專利名稱：高濃度單克隆抗體溶液中的病毒去除方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將存在于高濃度單克隆抗體溶液中的病毒去除的方法以及高濃度單克隆抗體溶液的制造方法。
背景技術(shù)：
由于擔(dān)心在含有通過細(xì)胞培養(yǎng)而制造的單克隆抗體的抗體藥物中有可能會混入原料來源或工序來源的病毒，因而在制造抗體藥物的過程中，需要使病毒失活或者去除病毒。作為使有可能混入抗體藥物中的病毒失活的方法，進行了加熱處理、利用化學(xué)試劑的處理等，但僅靠這些單獨的處理，病毒的失活并不充分，另外在這些方法中抗體藥物中的抗體其本身也有可能變性。由此背景出發(fā)，作為不伴有化學(xué)變性的物理的病毒去除方法，實施利用過濾膜的病毒的分離去除。作為病毒去除用的過濾膜，已知有由纖維素這樣的天然材料形成的膜，或者由聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PEQ這樣的合成高分子材料形成的病毒去除膜(非專利文獻 1 4)。利用裝填有這些病毒去除膜的病毒去除裝置所進行的抗體藥物的過濾，理想的是，能夠在短時間內(nèi)過濾更多量的抗體、且可以具有足夠高的病毒去除性能而將病毒去除。 但是，實際上例如為纖維素膜時，即便是20mg/ml以上的抗體濃度，也難以引起膜的堵塞、 能夠進行過濾，但耐壓性低、只能將實際使用壓力提高至lOOltfa左右?；蛘邽楹铣筛叻肿幽r，雖然耐壓性高、即便將實際使用壓力提高至300kPa左右也沒有問題，但當(dāng)將抗體濃度提高至20mg/ml左右時，則存在引起膜堵塞、無法進行過濾的問題。因而，一般來說進行 10mg/ml以下的低濃度下的過濾。但是，近年來有抗體藥物的制劑濃度提高的傾向，與此同時，在用于去除病毒的過濾工序中對希望提高抗體濃度的要求也逐漸提高。當(dāng)提高單克隆抗體溶液中的抗體濃度時，有單克隆抗體之間容易締合而形成凝聚體的傾向，當(dāng)用病毒去除膜那樣帶有小孔徑的膜進行過濾時，由于過濾所帶來的物理應(yīng)力，單克隆抗體之間的締合變得更為顯著，如上所述病毒去除膜發(fā)生堵塞。特別是，為了從單克隆抗體溶液中以高去除率將細(xì)小病毒這樣直徑18-24nm左右的小病毒去除，需要以細(xì)小病毒去除為對象的孔徑小的病毒去除膜，但利用這種膜過濾高濃度的單克隆抗體溶液時，立即發(fā)生堵塞，具有抗體的回收率顯著降低、過濾所需要的時間變得非常長的問題。雖然不是關(guān)于單克隆抗體的現(xiàn)有技術(shù)，但有現(xiàn)有技術(shù)公開了通過納米過濾從蛋白溶液中將病毒去除的方法，即著眼于纖維蛋白原，將從選自精氨酸、胍、瓜氨酸、尿素及其衍生物及鹽的離液劑(chaotropic)以及選自聚乙氧基山梨糖醇酐酯及其衍生物的化合物中選擇的至少一個成分添加于蛋白溶液中，接著用具有15nm以上且小于35nm的孔徑的病毒去除膜將蛋白溶液過濾(專利文獻1)。專利文獻1中記載了推測前述成分會抑制或者阻止蛋白分子的締合或者分子周邊的水化層的形成，但所指的蛋白質(zhì)是纖維蛋白原、第VIII因子等血液凝固因子。另外，實施例僅是在精氨酸的存在/非存在下對纖維蛋白原溶液的膜透過性進行比較。而且，纖維蛋白原濃度也小于5mg/ml、以低濃度的溶液為對象。纖維蛋白原是在出血時發(fā)生聚合物化而起止血作用的蛋白質(zhì)，是長度接近60nm的紐帶狀的細(xì)長蛋白質(zhì)。與此相對，單克隆抗體是直徑15nm左右的球狀蛋白質(zhì)，是等電點、親水性等物理化學(xué)性質(zhì)也與纖維蛋白原大大不同的蛋白質(zhì)。專利文獻1是關(guān)于纖維蛋白原的發(fā)明，并不是關(guān)于單克隆抗體的技術(shù)、而是關(guān)于作為蛋白質(zhì)完全不同性質(zhì)的技術(shù)，因而在精制單克隆抗體方面并非是可參考的技術(shù)。專利文獻2記載了一種病毒去除方法，其為使用病毒去除膜從可能混有病毒的含有纖維蛋白原的溶液中將病毒去除的方法，其特征在于，在含纖維蛋白原的溶液中含有堿性氨基酸或其鹽類及氯化鈉。專利文獻2也是以纖維蛋白原溶液為對象的用膜將病毒去除的方法，另外，蛋白質(zhì)濃度也低達5 16. 5mg/ml，與本申請目的的高濃度單克隆抗體溶液大大不同。另外，病毒去除膜也使用細(xì)小病毒等小病毒的去除性能低的膜、即小的病毒能夠通過的膜，作為去除對象的病毒也大于本申請的對象，因而是不涉及由于單克隆抗體的凝聚體與膜的關(guān)系而在過濾時存在問題的技術(shù)。單克隆抗體的精制工藝中，使用病毒去除膜時的溶液的條件(pH、離子強度等)有很多，因而抗體和膜的表面的物理化學(xué)特性隨溶液條件而不同。實際上，根據(jù)溶液條件，抗體過濾時有Flux非常低的情況。作為其原因，與抗體表面與膜表面之間的相互作用有關(guān)， 其中在兩者之間起作用的靜電相互作用發(fā)揮影響?？贵w與膜表面的電荷性質(zhì)以表面電位 (ζ電位)來表示，由于溶液的PH與等電點(pi)的相關(guān)性，而變化成正或負(fù)的電位狀態(tài)。 已知單克隆抗體的pi范圍為6 10，在pH < pi的條件下，單克隆抗體具有高的正電位，在膜過濾中不利地發(fā)揮作用。因而認(rèn)為，若緩和抗體的表面電位、抑制與膜的靜電相互作用， 會提高過濾的Flux，但另一方面，在這種溶液條件下，在高濃度的單克隆抗體溶液中，由于抗體本身的電荷所導(dǎo)致的分散穩(wěn)定性變差，因而易于形成凝聚體，存在在膜過濾中會引起經(jīng)時的Flux降低的問題。即，關(guān)于如下方法的現(xiàn)有技術(shù)并不存在通過控制膜與抗體的表面電位并抑制高濃度的抗體本身的締合，從而提高利用膜的過濾性，利用膜在短時間內(nèi)且以高收率從高濃度單克隆抗體溶液中將病毒甚至包括小病毒也去除?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 美國特開2003/023^69號公報專利文獻2 日本特開2001-335509號公報非專利文獻非專禾丨J 文獻 1 :Manabe. S> Removal of virus through novel membrane filtration method. > Dev. Biol. Stand.、(1996)88 :81-90.非專利文獻 2 :Brandwein H 等、Membrane filtration for virus removal.、Dev Biol(Basel).、(2000) 102 :157-63.非專禾lJ 文獻 3 Aranha-Creado 等、Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter. ,Biologicals. (1998)Jun ；26 (2) :167-72.
__專禾Ij文獻 4 Moce—Llivina 等、Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、 Journal of Virological Methods、(2003)April、Vol. 109，Issue 1，Pages 99-101.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題鑒于上述問題，本發(fā)明的課題在于提供利用膜從高濃度的單克隆抗體溶液中將病毒甚至包括小病毒也去除、在短時間內(nèi)且以高收率將抗體作為濾液進行回收的方法。用于解決問題的方案本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用添加有堿性氨基酸的單克隆抗體溶液利用病毒去除膜進行過濾，能夠以高去除率將存在于高濃度單克隆抗體溶液中的病毒去除，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下發(fā)明。[1] 一種含單克隆抗體的制劑的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml ；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)病毒去除膜的細(xì)小病毒去除率為LRV(Log Reduction Value:對數(shù)減少值)彡4。[2] 一種單克隆抗體溶液的病毒去除方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml ；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)病毒去除膜的細(xì)小病毒去除率為LRV(Log Reduction Value:對數(shù)減少值)彡4。[3] 一種含單克隆抗體的制劑的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml ；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)所述溶液中的單克隆抗體的ζ電位Eil(mV)為如下范圍a)相對于所述病毒去除膜的ζ電位Em(mV)為OmV彡Eil-Em彡20mV ；b)相對于含有所述單克隆抗體的、pH = 4、離子強度為0. ImM的溶液中的單克隆抗體的ζ電位EiO(mV)為IOmV彡EiO-Eil彡40mV。[4] 一種病毒去除方法，該方法用病毒去除膜對含單克隆抗體的單克隆抗體溶液進行過濾，其特征在于，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml ；
(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)所述溶液中的單克隆抗體的ζ電位Eil(mV)為如下范圍a)相對于所述病毒去除膜的ζ電位Em(mV)為OmV彡Eil-Em彡20mV ；b)相對于含有所述單克隆抗體的、pH = 4、離子強度為0. ImM的溶液中的單克隆抗體的ζ電位EiO(mV)為IOmV彡EiO-Eil彡40mV。[5]根據(jù)[3]或[4]所述的方法，其中，單克隆抗體溶液中的單克隆抗體的ζ電位 Eil(mV)相對于病毒去除膜的ζ電位Em(mV)為-4% XEm彡Eil彡-550% XEm。[6]根據(jù)[3] [5]中任一項所述的方法，其中，含單克隆抗體的、pH = 4、離子強度為0. ImM的溶液中的單克隆抗體的ζ電位EiO (mV)為+25mV以上。[7]根據(jù)[1] W]中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液為通過細(xì)胞培養(yǎng)而制作的單克隆抗體溶液。[8]根據(jù)[1] [7]中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液的pH為4 7的范圍。[9]根據(jù)[1] [8]中任一項所述的方法，其中，病毒去除膜的材質(zhì)為纖維素。[10]根據(jù)[1] [9]中任一項所述的方法，其中，病毒去除膜的材質(zhì)為進行了親水化的合成高分子。[11]根據(jù)[10]所述的方法，其中，合成高分子為聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚砜或聚乙火布。[12]根據(jù)[1] [11]中任一項所述的方法，其中，堿性氨基酸為精氨酸、組氨酸、 賴氨酸或它們的衍生物或它們的鹽。[13]根據(jù)[1] [12]中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液中，堿性氨基酸的含量相對于抗體為0. 1 20mmol/g。[14]根據(jù)[1] [13]中任一項所述的方法，其中，抗體的處理量為^g/m2/3小時 /bar(壓力換算)以上。[15]根據(jù)[1] [14]中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液含有選自無機鹽、緩沖液成分、表面活性劑或糖類中的一種以上。[16]根據(jù)[1] [15]中任一項所述的方法，其中，利用病毒去除膜的過濾為死端
過濾ο[17]根據(jù)[1] [16]中任一項所述的方法，其在色譜層析、濃縮或緩沖液交換中的任一操作后進行用病毒去除膜對單克隆抗體溶液進行過濾從而去除病毒的工序。[18]根據(jù)[1] [17]中任一項所述的方法，其在濃縮或緩沖液交換的任一操作后進行用病毒去除膜對單克隆抗體溶液進行過濾從而去除病毒的工序。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以在抑制抗體的凝聚體形成的同時、控制抗體與膜之間的電位關(guān)系，能夠在短時間內(nèi)且以高收率對高濃度的單克隆抗體溶液進行處理，且能夠以高去除率將病毒甚至包括小病毒也去除。本發(fā)明可以期待抗體藥物的制造工序的簡化、緊湊化、低成本化等副帶效果。
具體實施方式
以下更加詳細(xì)地說明本發(fā)明。本發(fā)明中使用的抗體為單克隆抗體。另外，單克隆抗體可以通過任何方法制造及精制。優(yōu)選通過CHO等動物細(xì)胞培養(yǎng)而制作的單克隆抗體。單克隆抗體的制造基本上可以利用公知的技術(shù)?？梢匀缦露圃彀凑胀ǔ５拿庖叻椒ㄊ箘游飳乖a(chǎn)生免疫，利用公知的篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，制作該細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞，對其進行大量培養(yǎng)，從而可以制作。而且，單克隆抗體并非限定于雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的(小鼠)單克隆抗體，還包括為了降低相對于人的異種抗體抗原性等而人為地進行了改變的嵌合抗體?；蛘弑景l(fā)明還可使用進行了重排的人源化抗體。此為利用人以外的哺乳動物、例如小鼠抗體的互補性決定區(qū)域?qū)⑷丝贵w的互補性決定區(qū)域置換而成，其通常的基因重組手法也是已知的。使用該已知方法，可獲得再構(gòu)成人源化抗體。單克隆抗體溶液中的抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml。優(yōu)選為20mg/ml 80mg/ ml、更優(yōu)選為20mg/ml 70mg/ml、進一步優(yōu)選為20mg/ml 50mg/ml。當(dāng)抗體濃度增高時， 利用病毒去除膜的過濾速度傾向于降低。單克隆抗體溶液中的抗體的純度為單體為90%以上、更優(yōu)選95%以上。作為抗體溶液中所含的單體以外的雜質(zhì)有締合體 凝聚體，它們是抗體的2聚體、3聚體、4聚體或多聚體。締合體 凝聚體的量多時，用病毒去除膜進行過濾時會發(fā)生堵塞、無法獲得高的處理量。單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸。堿性氨基酸可使用精氨酸、組氨酸、胍、賴氨酸或它們的衍生物或它們的鹽。優(yōu)選為精氨酸、組氨酸、賴氨酸或它們的衍生物或它們的鹽。更優(yōu)選為精氨酸或其衍生物或它們的鹽。單克隆抗體溶液中的堿性氨基酸的濃度從過濾性的提高效果出發(fā)優(yōu)選為IOmM 300mM的范圍。另外，單克隆抗體溶液中相對于抗體的堿性氨基酸的含量從過濾性的提高效果出發(fā)優(yōu)選為0. 1 20mmol/g。更優(yōu)選為0. 3 lOmmol/g、進一步優(yōu)選為0. 6 7mmol/g 的范圍。(堿性氨基酸的作用原理)通過將堿性氨基酸添加至單克隆抗體溶液中從而能夠改善過濾性的原因雖不清楚，但本發(fā)明人等認(rèn)為如下。已知抗體通常在等電點以下帶(+)電荷。認(rèn)為本發(fā)明中的堿性氨基酸具有緩和抗體表面的電位、抑制其與病毒去除膜的(_)電荷的靜電相互作用(靜電引力)的效果。另外，通常認(rèn)為，在接近于抗體的等電點的PH區(qū)域內(nèi)，抗體之間的靜電排斥力減少，從而抗體本身由于疏水性相互作用而有易于締合的傾向、或者由于抗體與膜的疏水性相互作用而有過濾性降低的傾向，但堿性氨基酸進一步對于抑制抗體之間的疏水性相互作用以及抗體-膜間的疏水性相互作用也有效果?？贵w、膜表面的電位以ζ電位來表示?？贵w、膜表面的ζ電位的測定方法例如可以使用kta potential analyzer ELS-Z(大冢電子株式會社制)通過電泳光散射法測定， 但測定方法并非局限于此。若將規(guī)定溶液條件下的單克隆抗體的ζ電位設(shè)為Eil (mV)、將規(guī)定溶液條件下的病毒去除膜的ζ電位設(shè)為Em(mV)，則優(yōu)選具有以下關(guān)系。這里，“規(guī)定溶液條件下的病毒去除膜的ζ電位”是指“在用與單克隆抗體溶液具有相同組成、但不含單克隆抗體的溶液充滿病毒去除膜的條件下的該病毒去除膜的ζ電位”。
抗體的ζ電位Eil與膜的ζ電位Em之間的關(guān)系優(yōu)選為OmV ( Eil-Em ( 20mV。 當(dāng)Eil-Em處于該范圍時，認(rèn)為在抗體與膜之間發(fā)揮的相互作用減小、具有進一步提高膜的過濾速度的效果。當(dāng)Eil-Em超過20mV時，在抗體與膜之間發(fā)揮的相互作用增大，對過濾不利。另外，本發(fā)明的病毒去除膜的電位在本申請的pH范圍內(nèi)帶負(fù)電荷，進而，抗體帶正電荷。利用其他的表示方式進行表示時，抗體的ζ電位Eil與膜的ζ電位Em之間的關(guān)系優(yōu)選為-4% XEm彡Eil彡-550% X Em。本發(fā)明的單克隆抗體中，在抗體的等電點以下的pH、即pH = 4下且離子強度 0. ImM下的抗體的ζ電位(基本電位)EiO (mV)期望為+25mV以上。優(yōu)選為+27mV以上、更優(yōu)選為+^mV以上。為了通過堿性氨基酸的添加來抑制抗體與膜的靜電相互作用、表現(xiàn)高的過濾性 (Flux)，優(yōu)選將抗體的表面電位(ζ電位)Eil緩和至+20mV以下。而且，抗體的ζ電位EiO與Eil之間的關(guān)系優(yōu)選為IOmV彡EiO-Eil彡40mV。 EiO-Eil小于IOmV時，則相對于抗體的基本電位的緩和作用較弱，無法獲得所期待的過濾
速度提高效果。單克隆抗體溶液的pH優(yōu)選為4. 0 7. 0的范圍。當(dāng)小于pH4. 0和超過pH7. 0時， 會引起抗體本身的變性、分解。在PH4. 0 7. 0的范圍內(nèi)，抗體本身穩(wěn)定化、表面帶正電荷， 因而抑制凝聚體形成。另外，堿性氨基酸在PH4. 0 7. 0的范圍內(nèi)發(fā)揮提高高濃度抗體的病毒去除膜過濾時的過濾性的作用。單克隆抗體溶液還可進一步含有選自無機鹽、緩沖液成分、表面活性劑或糖類中的一種以上。作為無機鹽，可含有NaCl、緩沖鹽。作為緩沖液可使用醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、 磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。作為無機鹽、緩沖液成分的濃度，以離子強度計優(yōu)選10 500mM的范圍。這里，離子強度可用下式計算。離子強度=1/2X Σ (Ci X Zi2)Ci 摩爾濃度、Zi 離子價數(shù)表面活性劑可使用作為非離子性表面活性劑的Tween20、Tween80等，濃度可含有 0. 01 0. 05w%。作為糖類(有單糖、二糖、三糖、寡糖、糖醇等)的添加劑，可含有1 10w%、優(yōu)選含有1 5wt%的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、麥芽糖、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇、甘露醇、葡聚糖等。病毒去除膜的材質(zhì)可使用纖維素或經(jīng)親水化的合成高分子。纖維素可使用再生纖維素、天然纖維素、醋酸纖維素等。經(jīng)親水化的合成高分子可使用親水化聚偏氟乙烯 (PVDF)、親水化聚醚砜(PES)、親水化聚乙烯(PE)、親水化聚砜(PQ等。作為親水化方法， 可舉出通過涂覆、接枝反應(yīng)、交聯(lián)反應(yīng)等方法在膜表面導(dǎo)入親水性官能團、或者固定親水性聚合物的方法。膜的形狀可以是平膜和中空纖維膜的任一種，由于即便是膜面積較大但可以使將膜裝填于容器中而制作的過濾器小型化，因此優(yōu)選中空纖維膜?？梢灾谱鞅贿^濾液入口側(cè)的一次側(cè)空間和過濾液濾出側(cè)的二次側(cè)空間通過膜而被隔開的過濾器。將病毒去除膜用于過濾時，可作為過濾器的形態(tài)使用。病毒去除膜的細(xì)小病毒的去除性能需要為LRV4以上。更期望為LRV5以上。作為以細(xì)小病毒去除為對象的市售病毒去除過濾器，可列舉出病毒去除膜由纖維素構(gòu)成的 Planova 15N(旭化成醫(yī)療(Asahi Kasei Medical)株式會社制)、Planova 20N(旭化成醫(yī)療(Asahi Kasei Medical)株式會社制)，由親水化PES構(gòu)成的 Virosart CPV(Sartorius 公司制)、Viresolve Pro (Millipore 公司制)等。細(xì)小病毒有由于小鼠細(xì)小病毒混入CHO細(xì)胞(小鼠來源)而污染制造工藝中的單克隆抗體的實例，F(xiàn)DA出版了與使用動物細(xì)胞制作的生物藥品的病毒安全性評價有關(guān)的指南(ICHQ5A)。細(xì)小病毒由于沒有包膜，因而物理化學(xué)上穩(wěn)定，對于在生物學(xué)制劑的制造工藝中的失活工序中通常進行的加熱、低PH、化學(xué)藥劑處理具有耐受性，作為具有與失活法不同的作用機理的病毒去除方法，利用病毒去除膜去除細(xì)小病毒的需求變高。細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科，是目前公知的最小病毒(直徑18 Mnm)?？膳e出小鼠細(xì)小病毒(MVM)、豬細(xì)小病毒(PPV)、狗細(xì)小病毒(CPV)等。在本申請的病毒去除膜評價中作為模型病毒使用PPV。病毒去除膜的病毒的去除性能用LRV(Log Reduction Value)表示。LRV是由下述式計算在病毒去除膜的過濾前后的抗體溶液中的病毒濃度變化。LRV = Iog10 (C0/CF)這里，C0 =用病毒去除膜進行過濾之前的抗體溶液中的病毒濃度Cf =用病毒去除膜進行了過濾后的抗體溶液中的病毒濃度病毒濃度可以用感染性滴度、病毒核酸的復(fù)制數(shù)等來表現(xiàn)。作為感染性滴度的測定法可舉出TCID50法、空斑技術(shù)等。病毒的核酸復(fù)制數(shù)可用PCR法等進行測定。在利用病毒去除膜進行過濾之前，需要調(diào)整為單克隆抗體濃度為20 100mg/ml 的范圍、且至少含有堿性氨基酸的抗體溶液組成。如上所述，優(yōu)選單克隆抗體溶液的PH為 4 7的范圍。堿性氨基酸濃度優(yōu)選每單位抗體為0. 1 20mmol/g的范圍?？稍谏V層析處理后的抗體洗脫液中添加規(guī)定濃度的堿性氨基酸、調(diào)整至規(guī)定 pH，還可以使用公知的方法，由洗脫液的緩沖液組成與調(diào)整為規(guī)定的堿性氨基酸、pH的溶液進行緩沖交換。另外，還可同時進行抗體濃縮和緩沖交換、調(diào)整至所需的溶液組成。PH調(diào)整可以利用NaOH、HC1、無機酸、有機酸、緩沖液進行。作為緩沖液可使用醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液等。利用病毒去除膜的抗體溶液的過濾方法優(yōu)選為死端過濾。還可是使過濾壓力為一定值的定壓過濾、使過濾速度為一定值的定速過濾的任一種。過濾壓力因病毒去除膜的材質(zhì)而不同，在膜的耐受壓力以下的范圍內(nèi)進行。例如，當(dāng)為由纖維素構(gòu)成的病毒去除膜時， 49kPa(0. 5bar) 98kPa(lbar)的范圍最佳。為親水化PVDF、親水化PES、親水化PS時， 98kPa(Ibar) 490kPa(5bar)的范圍最佳。用病毒去除膜進行過濾的溫度只要是不影響抗體溶液的狀態(tài)(不會使其改性)的溫度范圍即可，優(yōu)選為4°C 40°C的范圍。更優(yōu)選為4°C 35°C的范圍。由于溫度影響抗體溶液的粘度、影響病毒去除膜過濾時的Flux，因此，雖然也取決于抗體本身相對于溫度的穩(wěn)定性，但進一步優(yōu)選20°C 35°C的范圍。
在將溶液調(diào)整至規(guī)定組成后、用病毒去除膜進行過濾前，還可用由孔徑大于病毒去除膜孔徑尺寸的膜所制成的過濾器進行預(yù)備過濾。這里，大孔徑的過濾器可使用 Planova 35N, Planova 75N (以上旭化成醫(yī)療株式會社制)、0. 1 μ m過濾器、0. 2 μ m過濾器等。也可不進行預(yù)備過濾，直接用病毒去除膜進行過濾。關(guān)于抗體的處理量(Throughput)，在以上的抗體濃度、過濾壓力、溫度范圍內(nèi)，作為病毒去除膜的單位膜面積、單位時間、單位過濾壓力的處理量，通?？色@得^g/m2/3小時 /bar (或98kPa)?？贵w的處理量(Throughput)由上述每單位的過濾液量(V)和濾液中回收的抗體濃度(C)計算(抗體的處理量=VXC)，利用Throughput可評價過濾性和收率兩
者ο(下游(Downstream)中的病毒過濾的位置)利用病毒去除膜進行過濾的工序可以在色譜層析、濃縮、濃縮/緩沖交換中的任一操作后進行。作為色譜，可舉出在色譜柱中填充有離子交換樹脂、凝膠過濾樹脂的柱色譜，在多孔膜表面附著有離子交換基的膜色譜。作為色譜的分離模式，有凝膠過濾色譜、離子交換色譜(陽離子交換CEX，陰離子交換AEX)、疏水色譜(HIC)、親和色譜、金屬螯合親和色譜、羥基磷灰石色譜等。還有作為色譜的配體而將離子交換和疏水相互作用復(fù)合的色
■i並曰O濃縮工序可根據(jù)公知的方法利用使用了超濾(UF)膜的方法進行?？衫秒x心濃縮進行。緩沖交換工序可根據(jù)公知的方法使用超濾膜與濃縮同時進行。還可利用凝膠過濾法進行。還可通過使用了透析膜的透析法進行。在利用病毒去除膜進行過濾之后，可接著進行利用色譜處理的精制處理。另外，還可通過UF處理進一步進行高濃度化。還可以以病毒去除膜過濾時的溶液組成進行最終制劑化。另外，還可在病毒去除膜過濾后添加糖類、表面活性劑等，進行最終制劑化。還可與其他組成的溶劑進行緩沖交換。另外，還可進一步進行冷凍干燥處理。實施例在以下示出的實施例中，病毒去除膜使用由纖維素中空纖維膜構(gòu)成的 PlanOVa 20N(旭化成醫(yī)療株式會社制)(以下表述為過濾器A)及由親水化聚偏氟乙烯中空纖維膜制成的過濾器(以下表述為過濾器B)。另外，作為單克隆抗體制劑中間制品的模型，使用根據(jù)國際公開第04/087761號小冊子記載的方法、按照下述“單克隆抗體的制備”制備單克隆抗體溶液并使用。(過濾器B的制作)使用亨舍爾混合機(三井礦山(株)制、形式20B)在70°C下攪拌混合含有熔體流動指數(shù)(MFI)為2.5(g/10ml)的聚偏氟乙烯樹脂(吳羽化學(xué)(株)制、T#1300)49wt%、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(大阪有機化學(xué)工業(yè)(株)制工業(yè)品)51wt%的組合物，然后進行冷卻， 制成粉末狀，將該粉末狀物從料斗投入到雙軸同方向螺桿式擠出機、”…、(株)制 KZW25TW-50MG-NH(-600))中，在210°C下熔融混合，均勻地熔解。接著，一邊向中空內(nèi)部流入溫度130°C的鄰苯二甲酸二丁酯(大八化學(xué)工業(yè)(株)制工業(yè)品)，一邊從內(nèi)直徑0. 8mm、 外直徑1. 05mm的環(huán)狀孔所形成的紡口分別將均勻熔解物擠出成中空纖維狀，在調(diào)溫至10、 20、30、40°C的冷卻水浴中使其冷卻固化，以50m/分鐘的速度纏繞在金屬纏線框上。之后，利用58wt%異丙醇水溶液(大八化學(xué)工業(yè)(株)制工業(yè)品)將鄰苯二甲酸二環(huán)己酯及鄰苯二甲酸二丁酯抽提去除，用水將附著的58wt%異丙醇水溶液置換，然后以浸漬于水中的狀態(tài)使用高壓蒸汽滅菌裝置(平山制作所(株)制HV-85)在125°C下實施4小時的熱處理。 之后，用異丙醇(大八化學(xué)工業(yè)(株)制工業(yè)品)將所附著的水置換，然后使用真空干燥機 (株)制)在60°C的溫度下進行干燥，從而獲得中空纖維狀的微多孔膜。予以說明，在從纏繞至干燥的全部工序中，中空纖維以定長狀態(tài)固定而進行處理。接著，對上述微多孔膜進行利用接枝法的親水化處理。反應(yīng)液使用如下而得到的反應(yīng)液按照使丙烯酸羥丙酯(大阪有機化學(xué)(株)制工業(yè)品)達到8體積％的方式將其溶解于3- 丁醇(純正化學(xué)(株)制工業(yè)品)的25體積％水溶液中，在保持于45°C的狀態(tài)下進行30分鐘氮氣鼓泡。首先，在氮氣氣氛下，一邊用干冰將該微多孔膜冷卻至-60°C — 邊以Co60為射線源，照射25kGy的、射線。照射后的微多孔膜在13. 4Pa以下的減壓下靜置15分鐘后，在60°C下使上述反應(yīng)液與該微多孔膜接觸，靜置1小時。之后，用58wt%異丙醇水溶液洗滌該微多孔膜，在60°C下真空干燥4小時，獲得具有親水性的微多孔膜。確認(rèn)到該微多孔膜在與水接觸時，水自發(fā)地滲透至細(xì)孔內(nèi)。利用聚氨酯將12根該微多孔膜的束的兩端密封，接合到聚苯乙烯制的中空纖維膜劃分成入口側(cè)空間和出口側(cè)空間的濾筒中， 制成過濾器(有效膜面積0. OOlm2)。以下將使用上述方法獲得的由親水化PVDF中空纖維膜制成的過濾器表述為過濾器B。(單克隆抗體的制備)將含有用厚度過濾器和0.2(μπι)膜過濾器澄清化的人單克隆抗體(人IgGl)的 CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清(表達量700mg/L) 1500(ml)添加到用10(mmol/l)磷酸鈉緩沖液(ρΗ6·0)進行了平衡化的 Protein A 柱(GE Healthcare Bioscience 公司制 Mabselect 20mm ID X 20cm)中(線速度500cm/h)。接著，通過5個柱容量的20 (mmol/1)檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 4)將人單克隆抗體洗脫(線速度500cm/h)。用10 (mmol/1)磷酸鈉緩沖液(pH8. 2) 中和該洗脫液，進而用1.5(mmol/l)TriS-HCl調(diào)整至pH8.0，然后添加于用10 (mmol/1) Tris-HCl進行了平衡化的陰離子交換柱(GE Healthcare Bioscience公司制Q Sepharose XL IOmm IDX 15cm)中(線速度300cm/h)。添加完成后，將3個柱容量的平衡化緩沖液通入到柱(線速度300cm/h)中，用1.0(mol/l)醋酸將柱非吸附成分調(diào)整至pH5. 0，然后添加到用20(mmol/l)醋酸鈉緩沖液(pH5. 0)進行了平衡化的陽離子交換柱(GE Healthcare Bioscience 公司制、SP Sepharose FF26mm IDX 15cm)中(線速度 300cm/ti)。添加完成后，用5個柱容量的平衡化緩沖液進行洗滌(線速度300cm/h)，進而通入5個柱容量的 20 (mmol/1)醋酸鈉/0. 30(mol/l)氯化鈉緩沖液(pH5. 0)，作為人單克隆抗體溶液進行洗脫 (線速度300cm/h)。利用超濾膜(MiIlipore公司制Biomax 30 50cm2)按照達到下述表1 和表2所示溶液條件的方式對該洗脫液進行濃縮和交換成緩沖組成。(病毒去除性能的測定)用加入有牛血清(Upstate公司制、在56°C的水浴中加熱30分鐘、滅活后使用)3 體積％和青霉素 / 鏈霉素(+lOOOOUnits/mlPenicillin, +10000 μ g/ml Streptomycin, λ > if卜口夕工 >制)1體積％的D-MEM( 4 > 卜口夕工 >制、high-glucose)(該混合液以后記載為3% FBS/D-MEM)稀釋培養(yǎng)的PK-13細(xì)胞(由ATCC獲得、ATCC No. CRL-6489)，制備細(xì)胞濃度2. OX IO5(cells/ml)的稀釋混懸液。準(zhǔn)備10塊96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板O^lcon公司制)，將該細(xì)胞混懸液分注于所有的孔中，每孔100 (μ 1)。接著，對于進行了下述3小時過濾的濾液的總量混合液，利用3% FBS/D-MEM制備它們的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍稀釋液。進而，對于在過濾前剛采集的各原液，利用3% FBS/D-MEM制備它們的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍稀釋液。在分注有上述細(xì)胞混懸液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將各濾液和濾液的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5 倍稀釋液以及原液的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7稀釋液分注于8個孔中，每孔 100(μ 1)，在37°C、5%二氧化碳?xì)夥障?、在孵化器中培養(yǎng)10天。接著，對于培養(yǎng)了 10天的上述細(xì)胞培養(yǎng)板，利用紅血球吸附法(病毒實驗學(xué)總論國立預(yù)防衛(wèi)生研究所學(xué)友會編、P. 173)進行TCID50(50%感染性滴度)的測定。用PBS(-) (日水制藥株式會社制、用附帶于商品的方法進行調(diào)制)將雞保存血(日本〃 4才f ^卜制)稀釋至5倍后，在2500(rpm)、4°C下離心分離5分鐘，使紅血球沉淀后，將上清吸引去除，再次用PBS (-)將含有所得的紅血球的沉淀物稀釋至200倍。接著，將所制備的紅血球沉淀物的PBS(-)稀釋液分注到上述細(xì)胞培養(yǎng)板的所有孔中，每孔100(μ 1)，靜置2小時后，目視確認(rèn)紅血球是否吸附在培養(yǎng)的細(xì)胞組織的表面上，將可確認(rèn)吸附者作為引起病毒感染的孔、將未確認(rèn)吸附者作為未感染的孔進行計數(shù)。對于所得的各培養(yǎng)液的病毒感染的有無，對各濾液及其稀釋液、或原液的稀釋液分別確認(rèn)比例，利用Reed-Muench法(病毒實驗學(xué)總論國立預(yù)防衛(wèi)生研究所學(xué)友會編、p. 479-480)計算log(TCID5Q/ml)作為感染性滴度，求出病毒去除率LRV，為LRV4以上。(單克隆抗體純度的測定)利用HPLC(島津制作所制!Prominence、柱東曹GPC用柱TSK gel G3000SWXL、流動相磷酸緩沖液(pH6.9)/0.3(mol/l)氯化鈉水溶液)，通過峰面積比來測定按照達到以下實施例、比較例的溶液條件的方式進行了調(diào)整的單克隆抗體溶液純度，為以下的表3所示。(抗體和膜的ζ電位(表面電位)測定)使用potential analyzer ELS-Z(大冢電子株式會社制)根據(jù)制造業(yè)者的指示書利用電泳光散射法進行測定(引用文獻0tsuka Densi Web information,www/photal co.jp.)。由遷移度計算規(guī)定溶液條件下的抗體的ζ電位(Eil)。？??！二‘離子強度化丄!!]! NaCl溶液中的抗體的ζ電位(EiO)為+37mV。膜的ζ電位(Em)，與上述同樣使用 potential analyzer ELS-Z(大冢電子株式會社制)根據(jù)制造業(yè)者的指示書進行測定。具體地說，膜的ζ電位(Em)如下測定使用平板試樣用小室單元(大冢電子株式會社制)， 在其中設(shè)置膜，利用與抗體溶液具有相同組成、但不含抗體的溶液將膜充滿，在該條件下， 使用用羥丙基纖維素包覆的電位大致為0的聚苯乙烯膠乳所構(gòu)成的監(jiān)測顆粒(大冢電子株式會社制)進行測定(引用文獻 Otsuka Densi Web information, www/photal co.jp·)。 為由纖維素構(gòu)成的膜時，代替中空纖維膜而制作平膜(引用文獻日本特開昭59-45333號公報)、測定表面的ζ電位?？贵w和膜的ζ電位示于下表4。實施例1 7及比較例1 5如上所述，將單克隆抗體溶液按照達到表1的條件的方式進行濃縮和交換成緩沖組成，然后利用上述方法進行該階段的單克隆抗體純度的測定。之后，添加0. 5Vol%的 PPV，充分?jǐn)嚢韬?，使用膜面積0. OOlm2的過濾器A以98kPa(lbar)的壓力對實施例1 7、 比較例1 5的溶液實施3小時的Dead-end式過濾。計算可過濾的單克隆抗體量(kg/m2/3hr/bar)，將結(jié)果示于表1。PPV的去除性能評價通過上述方法進行。進而，將抗體純度的結(jié)果示于表3。[表1]
權(quán)利要求
1.一種含單克隆抗體的制劑的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)病毒去除膜的細(xì)小病毒去除率為LRV(LogReduction Value 對數(shù)減少值)彡4。
2.一種單克隆抗體溶液的病毒去除方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)病毒去除膜的細(xì)小病毒去除率為LRV(LogReduction Value 對數(shù)減少值)彡4。
3.一種含單克隆抗體的制劑的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)所述溶液中的單克隆抗體的ζ電位Eil(mV)為如下范圍a)相對于所述病毒去除膜的ζ電位Em(mV)為OmV彡Eil-Em彡20mV；b)相對于含有所述單克隆抗體的、pH= 4、離子強度為0. ImM的溶液中的單克隆抗體的 ζ 電位 EiO (mV)為 IOmV 彡 EiO-Eil 彡 40mV。
4.一種病毒去除方法，該方法用病毒去除膜對含單克隆抗體的單克隆抗體溶液進行過濾，其特征在于，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90%以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml 100mg/ml；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)所述溶液中的單克隆抗體的ζ電位Eil(mV)為如下范圍a)相對于所述病毒去除膜的ζ電位Em(mV)為OmV彡Eil-Em彡20mV；b)相對于含有所述單克隆抗體的、pH= 4、離子強度為0. ImM的溶液中的單克隆抗體的 ζ 電位 EiO (mV)為 IOmV 彡 EiO-Eil 彡 40mV。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，單克隆抗體溶液中的單克隆抗體的ζ電位 Eil(mV)相對于病毒去除膜的ζ電位Em(mV)為-4% XEm彡Eil ^ -550% XEm。
6.根據(jù)權(quán)利要求3 5中任一項所述的方法，其中，含單克隆抗體的、pH= 4、離子強度為0. ImM的溶液中的單克隆抗體的ζ電位EiO (mV)為+25mV以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液為通過細(xì)胞培養(yǎng)而制作的單克隆抗體溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液的pH為4 7的范圍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其中，病毒去除膜的材質(zhì)為纖維素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的方法，其中，病毒去除膜的材質(zhì)為進行了親水化的合成高分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，合成高分子為聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚砜或聚乙火布O
12.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的方法，其中，堿性氨基酸為精氨酸、組氨酸、賴氨酸或它們的衍生物或它們的鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液中，堿性氨基酸的含量相對于抗體為0. 1 20mmol/g。
14.根據(jù)權(quán)利要求1 13中任一項所述的方法，其中，抗體的處理量為^g/m2/3小時 /bar(壓力換算)以上。
15.根據(jù)權(quán)利要求1 14中任一項所述的方法，其中，單克隆抗體溶液含有選自無機鹽、緩沖液成分、表面活性劑或糖類中的一種以上。
16.根據(jù)權(quán)利要求1 15中任一項所述的方法，其中，利用病毒去除膜的過濾為死端過濾ο
17.根據(jù)權(quán)利要求1 16中任一項所述的方法，其在色譜層析、濃縮或緩沖液交換中的任一操作后進行用病毒去除膜對單克隆抗體溶液進行過濾從而去除病毒的工序。
18.根據(jù)權(quán)利要求1 17中任一項所述的方法，其在濃縮或緩沖液交換的任一操作后進行用病毒去除膜對單克隆抗體溶液進行過濾從而去除病毒的工序。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種利用膜從高濃度的單克隆抗體溶液中去除病毒甚至包括小病毒、并在短時間內(nèi)以高收率將抗體作為濾液進行回收的方法。本發(fā)明提供上述方法，其為含單克隆抗體的制劑的制造方法，其特征在于，其包含用病毒去除膜過濾單克隆抗體溶液中的病毒從而將其去除的病毒去除工序，(1)單克隆抗體中的單體含有率為90％以上；(2)單克隆抗體溶液中的單克隆抗體濃度為20mg/ml～100mg/ml；(3)單克隆抗體溶液至少含有堿性氨基酸；且(4)病毒去除膜的細(xì)小病毒去除率為LRV(Log Reduction Value對數(shù)減少值)≥4。
文檔編號C07K1/34GK102365368SQ201080013920
公開日2012年2月29日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者小室雅廉, 本鄉(xiāng)智子 申請人:旭化成醫(yī)療株式會社