案中，所述表面可用適當(dāng)?shù)娜芤夯驊腋∫侯A(yù)處理以使表面的性能改性，并由此增強(qiáng)改性表面和涂料之間的非共價(jià)相互作用。
在適當(dāng)溫度下和足夠的時(shí)間段內(nèi)，將聚合物溶液施用至表面以在表面形成涂層，其中所述涂層對(duì)形成殺病毒和可選殺菌的表面是有效的。通常的溫度包括室溫，盡管也可使用更高的溫度。通常的時(shí)間段包括5分鐘或更短、30分鐘或更短、60分鐘或更短，和120分鐘或更短。在一些具體實(shí)施方案中，能施用溶液120分鐘或更長(zhǎng)以形成具有所需殺病毒活性的涂層。然而，優(yōu)選使用較短時(shí)間段。
所述涂料以有效量施用以形成殺病毒涂層。本文所用的術(shù)語(yǔ)“殺病毒”指當(dāng)水性病毒懸浮液或氣溶膠在室溫下施用一段時(shí)間時(shí)，如實(shí)施例所說(shuō)明，聚合物涂層引起表面上存在的活性病毒含量的大幅降低，優(yōu)選至少1對(duì)數(shù)殺滅，優(yōu)選至少2對(duì)數(shù)殺滅。在更優(yōu)選的應(yīng)用中，存在至少3對(duì)數(shù)殺滅，最優(yōu)選4對(duì)數(shù)殺滅。盡管通常期望100％殺滅，但其一般并無(wú)必要的。優(yōu)選地，失活病毒為有包膜病毒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，施用所述涂料以使流感病毒失活。
流感A病毒是普遍存在和潛伏的人的病原體，其每年感染數(shù)千萬(wàn)人。特別麻煩的是，當(dāng)人類對(duì)其不具有免疫力的新的可能是禽流感病毒毒株變得對(duì)人類具有感染性時(shí)，有可能發(fā)生另一流感大流行。
流感病毒主要通過(guò)咳嗽或打噴嚏時(shí)產(chǎn)生的液滴以人傳人的方式傳播。然而，在病毒傳遞至粘膜表面之前，當(dāng)人觸摸停留在物體之上的呼吸液滴時(shí)，病毒也能傳遞。若物體能使流感病毒失活，這種感染傳遞方式將中斷。
組合物和其制造和使用方法可通過(guò)參考如下非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步理解。
實(shí)施例 實(shí)施例1聚合涂料的制備和試驗(yàn) 材料和方法 市售化學(xué)品。分支的聚乙烯亞胺(PEI，Mw值為750、25和2千道爾頓)、聚(2-乙基-2-唑啉)(Mw值為500、50和5千道爾頓)、有機(jī)溶劑，和所有的低分子量化學(xué)品均購(gòu)自Sigma Aldrich Chemical Co.并未進(jìn)一步純化而使用。
細(xì)菌和培養(yǎng)基。采用的菌株為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 33807)和大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli基因貯存中心，CGSC4401)。酵母葡萄糖肉湯培養(yǎng)基含有(每升去離子水)10克蛋白胨、8克牛肉提取物、5克NaCl、5克葡萄糖，和3克酵母提取物(Lüscher-Mattli M(2000)Arch Virol 1452233-2248)。磷酸緩沖鹽(PBS)是每升去離子水中含有8.2克NaCl和1.2克NaH2PO4·H2O。用1N水制NaOH將PBS溶液的pH調(diào)節(jié)至7.0。所述兩個(gè)溶液在使用之前高壓滅菌20分鐘。
細(xì)胞和病毒。MDCK細(xì)胞得自ATCC。MDCK細(xì)胞在37℃下在加濕空氣(5％CO2/95％空氣)中在補(bǔ)加10％熱滅活胎牛血清(GIRGO614)、100U/ml青霉素G、100微克/毫升鏈霉素，和2毫摩爾/升L-谷氨酸的Dulbecco’s modified Eagle’s(DME-Hepes)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
空斑純化(Plaque-purified)的流感A/WSN/33(H1N1)株在融合的單層MDCK細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，通過(guò)在室溫下用WSN以0.001的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染MDCK細(xì)胞1小時(shí)而實(shí)現(xiàn)。然后將病毒在37℃下在加濕空氣(5％CO2/95％空氣)中用含有0.3％BSA的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(E4GH)培養(yǎng)2天。從感染培養(yǎng)物中收集上清液，并將病毒儲(chǔ)存于-80℃。通過(guò)在MDCK細(xì)胞中的空斑形成試驗(yàn)分析其滴度(Cunliffe等人(1999)Appl Environ Microbiol 654995-5002)。流感A/Victoria/3/75(H3N2)株得自查爾斯河實(shí)驗(yàn)室。A/Wuhan/359/95(H3N2)樣野生型流感病毒及其在神經(jīng)氨酸酶中帶有Glu 119Val突變的抗奧塞米韋變種；A/turkey/Minnesota/833/80(H4N2)野生型；和三種抗神經(jīng)氨酸酶抑制劑的變種(Glu119Asp、Glu119Gly和Arg292Lys)得自美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(“CDC”)。
合成。合成分支的N，N，-十二烷基，甲基-PEI(1a、1b和1c)(圖1A)(由Mw分別為750、25和2千道爾頓的分支的PEI制得(圖1))，并根據(jù)Park等人(2006)Biotechnol Progr 22584-589所述進(jìn)行鑒定。
長(zhǎng)線性N，N，-十二烷基，甲基-PEI(2a)(圖1A)(得自217千道爾頓的線性PEI)通過(guò)最初完全去酰基的市售聚(2-乙基-2-唑啉)根據(jù)在前所述(Ge等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA 1002718-2723)制得。將所得的質(zhì)子化PEI溶解于水中，并用過(guò)量的水性KOH中和以使聚合物沉淀。后者通過(guò)過(guò)濾分離，用去離子水洗滌直至pH變?yōu)橹行?，并真空干燥。產(chǎn)率1.25克(97％)。1H NMR(CDCl3)δ＝2.72(s，4H，NCH2CH2N)，1.71(s，1H，NH)(這里和此后的NMR譜使用VarianMercury 300-MHz NMR波譜儀記錄)。接著，將制得的2.0克(47毫摩爾單體單元)PEI溶解于25毫升叔戊醇，然后加入7.7克(57毫摩爾)K2CO3和33毫升(134毫摩爾)1-溴代十二烷，并在95℃下攪拌96小時(shí)。在通過(guò)減壓過(guò)濾除去固體之后，加入5.5毫升碘甲烷，然后在密封燒瓶-冷凝器體系中在60℃下攪拌24小時(shí)。將所得溶液加入過(guò)量的乙酸乙酯；形成的沉淀通過(guò)減壓過(guò)濾回收，用過(guò)量的乙酸乙酯洗滌，并在室溫(r.t.)下真空干燥過(guò)夜。產(chǎn)率7.0克。2a的1H NMR(CDCl3)δ＝5.5-3.0(NCH2CH2(CH2)9CH3，NCH2CH2N，NCH3)，1.80(NCH2CH2(CH2)9CH3)，1.6-1.0(NCH2CH2(CH2)9CH3)，0.88(NCH2CH2(CH2)9CH3)。
分別來(lái)自線性21.7千道爾頓和2.17千道爾頓PEI的聚陽(yáng)離子2b和2c(圖1B)如上述段落所述合成，除了在N-甲基化之后將反應(yīng)混合物傾入甲醇中以獲得最終產(chǎn)物之外。2b的1H NMR(CDCl3)δ＝5.5-3.0(NCH2CH2(CH2)9CH3，NCH2CH2N，NCH3)，1.83(NCH2CH2(CH2)9CH3)，1.6-1.0(NCH2CH2(CH2)9CH3)，0.88(NCH2CH2(CH2)9CH3)；對(duì)于2cδ＝5.5-3.0(NCH2CH2(CH2)9CH3，NCH2CH2N，NCH3)，1.83(NCH2CH2(CH2)9CH3)，1.6-1.0(NCH2CH2(CH2)9CH3)，0.88(NCH2CH2(CH2)9CH3)。
N，N-十二烷基，甲基-PEI(3)(圖1B)類似于2，由線性217千道爾頓PEI合成，除了用1-溴代二十二烷代替1-溴代十二烷作為烷基化試劑之外。1H NMR(CDCl3)δ＝5.5-3.0(NCH2CH2(CH2)19CH3，NCH2CH2N，NCH3)，1.85(NCH2CH2(CH2)19CH3)，1.6-1.0(NCH2CH2(CH2)19CH3)，0.88(NCH2CH2(CH2)19CH3)。
N-(15-羧基十五烷基)-PEI(4)(圖1B)HCl鹽通過(guò)如下方式合成將86毫克(以單體計(jì)2毫摩爾)線性217千道爾頓PEI和670毫克(2毫摩爾)16-溴代十六酸溶解于10毫升叔戊醇，然后加入0.61克(4.4毫摩爾)K2CO3并在95℃下攪拌反應(yīng)混合物96小時(shí)。在冷卻至室溫之后，將反應(yīng)混合物傾入100毫升丙酮并過(guò)濾。將濾餅懸浮于30毫升CH2Cl2并用30毫升1N HCl攪拌2小時(shí)。分離并過(guò)濾有機(jī)相(含有未溶解的固體)，所得的固體殘留物用CH2Cl2洗滌并真空干燥。然后將產(chǎn)物溶解于50毫升CHCl3并用40毫升1N HCl攪拌3小時(shí)，然后分離有機(jī)相并蒸發(fā)溶劑。得到4的鹽(圖1B)為淺黃色固體；產(chǎn)率0.39克。1H NMR(DMSO-d6)δ＝4.0-2.8(NCH2CH2N，NCH2(CH2)14CO2H)，2.17(CH2CO2H)，1.8-1.4(CH2CH2CO2H，NCH2CH2(CH2)13CO2H)，1.4-1.1(NCH2CH2(CH2)11CH2CH2CO2H)。
N-(11-羧基十一?；?-PEI(5)(圖1B)。將十二烷二酸(4.6克，20毫摩爾)懸浮于100毫升干燥CH2Cl2中，然后加入2.16克(20毫摩爾)苯甲醇、催化量的4-(二甲基氨基)吡啶，和4.12克(20毫摩爾)1，3-二環(huán)己基碳二亞胺。在室溫(“r.t.”)下攪拌混合物48小時(shí)之后，通過(guò)過(guò)濾除去固體，并用60毫升1N HCl洗滌濾液。有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥，然后減壓蒸發(fā)溶劑。硅膠柱層析(2∶3(體積/體積)乙酸乙酯/己烷為流動(dòng)相)得到1.5克(24％產(chǎn)率)十二烷二酸單芐酯。1HNMR譜圖(CDCl3)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)(Thomas等人(2005)Proc Natl AcadSci USA 1025679-5684)一致。然后將1.28克(5.2毫摩爾)該產(chǎn)物溶解于10毫升干燥CH2Cl2，然后加入0.66克(5.2毫摩爾)草酰氯和一滴N，N-二甲基甲酰胺。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)之后，在真空下除去溶劑和過(guò)量的草酰氯以得到用于下一步的相應(yīng)的碳酰氯而無(wú)需進(jìn)一步的純化。
將線性217千道爾頓PEI(86毫克，以單體計(jì)2毫摩爾)和N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)(0.52克，4毫摩爾)溶解于10毫升CH2Cl2，并使用冰水浴冷激反應(yīng)混合物至0℃。將在10毫升干燥CH2Cl2中的上述制得的碳酰氯逐滴加入至該溶液，移去冰水浴，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)。反應(yīng)用2毫升甲醇淬滅，并蒸發(fā)溶劑。所得的殘留物用5份30毫升的甲醇洗滌以除去可溶組分并真空干燥得到N-[(11-芐氧羰基)十一酰]-PEI為白色固體(0.6克，87％)。1H NMR(CDCl3)δ＝7.34(m，5H，C6H5)，5.10(S，2H，C6H5CH2)，3.43(s，4H，NCH2CH2N)，2.33(m，4H，CH2CO)，1.60(m，4H，CH2CH2CO)，1.26(s，12H，OCCH2CH2(CH2)6CH2CH2CO)。最后，將60毫克(以單體計(jì)0.174毫摩爾)該化合物溶解于1毫升THF，并通過(guò)加入0.5毫升1N NaOH和在室溫下攪拌24小時(shí)脫保護(hù)。溶液用0.2毫升2N HCl中和，并除去溶劑得到固體殘留物，該固體殘留物首先用水洗滌以除去NaCl，然后用CHCl3洗滌以除去芐醇。產(chǎn)率40毫克(90％)。5的1H NMR(CD3OD)δ＝3.43(s，4H，NCH2CH2N)，2.40-2.10(m，4H，CH2CO)，1.55(m，4H，CH2CH2CO)，1.26(s，12H，OCCH2CH2(CH2)6CH2CH2CO)。
N-(十一酰)-PEI(6)(圖1B)通過(guò)如下方式合成將1.08克(以單體計(jì)25毫摩爾)217千道爾頓線性PEI溶解于100毫升氯仿，加入6.46克(50毫摩爾)DIPEA。使用冰水浴將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，并在30分鐘內(nèi)逐滴加入11.2克(50毫摩爾)月桂酰氯。然后移去冰水浴，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)。在減壓下除去一半溶劑，然后將剩余溶液傾入350毫升甲醇中。靜置過(guò)夜之后，固體通過(guò)過(guò)濾分離并用5份50毫升甲醇洗滌。產(chǎn)率4.87克(86％)。6的1H NMR(CDCl3)δ＝3.43(s，4H，NCH2CH2N)，2.28(d，2H，COCH2)，1.59(s，2H，COCH2CH2)，1.4-1.2(br s，16H，(CH2)8CH3)，0.88(t，3H，CH3) 涂敷片的制備。將涂料聚合物在振蕩下溶解(50毫克/毫升)于如下溶劑中對(duì)于1a-c(圖1A)和2a-c(圖1B)丁醇，對(duì)于3氯仿，對(duì)于4熱乙醇，對(duì)于5甲醇-二氯甲烷(1∶1)(圖1B)，且對(duì)于6二氯甲烷(圖1B)。將市售玻(VWR顯微鏡)片(對(duì)于殺菌試驗(yàn)2.5厘米×7.5厘米，對(duì)于殺病毒試驗(yàn)2.5厘米×2.5厘米)用這些溶液之一使用棉簽刷涂，然后空氣干燥。
殺菌效率測(cè)定。將100微升S.aureus或E.coli在0.1摩爾/升PBS中的懸浮液(大約1011細(xì)胞/毫升)加入50毫升無(wú)菌離心管中的20毫升酵母葡萄糖培育基中，然后在37℃下以200rpm搖動(dòng)過(guò)夜(Innova4200孵育搖床，New Brunswick Scientific)。通過(guò)在6,000rpm下離心10分鐘(Sorvall RC-5B，DuPont Instruments)收集細(xì)菌細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，并稀釋至5×106細(xì)胞/毫升(S.aureus)和3×107細(xì)胞/毫升(E.coli)。在通風(fēng)櫥中將細(xì)菌的PBS懸浮液以大約10毫升/分鐘的速率噴霧至玻片上。在空氣中室溫干燥2分鐘之后，將所得玻片置入培養(yǎng)皿并立即用一層固體培養(yǎng)瓊脂層覆蓋(在酵母葡萄糖培育基中含1.5％瓊脂，高壓滅菌，傾入培養(yǎng)皿，并在室溫下過(guò)夜形成凝膠)。將培養(yǎng)皿密封并在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，在光箱(light box)上計(jì)數(shù)玻片表面生長(zhǎng)的細(xì)菌群體。
雞蛋中病毒的制備。將100微升等份10倍稀釋的病毒溶液(CDC樣品)注入十日齡孵化雞蛋的尿囊液中。該雞蛋隨后在37℃下孵育48小時(shí)，然后置于4℃24小時(shí)。收集尿囊液并在4℃下以1,200rpm離心20分鐘，然后使上清液通過(guò)0.45微米的注射器過(guò)濾器(低蛋白質(zhì)結(jié)合)。將上清液在-80℃下儲(chǔ)存。病毒滴度通過(guò)如下描述的空斑試驗(yàn)確定病毒滴度。
空斑試驗(yàn)。將六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的融合的MDCK細(xì)胞用5毫升PBS洗滌兩次，并在室溫下用200微升在磷酸緩沖鹽(PBS)中的病毒溶液感染1小時(shí)。然后該溶液吸去，將細(xì)胞用2毫升空斑培養(yǎng)基覆蓋(空斑培養(yǎng)基為加入139微升0.01％DEAE-葡聚糖、277微升5％NaHCO3、139微升(100U/ml)青霉素G、100微克/毫升鏈霉素、122微升胰蛋白酶-EDTA，和4.2毫升2.0％瓊脂(Oxoid Co.，純化瓊脂，L28)的6.9毫升2×F12培養(yǎng)基)。在37℃下加濕空氣(5％CO2/95％空氣)中孵育3天之后，在室溫下將細(xì)胞用1％水性甲醛固定1小時(shí)。除去覆蓋的瓊脂，并在室溫下用在20％(體積/體積)水性甲醇中的0.1％結(jié)晶紫(Crystal Violet)將細(xì)胞染色2分鐘。吸去過(guò)量的染料之后，計(jì)數(shù)空斑。
殺病毒活性。將涂布有聚合物的玻片(或在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中不涂布)置入聚苯乙烯培養(yǎng)皿(6.0厘米×1.5厘米)中，然后將在磷酸緩沖鹽(PBS)中的105-107空斑形成單位/毫升病毒溶液的10微升液滴滴在玻片的中心。將第二片未涂布的玻片放在上部并按壓以在玻片之間鋪展所述液滴。通常在室溫下將該“三明治”體系孵育5分鐘。然后抬起上部玻片的一邊，用0.99毫升PBS徹底洗滌兩個(gè)玻片的暴露于病毒的一面。最后，進(jìn)行空斑試驗(yàn)以確定涂布片的洗滌溶液和它們的兩倍系列稀釋(5次)的殺病毒活性。洗滌溶液再進(jìn)行100倍至200倍的稀釋，然后進(jìn)行2倍系列稀釋(5次)以進(jìn)行未涂布片(對(duì)照實(shí)驗(yàn))的空斑試驗(yàn)。
非浸出試驗(yàn)。No.1將涂布有聚合物的玻片(或在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的空白玻片)倒置于含有2毫升PBS的六孔板的孔中，并在室溫，定期振蕩下孵育2小時(shí)。然后吸出0.99毫升溶液，與10微升病毒溶液[(1.4±0.1)×107空斑形成單位/毫升的WSN]混合，并在室溫下孵育30分鐘。
在200倍稀釋和隨后的2倍系列稀釋(5次)之后，如上所述進(jìn)行空斑試驗(yàn)。
No.2通過(guò)振蕩5分鐘將200毫克純的固體聚合物分散于1毫升PBS中，并將其在室溫下孵育16小時(shí)，然后在9,000rpm下離心(VWRScientific Products，Galaxy 7)30分鐘，三次，然后通過(guò)玻璃棉以獲得澄清溶液。然后將0.39毫升該溶液與10微升病毒溶液[(8.7±1.4)×106空斑形成單位/毫升的WSN]混合，并在室溫下孵育30分鐘。在300倍稀釋和隨后的2倍系列稀釋(5次)之后，如上所述進(jìn)行空斑試驗(yàn)。
結(jié)果 為模擬含有流感病毒的氣溶膠化的水性液滴停在表面，然后病毒擴(kuò)散(Wright等人(2001)Fields Virology，第4版，eds.Knipe DM，Howley PM(Lippincott，Philadelphia，PA)，第1533-1579頁(yè))，使用如下方法。將含有1.6±0.3)×103空斑形成單位(pfu)的流感病毒的A/WSN/33(H1N1)株的PBS緩沖溶液的10微升液滴滴在2.5厘米×2.5厘米玻片(涂布或空白對(duì)照)的中心。然后將相同尺寸的另一純玻片置于上面并相對(duì)第一玻片按壓以使液滴變平。在室溫下孵育30分鐘之后(除非另外提及)，抬起上片的一邊并用1.99毫升水性PBS徹底洗滌兩個(gè)病毒暴露玻璃表面。用相同的緩沖液將所得洗滌溶液進(jìn)行5次連續(xù)的2倍稀釋，并將每一200微升等份未稀釋和系列稀釋的樣品加入六孔板的孔中，該六孔板用單層Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞覆蓋。孵育1小時(shí)之后，除去溶液，并將2毫升空斑培養(yǎng)基置于每一孔中，然后在加濕空氣中在37℃下孵育3天。最后，細(xì)胞用甲醛固定，染色，然后除去瓊脂覆層，并計(jì)數(shù)空斑。
當(dāng)該程序應(yīng)用于未涂布片時(shí)，在洗滌溶液中存活病毒的濃度僅相比于相等稀釋的未暴露于玻片的液滴發(fā)生變化分別為650±150比800±150空斑形成單位/毫升。因此，與對(duì)照玻片的這種接觸未導(dǎo)致病毒滴度的統(tǒng)計(jì)上的顯著降低，即在室溫下，該培養(yǎng)中流感病毒在兩個(gè)空白玻片之間存活而基本上未受損失。
接著，用在丁醇中的溶液中的分支的N，N-十二烷基，甲基-PEI(1a)(通過(guò)將分支的750千道爾頓PEI的季胺化合成，如圖1所示)涂敷玻片，然后使溶劑蒸發(fā)。當(dāng)用該涂布片進(jìn)行前述試驗(yàn)時(shí)，即使使用未稀釋的洗滌溶液也未檢測(cè)到一個(gè)空斑。為了進(jìn)一步定量這一明顯的100％殺病毒活性，用更高的初始病毒滴度以及更低的稀釋進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。盡管敏感度和檢測(cè)范圍更大，仍未觀察到空斑，說(shuō)明將病毒暴露于涂布片30分鐘使其滴度降低至少約10,000倍(即4對(duì)數(shù))。
當(dāng)使用低于750千道爾頓分子量的PEI前體，也就是25千道爾頓和2千道爾頓(圖1A)制備疏水聚陽(yáng)離子型涂料(圖1A，分別為1b和1c，)時(shí)，觀察到分別為98±0.4％和97±0.2％的極高但略微不完全的殺病毒效率。值得一提的是，在之前也發(fā)現(xiàn)用這些較小N-烷基化PEI衍生物涂敷的玻片具有不完全的殺菌效率(Park等人(2006)Biotechnol.Progr.，22584-589)。因此，如同細(xì)菌的情況，聚陽(yáng)離子必須足夠大，可能從而允許它們的“觸須(tentacle)”滲透并損壞病毒的脂質(zhì)包膜。
由于簡(jiǎn)單的位阻原因，用分支聚陽(yáng)離子的線性對(duì)應(yīng)物代替分支聚陽(yáng)離子，將減輕鏈長(zhǎng)限制。為了證實(shí)該假設(shè)，試驗(yàn)了分別由217千道爾頓、21.7千道爾頓和2.17千道爾頓的線性PEI前體合成的三種線性N，N-十二烷基，甲基-PEI-2a、2b和2c(圖1B)的殺病毒性能。涂布所有這些線性疏水聚陽(yáng)離子的玻片確實(shí)以100％的效率使流感病毒失活。而且，2a(如同1a)顯示降低病毒滴度至少約4對(duì)數(shù)；在大多數(shù)隨后的實(shí)驗(yàn)中使用2a。
為了進(jìn)一步研究聚陽(yáng)離子的疏水性在殺病毒作用中的影響，我們通過(guò)用二十二烷基(C22)而非十二烷基(C12)溴化物將線性217千道爾頓PEI烷基化，增加了聚陽(yáng)離子的疏水性(圖1)。涂布有所得3的玻片(圖1B)如同涂布有1a(圖1A)或2a-c(圖1B)的玻片一樣對(duì)流感病毒是完全致命的。
為了確定我們的實(shí)驗(yàn)體系中的殺病毒作用有多快，涂布有2a的玻片(圖1B)暴露于流感病毒的時(shí)間由1分鐘變化至2小時(shí)。如圖2可見(jiàn)，盡管不是在1或2分鐘之后，但在短至5分鐘之后已實(shí)現(xiàn)100％殺病毒效率，這可能反映了存在的所有病毒粒子到達(dá)涂布表面所需的時(shí)間。
迄今檢驗(yàn)的所有涂布的涂料均為聚陽(yáng)離子的。為了確定電荷的作用，合成線性217千道爾頓PEI的衍生物，所述衍生物稱為兩親性離子型(4)、陰離子型(5)，和靜電中性型(6)，并具有與1和2中大概類似的側(cè)鏈(圖1)。如表1所示(第二欄)，兩親性離子型4，如同陽(yáng)離子型1a和2a(以及2b-c和3，見(jiàn)上文)在暴露30分鐘之后是100％殺病毒的。相反，陰離子型5(圖1B)僅部分殺病毒，而中性型6(圖1B)完全不殺病毒。中性型6不能殺病毒大概是由于缺乏單獨(dú)伸出的“觸須”，所述“觸須”在明顯地缺乏電荷時(shí)會(huì)彼此之間強(qiáng)烈疏水化結(jié)合。聚陰離子涂料顯著使流感病毒失活說(shuō)明正電荷和負(fù)電荷位點(diǎn)均進(jìn)攻病毒膜；由于2a-c(圖1B)和甚至4(圖1B)殺病毒優(yōu)于5(圖1B)，負(fù)電荷位點(diǎn)顯得突出。
表1.以1a、2a、4、5和6涂敷的玻片的殺微生物活性。

a殺病毒活性通過(guò)抗流感病毒的WSN株檢測(cè)。
b在這些實(shí)驗(yàn)中，將所用的玻片涂敷兩次或兩次以上以獲得所指的活性的水平(可能反映了我們涂敷程序的不完善)。
用分支的或線性的N，N-十二烷基，甲基-PEI和某些其他疏水PEI衍生物涂敷玻片，使得該玻片能夠在數(shù)分鐘內(nèi)以基本上100％的效率(病毒滴度降低至少4對(duì)數(shù))殺滅流感病毒，以及空氣中的人類病原菌大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。對(duì)于大多數(shù)涂料聚離子，該殺病毒作用顯示為在接觸時(shí)，即完全通過(guò)錨定在玻片表面的聚合鏈殺病毒；對(duì)于其他的涂料聚離子，從涂敷表面浸出的聚離子的貢獻(xiàn)不能排除。已闡明衍生化PEI的結(jié)構(gòu)與涂敷表面的所得的殺病毒活性之間的關(guān)系。
為了獲得對(duì)這些觀察的進(jìn)一步了解，檢測(cè)了涂布有4和5的玻片(圖1B)的殺病毒活性的時(shí)程。兩親性離子4不僅如同陽(yáng)離子型2a(圖1B)一樣在孵育30分鐘之后已使全部暴露的流感病毒失活，而且甚至在僅5分鐘之后，兩親性離子4的殺病毒活性高至98±0.7％(圖3)。陰離子型5的殺病毒活性隨時(shí)間穩(wěn)步增加(在圖3中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的最后一條)直至在暴露2小時(shí)之后達(dá)到89±7％。因此，聚合涂料之間殺病毒活性的差異似乎是動(dòng)力學(xué)事件而非最后的程度，即疏水性聚陽(yáng)離子僅僅比其他疏水聚離子更快地使病毒失活。
將在涂布的和空白玻片之間擠壓的10微升水性液滴的浸出條件如下進(jìn)行評(píng)估將涂布片倒置放入含有2毫升PBS緩沖溶液的六孔板的孔中并孵育2小時(shí)(在本研究中采用最長(zhǎng)暴露，例如，參見(jiàn)圖3)同時(shí)定期搖動(dòng)以促進(jìn)物質(zhì)傳遞。然后將10微升流感病毒溶液加入0.99毫升該溶液，然后在室溫下孵育30分鐘，適當(dāng)稀釋，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)。在統(tǒng)計(jì)上不能區(qū)分所測(cè)得的涂布有1a、1b、2b、3、4、5和6的玻片(圖1)病毒滴度與所測(cè)定的未涂布的經(jīng)受相同步驟的玻片的病毒滴度。相反，當(dāng)聚陽(yáng)離子1c、2a和2c(圖1)用作涂料時(shí)，所獲得的病毒滴度比未涂布片低20％至40％。
在第二組對(duì)照中，滴在玻片表面上的聚合物的可能的浸出程度是增加的。為此，將200毫克純固體聚合物通過(guò)振蕩分散于1毫升水性PBS中，然后在室溫下孵育16小時(shí)，并隨后離心以獲得澄清溶液。將10微升流感病毒溶液加入390微升該溶液，在室溫下孵育30分鐘，適當(dāng)稀釋，然后滴定病毒。即使在此夸張的浸出試驗(yàn)中，1b、2b、3、5和6作為涂料時(shí)(圖1)所得的病毒滴度與當(dāng)使用390微升新鮮水性PBS代替那些公認(rèn)的由聚合物飽和的溶液(以1a、1c、2a、2c和4飽和，病毒滴度低得多)時(shí)所觀察到的病毒滴度在統(tǒng)計(jì)上不能區(qū)分。
基于前述對(duì)照的結(jié)果可得出如下結(jié)論至少對(duì)于涂敷有1a、1b、2b、3、4和5(圖1)的玻片，觀察到的殺病毒活性完全由于保持滴在玻片表面的聚離子，即這些固定了的聚離子的“觸須”在接觸病毒時(shí)使病毒失活。相反，在1c、2a和2c(圖1)涂料的情況中，不能排除浸出的聚陽(yáng)離子對(duì)涂敷片的殺病毒活性的貢獻(xiàn)。
還比較了線性217千道爾頓PEI的不同帶電衍生物對(duì)兩種常見(jiàn)的人類病原菌-革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和革蘭氏陰性大腸桿菌(Escherichia coli)的殺菌活性。涂敷有1a和2a(圖1A)的玻片在接觸時(shí)以100％效率，或以在統(tǒng)計(jì)上與該水平不可區(qū)分的效率殺滅這兩種空氣中細(xì)菌(表1，最后兩欄)。相反，4、5和6(圖1B)涂料僅有限地殺菌(即使第一個(gè)是完全殺病毒的)。
為了確定1和2(圖1)使流感病毒失活的能力的普遍性，將涂料進(jìn)行抗A/維多利亞/3/75(H3N2)的試驗(yàn)，后者是不同于A/WSN/33(H1N1)的毒株。涂敷有1a和2a(圖1)的玻片在暴露于涂布表面30分鐘之后均顯示出98±0.5％的殺病毒活性和在暴露于涂布表面2小時(shí)之后，均顯示出100％的殺病毒活性。因此，盡管維多利亞株似乎比其WSN對(duì)應(yīng)物更有抗性，但給以足夠時(shí)間，1a和2a(圖1)涂料完全使兩者失活。
結(jié)果證明，特定的疏水性聚陽(yáng)離子能被涂敷至表面，從而使得表面不僅是高度殺菌的，而且對(duì)至少兩種不同的流感病毒株和可能的其他有包膜病毒是極度殺病毒的。就其殺病毒和殺菌效率，以及在殺病毒作用方式方面缺乏模糊性而言，用1a涂敷似乎是最佳的。鑒于涂布過(guò)程簡(jiǎn)單，其可應(yīng)用于各種常見(jiàn)材料，由此使得它們能夠中止病毒和細(xì)菌感染的傳播。
也評(píng)估了N，N-十二烷基，甲基-PEI抗人A/Wuhan/359/95(H3N2)樣流感病毒、禽A/turkey/Minnessota/833/80(H4N2)流感病毒及其抗藥變種的抗病毒活性。在使A/turkey/Minnessota/833/80(H4N2)的水溶液暴露于未涂布的玻璃表面5分鐘之后，當(dāng)用200微升200倍稀釋的洗滌溶液感染MDCK細(xì)胞時(shí)，許多空斑清楚可見(jiàn)。相反，當(dāng)使用200微升未稀釋的洗滌溶液(在暴露于涂敷有N，N-十二烷基，甲基-PEI的玻片之后)感染MDCK細(xì)胞時(shí)，未觀察到空斑。該數(shù)據(jù)的定量顯示于表2。
表2描述了病毒溶液暴露于未涂布玻片(對(duì)照實(shí)驗(yàn))或涂敷有N，N-十二烷基，甲基-PEI的玻片5分鐘的結(jié)果。暴露于對(duì)照實(shí)驗(yàn)的玻片在稀釋之后僅略微影響病毒滴度，涂敷有聚陽(yáng)離子的玻片完全使暴露的流感病毒失活，并降低其滴度超過(guò)3,000倍。
表2.涂敷有N，N-十二烷基，甲基-聚乙烯亞胺的玻片的抗人流感AWuhan(H3N2)和禽流感A turkey(H4N2)病毒的野生型株的殺病毒活性

a在暴露5分鐘和用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌(100倍稀釋)之后 盡管已在幾年前商業(yè)上引入兩個(gè)神經(jīng)氨酸酶抑制劑——奧塞米韋和扎那米韋以治療流感A病毒感染，對(duì)所述抑制劑的使用的關(guān)注日益增加的是抗藥病毒株的形成和它們隨后的傳播。實(shí)際上，數(shù)種具有降低的藥物敏感性(susceptibility)的神經(jīng)氨酸酶突變體，Glu119Gly、Glu119Ala、Glu119Asp和Arg292Lys，已通過(guò)在體外使用扎那米韋而被分離。此外，具有降低的藥物敏感性的突變體(Arg152Lys)流感株已從用扎那米韋治療的免疫抑制(immune-compromised)的人體內(nèi)提取。同樣地，造成抗奧塞米韋性的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白(Glu119Val、His274Tyr和Arg292Lys)突變體已在攻擊研究和天然獲得感染的患者中提取。
因此，重要的是確定N，N-十二烷基，甲基-PEI涂布的表面是否能殺滅流感A病毒的抗藥株以及它們的野生型親代株。研究了涂布片對(duì)禽流感病毒A/Turkey/MN/833/80的抗扎那米韋株Glu119Asp的抗病毒活性。在將該病毒株的水溶液暴露于未涂布的玻璃表面5分鐘之后，當(dāng)用200微升200倍稀釋的洗滌溶液感染MDCK細(xì)胞時(shí)，清楚可見(jiàn)許多空斑。相反，在類似地暴露于涂敷有疏水聚陽(yáng)離子的玻片之后，當(dāng)使用200微升甚至未稀釋的洗滌溶液感染MDCK細(xì)胞時(shí)，未觀察到空斑形成。這些數(shù)據(jù)的定量(參見(jiàn)表3)顯示，相比于未涂布表面，由于暴露于聚陽(yáng)離子涂布表面，病毒滴度至少下降100,000倍。

抗扎那米韋的禽病毒的不同神經(jīng)氨酸酶突變體Glu119Gly，以及抗奧塞米韋的人類病毒的Glu119Val神經(jīng)氨酸酶突變體得到類似的結(jié)果(表3中的第二和第三條)。最后，甚至以抗扎那米韋和奧塞米韋的禽流感株(Arg292Lys神經(jīng)氨酸酶突變體)，短時(shí)間暴露于涂敷有N，N-十二烷基，甲基-PEI的表面導(dǎo)致病毒滴度超過(guò)10,000倍的下降(表3中的最后一條)。
本文提及的所有公開(kāi)和專利以全文引入的形式在此并入。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)試驗(yàn)即可識(shí)別或能夠確知本文描述的特定具體實(shí)施方案的等效物。所附權(quán)利要求旨在涵蓋這種等效物。
權(quán)利要求
1、一種殺病毒涂料，其包含沉積在惰性表面上的疏水、水不可溶的聚合物。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述涂料經(jīng)由非共價(jià)相互作用與表面結(jié)合。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述聚合物為線性或分支的聚乙烯亞胺衍生物。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述聚合物為陽(yáng)離子。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述聚合物為陰離子。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述聚合物為兩親性離子。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述聚合物的分子量為至少20千道爾頓，更優(yōu)選至少50千道爾頓，且最優(yōu)選至少100千道爾頓。
8、根據(jù)權(quán)利要求3所述的涂料，其中所述聚合物具有式I的結(jié)構(gòu)
式I。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述聚合物具有選自如下的結(jié)構(gòu)
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中該涂料通過(guò)涂敷、刷涂、浸涂或噴霧被施用至表面。
11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述表面由選自金屬、陶瓷、玻璃、聚合物、塑料或纖維的材料形成。
12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述表面為置入身體或組織的設(shè)備或移植物的表面。
13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述表面為織物、紗布、紙巾、手術(shù)簾、空氣過(guò)濾器、管或手術(shù)器械的表面。
14、根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂料，其中所述表面為玩具、浴室裝置、臺(tái)面、桌面、手柄、電腦、軍事裝備、衣服、紙產(chǎn)品、窗戶、門(mén)或內(nèi)墻的表面。
15、一種殺滅病毒的方法，其包含在表面上提供權(quán)利要求1-9的任意項(xiàng)所述的涂料。
16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述病毒為有包膜病毒。
17、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述病毒為流感病毒。
18、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表面為選自金屬、陶瓷、玻璃、聚合物或纖維的材料的表面。
19、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表面為置入身體或組織的設(shè)備或移植物的表面。
20、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表面為織物、紗布、紙巾、手術(shù)簾、空氣過(guò)濾器、管或手術(shù)器械的表面。
21、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表面為玩具、浴室裝置、臺(tái)面、桌面、手柄、電腦、軍事裝備、衣服、紙產(chǎn)品、窗戶、門(mén)或內(nèi)墻的表面。
全文摘要
本發(fā)明開(kāi)發(fā)出一種殺滅表面的病毒和細(xì)菌的疏水聚合涂料，該疏水聚合涂料能以與油漆相同的方式(例如以刷涂、噴霧或浸涂的方式)非共價(jià)地施用至如金屬、塑料、玻璃、聚合物、織物的固體表面，和其他如纖維、紗布、繃帶、紙巾的基材和其他纖維，從而殺滅表面的病毒和細(xì)菌。
文檔編號(hào)C09D5/14GK101627092SQ200780045356
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者J·哈爾達(dá), D·安, L·阿爾瓦瑞茲德西恩富戈斯, J·陳, A·M·科里伯諾 申請(qǐng)人:麻省理工學(xué)院