專利名稱：基于量子點的植物細胞鈣離子探針及其制備方法與應用的制作方法
基于量子點的植物細胞鈣離子探針及其制備方法與應用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于納米探針制備領(lǐng)域，特別涉及一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針及其制備方法與應用。
背景技術(shù)：
鈣離子作為植物細胞內(nèi)的第二信使物質(zhì)，介導細胞對外界刺激的反應應答，調(diào)控細胞內(nèi)許多重要的生理和生化過程。大量研究表明，細胞對許多外界環(huán)境和激素等刺激作出的應答是通過胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度變化來傳遞的。因此，實時監(jiān)測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化水平對于研究激素信號轉(zhuǎn)導機制至關(guān)重要。
細胞內(nèi)游離鈣離子的測定常用的探針有放射性同位素探針、熒光染料探針等。放射性同位素存在放射性污染；熒光染料受光照射易分解即存在光漂白現(xiàn)象，如Fluo-3，用波長為488nm的光激發(fā)時，光照時間持續(xù)Imin猝滅率已達80%，光照aiiin猝滅率為98%， 同時熒光染料的激發(fā)波長范圍很窄，實際工作中供選擇的波長范圍有限。目前，商業(yè)化應用于胞質(zhì)游離鈣離子測定的熒光探針數(shù)目有限且存在一定缺陷。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述方法得到的基于量子點的植物細胞鈣離子探針。
本發(fā)明的再一目的在于提供所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的應用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，包含以下步驟
(1)制備碲氫化鈉(NaHTe)將N2飽和的二次蒸餾水和硼氫化鈉(NaBH4)混合后， 再加入碲粉(Te)，于25 60°C水浴下恒溫反應10 60min，待黑色Te粉完全消失，溶液呈無色透明后置于4 8V反應10 60min，底部出現(xiàn)白色沉淀硼酸鈉(Na2B4O7)，得到的上清液即為無色透明的NaOTe水溶液；其中，1Te和NaBH4按摩爾比1 1. 8 4配比；
(2)制備CdTe/MA量子點在通過氮氣除氧得到的二次蒸餾水中依次加入氯化鎘 (CdCl2 · 2. 5H20)和巰基乙胺·鹽酸鹽(MA · HCl)，將pH值調(diào)為5. 0 6. 0后繼續(xù)通氮后注入步驟(1)制備的NaHTe水溶液，于50 120°C恒溫回流10 90min，得到橙紅色澄清的 CdTe/MA QDs溶液，于4 8°C保存；其中，氯化鎘、NaHTe水溶液以及巰基乙胺·鹽酸鹽的用量按照如下方法計算Cd2+、Te-和MA按摩爾1 (0. 1 0. 5) O 3)配比；
(3)制備基于量子點的植物細胞鈣離子探針將碳二亞胺(EDC)溶于乙二醇雙 (乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA)堿性水溶液中，置于25 60°C水浴中攪拌活化1 IOmin 后，在均勻攪拌下加入步驟( 制備的CdTe/MAQDs溶液，避光繼續(xù)攪拌反應10 60min ； 反應結(jié)束后，于4 8°C放置過夜終止反應，得到基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA ；其中，碳二亞胺、乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸和CdTe/MA QDs溶液的用量按照如下方法計算CdTe/MA QDs以步驟O)中加入的巰基乙胺計，碳二亞胺、乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸和CdTe/MAQDs按摩爾比1 (0. 5 2) (0. 5 4)配比。
步驟(1)中所述的隊飽和的二次蒸餾水用作反應介質(zhì)，其用量優(yōu)選為按硼氫化鈉溶解后濃度為lmol/L計算；
步驟(1)中所述的Te和所述的NaBH4優(yōu)選按摩爾比1 1. 8 3配比；
步驟O)中所述的二次蒸餾水用作反應介質(zhì)，其用量優(yōu)選為按氯化鎘溶解后濃度為 0. 008mol/L 計算；
步驟O)中所述的pH值優(yōu)選通過氫氧化鈉進行調(diào)節(jié)；
步驟⑵中所述的CdTe/MA QDs溶液優(yōu)選還通過如下步驟處理于4 8°C用二次蒸餾水和截留分子量為14000Da的透析袋對所述的CdTe/MA QDs溶液進行透析，透析后的CdTe/MA QDs溶液于4 8°C避光保存；
步驟(3)中所述的乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA)堿性水溶液的pH值優(yōu)選為7 9 ；
一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針，通過上述方法制備得到；
所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針在細胞內(nèi)游離鈣離子濃度監(jiān)測中的應用。
原理量子點(Quantum dots, QDs)是由II-VI族或III-V族元素組成的納米顆粒。與傳統(tǒng)的染料探針相比，量子點探針具有抗光漂白，激發(fā)波長寬的特點，同時量子點表面易功能化，有利于引入能特異性識別客體的活性官能團。本發(fā)明基于量子點的發(fā)光特性， 在量子點的表面引入EGTA，獲得一種能特異性識別鈣離子的探針。這一探針不僅可用于實時監(jiān)測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化水平，而且可檢測其它樣品中鈣離子濃度，前者對于研究鈣離子信號轉(zhuǎn)導機制至關(guān)重要。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果
(1)本發(fā)明提供的基于量子點的植物細胞鈣離子探針在實際應用中具有抗光漂白性。
(2)本發(fā)明提供的基于量子點的植物細胞鈣離子探針在實際應用中有特異選擇性，因此獲得的細胞鈣離子探針能特異性識別鈣離子，可以用于復雜的多組分體系進行機理研究。
(3)本發(fā)明提供的基于量子點的植物細胞鈣離子探針在實際應用中靈敏度比傳統(tǒng)熒光染料探針Fluo-3高。
(4)本發(fā)明制備基于量子點的植物細胞鈣離子探針的反應條件溫和，時間短，能耗低。
(5)本發(fā)明提供的制備方法，反應條件簡單，操作方便，對設(shè)備要求不高，運行成本低。


圖1是本發(fā)明所制備的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的結(jié)構(gòu)示意圖；其中JVVb艦廣代表巰基乙氨MA。4
圖2是實施例1制備的CdTe/MA QDs和CdTe/MA-EGTA的透射電鏡圖，其中a為 CdTe/MA QDs，b 為 CdTe/MA-EGTA。
圖3是CdTe/MA-EGTA加外標前后的毛細管電泳圖，其中1為偶聯(lián)液；2為偶聯(lián)液 +CdTe/MA ；3為偶聯(lián)液+EGTA ；4為偶聯(lián)液+EDC。
圖4是CcTTe/MA-EGTA熒光探針對Ca2+的特異性識別圖。
圖 5 是 CdTe/MA-EGTA 與 Fluo_3 的光穩(wěn)定性比較圖,其中A 為 CdTe/MA-EGTA QDs ； B 為 Fluo_30
圖6是CdTe/MA-EGTA熒光探針裝載前后擬南芥葉細胞的激光共聚焦顯微鏡圖，其中a為未裝載CdTe/MA-EGTA熒光探針；b為已裝載CdTe/MA-EGTA熒光探針。
圖7是CdTe/MA-EGTA熒光探針監(jiān)測擬南芥葉細胞中鈣離子濃度水平變化的激光共聚焦顯微鏡圖，其中a為未加茉莉酸(JA)處理的空白背景；b為ΙΟΟμπιοΙ ·ΙΛ1Α處理。
圖8為圖7的數(shù)字化表達圖，橫軸是激光照射的時間，縱軸為相對熒光強度，其中 a為未加茉莉酸(JA)處理的空白背景；b為100 μ mol · L4JA處理。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1
(1)制取NaHTe 向裝有攪拌磁子的小玻璃瓶中依次加入1. OmL N2飽和的二次蒸餾水，0. 0378g (1. 0 X 10_3mol) NaBH4 (易吸潮，稱量時動作要快)，并輕輕振蕩小瓶，使之完全溶解，然后加入0. 0638g(5.0X10-4mol)Te粉。蓋上帶導氣管的膠塞，并把導氣管插到液面下液封，然后置于恒溫磁力攪拌器上，在40°C水浴下恒溫反應30min，待黑色Te粉完全消失，溶液呈無色透明后置于4°C冰箱下恒溫反應30min，底部出現(xiàn)白色沉淀Na2B4O7,得到無色透明的上清液，即0. 5mol · L—1的NaHTe水溶液(Te和NaBH4按摩爾1 2配比)。
(2)制取CcTTe/MA 在IOOmL的三頸圓底燒瓶中注入50mL 二次蒸餾水，通氮氣 30min 后，依次加入 0. 0913g(4. 0X l(T4mol) CdCl2 · 2. 5Η20 和 0. 109g(9· 6X ΙΟΛιοΙ) MA · HCl (巰基乙胺·鹽酸鹽)，用Imol · L—1的NaOH調(diào)節(jié)溶液ρΗ值至5. 5，繼續(xù)通氮氣 30min后，注入步驟(1)新鮮制備的NaHTe 200 μ L (1. 0 X 10_4mol)，在100°C水浴中恒溫回流40min，得橙紅色澄清的CdTe/MA量子點(QDs)溶液，于4°C冰箱保存(溶液最終濃度以 Tel十為 2Xl(T3mol · Γ1，Cd2+、Te-和 MA 按摩爾 1 0. 25 2.4配比)。把 CdTe/MA QDs 裝于處理后的截留分子量為HOOODa的透析袋中，于4°C冰箱中用二次蒸餾水透析4天(每隔2 4h換水)，避光置于冰箱中4°C條件下保存。
(3)基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備準確稱取0. 0184g(9. 6X I(T5m0I) 碳二亞胺(EDC)溶于LOmL 2· 4X 10_2mOl/L乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA) (9.6X10_5mol)堿性水溶液(ρΗ為8)中，置于37 °C水浴中攪拌活化5min后，在均勻攪拌下滴加5. OmL純化的CcTTe/MA QDs溶液(以MA的量計為9. 6X 10_5mol)，控制摩爾比 QDs EDC EGTA=I 1 1，避光繼續(xù)攪拌反應30min。反應結(jié)束后，放入冰箱4°C過夜終止反應，得到基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA。該基于量子點的細胞鈣離子探針的示意圖如圖1所示，核心為CdTe量子點，/www代表巰基乙氨MA，最外層為EGTA0
(4)效果檢測。
①透射電鏡結(jié)論
透射電鏡圖如圖2(圖hSCdTe/MA QDs，圖2b為CdTe/MA_EGTA)所示，可見所制備的基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA為球形，分散性好，顆粒大小較為均一，粒徑約為3 4nm，說明所制備的量子點熒光探針保持了 CdTe/MA量子點的特性。
②毛細管電泳結(jié)論
用毛細管電泳法證明步驟(3)偶聯(lián)反應確實得到細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA。 進樣前按順序洗柱0. 2mol · L-1NaOH 洗 2min，超純水洗 lmin，pH5. 2、50mmol · L^1NaAc-HAc 緩沖液洗3min，采用20psi壓力洗滌，電壓為25KV ；設(shè)置緩沖體系的條件后以0. 5psi壓力進樣5s ；以分離條件為25KV電壓、214nm紫外檢測器檢測。
采用外標法分別把8. 3 μ L濃度為1. 92 X l(T2mol · Γ1 (以MA計)的CdTe/MAQDs 溶液； ο μ L 濃度為 1. 6Χ l(T2mol .171 的 EDC 溶液與及 1. 7 μ L 濃度為 2. 4Χ l(T2mol .171 的 EGTA溶液分別加入到10 μ L濃度為1. 6 X ΚΛιοΙ · L-1的CdTe/MA-EGTA溶液(即偶聯(lián)液) 中，定容至50μ L后直接進行毛細管電泳表征，結(jié)果如圖3所示，其中，曲線1為偶聯(lián)液，曲線2為偶聯(lián)液+CdTe/MA，曲線3為偶聯(lián)液+EGTA，曲線4為偶聯(lián)液+EDC。通過對加標后各峰的峰面積數(shù)據(jù)分析，從曲線2 4可推斷峰a為CdTe/MA QDs ；峰c為EGTA以及峰d為 EDC,由此可以推出峰b為CdTe/MA-EGTA。因此，證明已成功通過偶聯(lián)方法制備基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA。
③CdTe/MA-EGTA QDs熒光探針對Ca2+的特異性識別
在10. OmL比色管中依次加入1. OmL pH值為7. 4、IOmmol -L"1的磷酸鹽緩沖溶液， 1. OmL CdTe/MA-EGTA偶聯(lián)溶液，100 μ mol · Γ1的離子儲備液100 μ L，室溫下用二次蒸餾水定容到10. OmL，室溫下充分搖勻后，以400nm波長的光激發(fā)，在450 700nm波長范圍內(nèi)對上述混合液體系進行光譜掃描測定其熒光光譜。
結(jié)果如圖4所示，在各種金屬離子濃度相同的情況下，Ca2+對CdTe/MA_EGTA QDs 的熒光猝滅作用最大，當CCa2+ = 100 μ mol · ΙΛ CcdTe/MA_EGTA(Bs = 200 μ mol · Γ1時，熒光猝滅率(Effq = (Ftl-F)/Ftl，其中Ftl和F分別為加Ca2+前后體系的熒光強度)達84.2%，其它離子對量子點熒光猝滅率大大低于Ca2+。由此可知CdTe/MA-EGTA QDs熒光探針能特異性識別Ca2+，選擇性高。
④CdTe/MA-EGTA與Fluo-3光穩(wěn)定性比較
按以下相同實驗條件進行實驗。在10. OmL比色管中依次加入1. OmL pH值為7. 4 的PBS緩沖溶液(IOmmol · L-1)，熒光探針溶液(終濃度為200 μ mol · L-1)，0· Olmol/LCa2+ 離子儲備液5 μ L(終濃度為10 μ mol · Γ1)，室溫下用二次蒸餾水定容至5. OmL,充分搖勻后，設(shè)置一定的激發(fā)和檢測波長范圍G00 700nm)對體系進行光譜掃描測定其熒光光譜。 其中CcTTe/MA-EGTA的激發(fā)波長為λ ex = 400nm, Fluo-3 (購自Aldrich公司)的激發(fā)波長 λ ex = 488nm。
結(jié)果如圖5所示，相同實驗條件下，F(xiàn)luo-3-Ca2+體系熒光強度迅速猝滅，Imin時猝滅率已達80%，2min時基本已經(jīng)猝滅完畢，猝滅率為98%。而CdTe/MA-EGTA QDs-Ca2+體系熒光強度隨時間變化不大，經(jīng)IOmin照射猝滅率僅為18. 4%，由此可見，CdTe/MA-EGTA QDs熒光探針的抗光漂白性能較傳統(tǒng)有機染料探針Fluo-3相比要好得多。因此，實驗所制備的 CdTe/MA-EGTA克服了傳統(tǒng)染料試劑的缺陷，秉承了量子點穩(wěn)定的光學性能，可適用于長時間監(jiān)測。
⑤CcTTe/MA-EGTA QDs熒光探針監(jiān)測擬南芥葉肉細胞中鈣離子濃度水平變化
取按常規(guī)方法培養(yǎng)IOd的擬南芥葉片，切成約2 3mm寬的細條，依次加入pH為 7. 4、濃度 IOmmol · Γ1 的 PBS 緩沖溶液 200 μ L, 1. 6Χ l(T3mol · L^CdTe/MA-EGTA 熒光探針 50μ L，0. 125 μ L轉(zhuǎn)化表面活性劑Silwet L-77 (0. 05% ν/ν)?；靹蚝笥?7°C避光放置在培養(yǎng)箱中30min，取出后除去溶液，再加PBS緩沖溶液洗滌，置于1000轉(zhuǎn)/min離心lmin，重復 3次，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。
裝載探針前擬南芥葉肉細胞沒有熒光信號(如圖6a所示)與及裝載探針后出現(xiàn)明亮的綠色熒光(如圖6b所示)，可推斷已成功實現(xiàn)CdTe/MA-EGTA QDs熒光探針導入擬南芥葉肉細胞。圖6中的每圖第一列為熒光圖像，第二列為明場觀察的圖像，第三列為第一、 二列的Merge (整合)圖像。
接著，再用100 μ mol · Γ1茉莉酸(JA)處理裝載CcTTe/MA-EGTA QDs熒光探針后的擬南芥葉片。結(jié)果顯示，經(jīng)100 μ mol 茉莉酸(JA)處理后的擬南芥葉肉細胞(CdTe/ MA-EGTA QDs熒光探針導入的細胞)熒光強度在50. Os前變化不大，處理達Imin細胞內(nèi)的熒光基本已經(jīng)猝滅完畢(如圖7b所示)，以不作任何處理的作空白背景(如圖7a所示)。 這一實驗說明擬南芥葉肉細胞在茉莉酸的刺激下鈣離子濃度升高，升高的鈣離子濃度猝滅了 CdTe/MA-EGTA探針的熒光，證明本實驗所制備的新型CdTe/MA-EGTAQDs熒光探針可應用于細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度變化水平的實時監(jiān)測。圖8為圖7的數(shù)字化表達圖，橫軸是激光照射的時間，縱軸為相對熒光強度。其中a為空白背景；b為JA處理。
實施例2
(1)制取NaHTe 向裝有攪拌磁子的小玻璃瓶中依次加入1. OmL N2飽和的二次蒸餾水，0. 0340g (9. 0 X 10_4mol) NaBH4 (易吸潮，稱量時動作要快)，并輕輕振蕩小瓶，使之完全溶解，然后加入0. 0638g(5.0X10-4mol)Te粉。蓋上帶導氣管的膠塞，并把導氣管插到液面下液封，然后置于恒溫磁力攪拌器上，在25°C水浴下恒溫反應60min，待黑色Te粉完全消失，溶液呈透明后置于8°C冰箱下恒溫反應60min，底部出現(xiàn)白色沉淀Na2B4O7,得到淺粉色透明的上清液，即0. 5mol · L-1的NaHTe水溶液(Te和NaBH4按摩爾1 1. 8配比)。
(2)制取CcTTe/MA 在IOOmL的三頸圓底燒瓶中注入50mL 二次蒸餾水，通氮氣 30min 后，依次加入 0. 0913g(4. 0X l(T4mol) CdCl2 · 2. 5H20 和 0. 0909g(8. 0X l(T4mol) MA .HCl (巰基乙胺 鹽酸鹽)，用Imol化―1的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至5. 00，繼續(xù)通氮氣30min 后，注入步驟(1)新鮮制備的NaHTe 80 μ L(4. 0X 10_5mOl)，在50°C水浴中恒溫回流90min， 得橙紅色澄清的CdTe/MA量子點(QDs)溶液，于8°C冰箱保存(溶液最終濃度以Te_計為 8X l(T4mol .LiCd2+Je-和 MA 按摩爾 1 :0.1: 2 配比)。把 CdTe/MA QDs 裝于處理后的截留分子量為HOOODa的透析袋中，于8°C冰箱中用二次蒸餾水透析4天(每隔2 4h換水)，避光置于冰箱中8°C條件下保存。
(3)基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備準確稱取0. 0092g(4. 8X 10_5mol) 碳二亞胺(EDC)溶于0.5mL 2· 4X 10_2mOl/L乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA) (4.8X10-5mol)堿性水溶液(pH為7. 5)中，置于25°C水浴中攪拌活化IOmin后，在均勻攪拌下滴加5. OmL純化的CcTTe/MA QDs溶液(以MA的量計為9. 6 X 10_5mol)，控制摩爾比 QDs EDC EGTA=I 0. 5 0. 5，避光繼續(xù)攪拌反應60min。反應結(jié)束后，放入冰箱8°C 過夜終止反應，得到基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA。
實施例3
(1)制取NaHTe 向裝有攪拌磁子的小玻璃瓶中依次加入1. OmL N2飽和的二次蒸餾水，0. 0567g (1. 5 X 10_3mol) NaBH4 (易吸潮，稱量時動作要快)，并輕輕振蕩小瓶，使之完全溶解，然后加入0. 0638g(5.0X10-4mol)Te粉。蓋上帶導氣管的膠塞，并把導氣管插到液面下液封，然后置于恒溫磁力攪拌器上，在60°C水浴下恒溫反應lOmin，待黑色Te粉完全消失，溶液呈透明后置于6°C冰箱下恒溫反應lOmin，底部出現(xiàn)白色沉淀Na2B4O7，得到淺紫色透明的上清液，即0. 5mol · L—1的NaHTe水溶液(Te和NaBH4按摩爾1 3配比)。
(2)制取CcTTe/MA:在IOOmL的三頸圓底燒瓶中注入50mL 二次蒸餾水，通氮氣 30min 后，依次加入 0. 0913g(4. OX l(T4mol)CdCl2 · 2. 5H20 和 0. 1363g(l. 2X10_3mol) MA · HCl (巰基乙胺·鹽酸鹽)，用Imol · L—1的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至6. 0，繼續(xù)通氮氣 30min后，注入步驟(1)新鮮制備的NaHTe 400 μ L (2. O X I(T4moI)，在120°C水浴中恒溫回流lOmin，得橙紅色澄清的CdTe/MA量子點(QDs)溶液，于6°C冰箱保存(溶液最終濃度以丁‘計為斗父川^！^^廣丄^久丁‘和嫩按摩爾丄0.5 3配比)。把CdTe/MA QDs裝于處理后的截留分子量為HOOODa的透析袋中，于6°C冰箱中用二次蒸餾水透析4天(每隔 2 4h換水)，避光置于冰箱中6°C條件下保存。
( 基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備準確稱取 0. 0368g(l. 92X ΙΟΛιοΙ)碳二亞胺(EDC)溶于 4. OmL 2. 4Χ l(T2mol/L 乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA) (3. 84X ΙΟΛιοΙ)堿性水溶液(pH為9. 0)中，置于60°C水浴中攪拌活化 Imin后，在均勻攪拌下滴加5. OmL純化的CdTe/MA QDs溶液(以MA的量計為9. 6 X 10_5mol)， 控制摩爾比QDs EDC EGTA=I 2 4，避光繼續(xù)攪拌反應lOmin。反應結(jié)束后，放入冰箱6°C過夜終止反應，得到基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA。
對比實施例1
(1)制取NaHTe 同實施例3步驟(1)。
(2)制取CdTe/MA 同實施例3步驟(2)。
( 基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備準確稱取 0. 0368g(l. 92Xl(T4mol)碳二亞胺(EDC)溶于 4. OmL 2. 4X l(T2mol/L 乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA) (3.84X10_4mOl)堿性水溶液(pH為13.0)中，置于60°C水浴中攪拌活化Imin后，在均勻攪拌下滴加5. OmL純化的CdTe/MA QDs溶液(以MA的量計為 9. 6X 10_5mol)即出現(xiàn)沉淀，未能成功制備CdTe/MA-EGTA探針。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)制備碲氫化鈉將隊飽和的二次蒸餾水和硼氫化鈉混合后，再加入碲粉，于25 60°C水浴下恒溫反應10 60min，待黑色Te粉完全消失，溶液呈無色透明后置于4 8 V 反應10 60min，底部出現(xiàn)白色沉淀硼酸鈉，得到的上清液即為無色透明的NaHTe水溶液； 其中，碲粉和硼氫化鈉按摩爾比1 1.8 4配比；(2)制備CdTe/MA量子點在通過氮氣除氧得到的二次蒸餾水中依次加入氯化鎘和巰基乙胺·鹽酸鹽，將PH值調(diào)為5.0 6.0后繼續(xù)通氮后注入步驟(1)制備的NaHTe水溶液，于50 120°C恒溫回流10 90min，得到橙紅色澄清的CcTTe/MA QDs溶液，于4 8°C 保存；其中，氯化鎘、NaHTe水溶液以及巰基乙胺·鹽酸鹽的用量按照如下方法計算Cd2+、 iTe-和MA按摩爾1 (0.1 0.5) O 3)配比；(3)制備基于量子點的植物細胞鈣離子探針將碳二亞胺溶于乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸堿性水溶液中，置于25 60°C水浴中攪拌活化1 IOmin后，在均勻攪拌下加入步驟(2)制備的CdTe/MA QDs溶液，避光繼續(xù)攪拌反應10 60min ；反應結(jié)束后，于4 8°C放置過夜終止反應，得到基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA ；其中，碳二亞胺、乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸和CdTe/MA QDs溶液的用量按照如下方法計算 CdTe/MA QDs以步驟O)中加入的巰基乙胺計，碳二亞胺、乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸和CdTe/MAQDs按摩爾比1 (0. 5 2) (0. 5 4)配比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的Te和所述的NaBH4按摩爾比1 1. 8 3配比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的隊飽和的二次蒸餾水的用量根據(jù)硼氫化鈉溶解后濃度為lmol/L進行計算。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于步驟O)中所述的二次蒸餾水的用量根據(jù)氯化鎘溶解后濃度為0.008mol/L進行計算。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于步驟O)中所述的pH值通過氫氧化鈉進行調(diào)節(jié)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于步驟( 中所述的CdTe/MA QDs溶液還通過如下步驟處理于4 8°C用二次蒸餾水和截留分子量為HOOODa的透析袋對所述的CdTe/MA QDs溶液進行透析，透析后的CdTe/MA QDs溶液于4 8 °C避光保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法，其特征在于步驟⑶中所述的乙二醇雙(乙二氨乙基醚)四乙酸堿性水溶液的PH值為7 9。
8.一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針，通過權(quán)利要求1 7任一項所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針的制備方法制備得到。
9.權(quán)利要求8所述的基于量子點的植物細胞鈣離子探針在細胞內(nèi)游離鈣離子濃度監(jiān)測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于量子點的植物細胞鈣離子探針及其制備方法與應用。本發(fā)明通過將硼氫化鈉和碲粉進行反應，碲粉和硼氫化鈉按摩爾比1∶1.8～4配比，得到NaHTe水溶液；接著將氯化鎘、巰基乙胺·鹽酸鹽和前述的NaHTe水溶液反應，得到橙紅色澄清的CdTe/MA QDs溶液；再將EDC、EGTA和前述的CdTe/MA QDs溶液反應，得到基于量子點的植物細胞鈣離子探針CdTe/MA-EGTA，并用于監(jiān)測擬南芥葉肉細胞中鈣離子濃度水平變化。本發(fā)明基于量子點的發(fā)光特性，在量子點的表面引入EGTA，獲得一種能特異性識別鈣離子的探針。該探針具有抗光漂白性，能特異性識別鈣離子，且靈敏度比傳統(tǒng)熒光染料探針Fluo-3高。本發(fā)明提供的制備方法，反應條件簡單，操作方便，得到的探針有利于實時監(jiān)測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。
文檔編號C09K11/88GK102517023SQ201110404498
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者俞英, 夏金枝, 廖球梅 申請人:華南師范大學