專利名稱：水相碳化硅量子點及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及量子點的生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無細胞毒性水相碳化硅量子點及其制備方法，以及該量子點在對活體細胞熒光標記中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
伴隨C60、納米碳管和石墨烯等納米碳材料的發(fā)展，量子點由于其卓越的熒光性能和在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，逐漸成為人們研究的熱點，其合成方法主要分為有機相合成和水性合成。有機相合成的量子點由于不具備親水性，因此不能直接應(yīng)用于生物體系，必須對其進行表面修飾及生物功能化處理，操作過程復(fù)雜，條件要求較高； 水相合成量子點的方法由于綠色、價廉，越來越受到重視，有關(guān)這方面的研究工作進展較快。最新的研究結(jié)果表明，目前普遍采用的量子點存在Cd、Se等有毒元素，雖然有研究表明經(jīng)過表面包裹的量子點毒性會大大降低，但對生命體的毒害富集及對活體細胞、組織長時間段生長生理的影響還是不容忽視的。同時，量子點原料及制備過程中的毒性物質(zhì)對環(huán)境及操作者均有不良影響。除此之外，量子點尺寸結(jié)構(gòu)難以有效調(diào)控也是制約該生物納米材料進一步發(fā)展的重要因素。因此，利用水相法制備出無細胞毒性、表面結(jié)構(gòu)及尺寸可控的量子點材料已成為當前生物學(xué)及材料學(xué)界的共識。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上問題，本發(fā)明提供了一種水相碳化硅量子點及其制備方法，并將其成功的首次應(yīng)用于活體細胞熒光染色。本發(fā)明所述的水相碳化硅量子點材料中碳化硅量子點濃度為0. 03-0. 06mol/L,量子點呈近球狀，直徑為2-5nm。為了適應(yīng)后期該材料在活體細胞上的應(yīng)用，該水相碳化硅量子點材料的pH值為6. 4-6.8。其制備的具體步驟為A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻；B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌反應(yīng)，^ -SiC顆粒粒徑為50-100nm ；C.將步驟B中的混合物靜置反應(yīng)；D.將上述混合物離心后，抽出腐蝕液，加入高純水，利用高純水對腐蝕后的SiC顆粒進行離心清洗；E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理；F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液進行離心處理，取上清液即為碳化硅量子點熒光標記材料,離心速度為2800-3000rpm。首先，本發(fā)明將市購的濃硝酸及氫氟酸用高純水稀釋至適宜的濃度，并配置成腐蝕液。發(fā)明人經(jīng)過多次實驗證明，稀釋后的氫氟酸與硝酸溶液的最佳比例是3 :1，由于后期的腐蝕過程為放熱過程，若兩種酸性溶液的配比超過此比例，反應(yīng)極為劇烈，實驗過程較難控制；若低于此比例，反應(yīng)較為緩慢，最終得到的量子點較少。本發(fā)明采用的原料為自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC顆粒(中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所提供)，之所以選用自蔓延燃燒合成的P-SiC顆粒，是因為在其自蔓延燃燒反應(yīng)過程中迅速冷卻，從而形成非平衡結(jié)晶條件，使得3 -Sic顆粒表面形成較多缺陷(晶格畸變等)，活性較高，腐蝕激活能較低，極易在氫氟酸溶液中腐蝕形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為后期通過超聲空化作用獲得細小近球狀量子點奠定了條件。另外，本發(fā)明所述的腐蝕液中的硝酸具有氧化性，進一步增強了腐蝕液的腐蝕性能，達到了更好的腐蝕效果。該方法摒棄了化學(xué)合成法制備的SiC必須采用電化學(xué)腐蝕才能形成量子點納米顆粒的傳統(tǒng)。P-SiC顆粒粒徑越小，越易腐蝕成通透型的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，獲得的量子點數(shù)量越多，即量子產(chǎn)率約高；若粒徑太大，則不能刻蝕成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，形成的量子點較少。為了獲得較多且粒徑可控的量子點，P-SiC顆粒粒徑為50-100nm。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當P-SiC顆粒置于腐蝕液內(nèi)時，會放出大量熱，還產(chǎn)生一定氣 體，由于P-SiC顆粒很小，附著在水泡表面，會形成比較大的氣泡而且不易破裂，所以，剛開始P-SiC顆粒與腐蝕液先在室溫下攪拌反應(yīng)，使氣泡破碎的同時盡快釋放掉熱量，保證反應(yīng)平穩(wěn)，一般反應(yīng)10分鐘即可，該過程發(fā)生的反應(yīng)是SiC+2HN03+2H20 — 2HN02+40H>SiC4+ (I)40H>SiC4+— Si02+C02+2H2(2)待反應(yīng)趨于平穩(wěn)后，為了保證較快的腐蝕速度以及較好的控制反應(yīng)，將其置于60-80°C反應(yīng)。P -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入60g-80g@ -SiC顆粒。該過程反應(yīng)化學(xué)方程式為Si02+6HF — H2SiF6+2H20 (3)在整個腐蝕過程中，氫氟酸對C-Si鍵的解離作用和硝酸的氧化作用使得P -SiC顆粒表面形成羥基及氧基等親有機物活性基團，3 -SiC顆粒被腐蝕成多孔網(wǎng)格狀。由于腐蝕后整個體系呈強酸性，pH值可達I. 0左右，當將其應(yīng)用于活體細胞熒光標記時，對于活體細胞來說生長極為不利，因此，必須對其進行降酸處理。由于腐蝕后P-SiC顆粒在整個體系中呈懸浮狀，所以本發(fā)明采用離心處理，使得腐蝕后具有網(wǎng)格狀的3-SiC顆粒與腐蝕液迅速分離。將上述混合物離心分離后，抽出上層腐蝕液，加入高純水200-400ml，攪拌5分鐘，再對其進行上述操作，反復(fù)進行4到5次，使最終得到溶液體系PH值適應(yīng)于所采用的活體細胞，一般情況下溶液體系pH值在6. 4-6. 8。將降酸處理后的碳化硅顆粒懸浮液導(dǎo)入玻璃杯，在超聲波分散儀內(nèi)對水相溶液進行超聲處理20分鐘，超聲波分散儀輸出功率為lkW，頻率為15kHz。這主要是利用水溶液在超聲波內(nèi)的空化作用，將具有網(wǎng)格狀的P-SiC顆粒打破成更小的納米級顆粒而成為量子點落入水溶液中，且量子點表面會形成0基及COO基等親有機物活性基團，由此可以與蛋白質(zhì)、離子等物質(zhì)結(jié)合，本發(fā)明一步法實現(xiàn)了量子點合成與表面生物功能化修飾，提高了制備效率。對于不同尺寸的納米粒子，采用離心處理而后通過層析剪裁，可以獲得尺寸單分散的納米顆粒，因此本發(fā)明采用高速離心使得不同粒徑量子點顆粒分布于上清液不同部位，從而達到量子點尺寸可控。離心速度決定了離心力大小，轉(zhuǎn)速太小，腐蝕的粉體顆粒懸浮在溶液，得到的量子點粒子直徑較大；轉(zhuǎn)速太大，懸浮在上清液的量子點粒子數(shù)量太少，濃度較低，本發(fā)明離心轉(zhuǎn)速采用2800-3000rpm比較適宜，最終得到的溶液體系中碳化硅量子點濃度為0. 03-0. 06mol/L，可見光下呈淡黃綠色，量子點呈近球狀，直徑為2_5nm。為了適應(yīng)后期在活體細胞上的應(yīng)用，水相碳化硅量子點材料的PH值為6. 4-6. 8。由于本發(fā)明制得的水相碳化硅量子點材料無細胞毒性，且遠小于碳化硅體材料的激子波爾(Bohr)半徑，所以熒光效果明顯，因此發(fā)明人將該材料用作熒光標記材料，直接將其添加到活體細胞的培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中即可實現(xiàn)熒光標記，可以長時間成像，方便人們在熒光顯微鏡下觀察活體細胞的形貌。本發(fā)明所述的活體細胞為植物或微生物活體細胞。
綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點I)該水相法制備的碳化硅量子點無細胞毒性，且表面具有氧基、羧基等親有機物活性基團，不會影響活體細胞生長生理機能，可以對其實現(xiàn)長時程熒光標記成像。2)制備工藝簡單，摒棄了現(xiàn)有技術(shù)中采用的是電化學(xué)腐蝕方法，而采用直接腐蝕的方法，工藝參數(shù)易于控制，成本低廉，可一步法實現(xiàn)量子點合成與表面生物功能化修飾。3)通過超聲分散及高速離心處理后，可實現(xiàn)對量子點尺寸的有效調(diào)控，制備出的量子點材料遠小于碳化硅體材料的激子波爾(Bohr)半徑，其光致發(fā)光效應(yīng)顯著，發(fā)射光強更強，熒光效果更為明顯。


圖I是自蔓延合成的P -SiC顆粒腐蝕后網(wǎng)格狀微觀組織形貌，該形貌為下一步通過超聲空化作用獲得細小近球狀量子點奠定了條件。圖2是水相碳化硅量子點材料可見光下顏色及微觀結(jié)構(gòu)的TEM照片，量子點近球狀，(110)晶面間距約2nm，該量子點可以有較強的光致發(fā)光效果。圖3是水相碳化娃量子點材料應(yīng)用于出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpulluans948)活體細胞的2天及4天突光標記成像灰度圖；圖4為水相碳化硅量子點材料應(yīng)用于擬南芥根部活體細胞后的光學(xué)與熒光標記成像灰度圖。
具體實施例方式實施例1-5本發(fā)明所述的水相碳化硅量子點材料及其制備方法；實施例6-7為本發(fā)明制得的水相碳化硅量子點材料在活體細胞熒光標記中的應(yīng)用。所用的自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC顆粒由中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所提供。實施例I一種水相碳化硅量子點材料，其pH值為6. 4，碳化硅量子點濃度為0. 03mol/L,量子點呈近球狀，直徑為5nm。其具體制備步驟為A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻；B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌10分鐘，其中，P -SiC顆粒粒徑為70nm，^ -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入80g P-SiC顆粒；
C.將步驟B中的混合物于75°C腐蝕I小時；D.將上述混合物于600rpm低速離心后，抽出腐蝕液，加入高純水200ml，攪拌5min，離心分離后再對其進行上述操作，反復(fù)離心清洗至溶液體系pH值在6. 4。E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理，超聲功率為lkW，頻率為15kHz，超聲時間 20min ；F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液于2800rpm高速離心處理，取上清液即為碳化硅量子點突光標記材料。實施例2一種水相碳化硅量子點材料，其pH值為6. 5，碳化硅量子點濃度為0. 06mol/L,量子點呈近球狀，直徑為2nm。其具體制備步驟為 A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻；B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌10分鐘，其中，P -SiC顆粒粒徑為50nm，^ -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入70g P-SiC顆粒；C.將步驟B中的混合物于65°C腐蝕I小時；D.將上述混合物于800rpm低速離心后，抽出腐蝕液，加入高純水300ml，攪拌5min，離心分離后再對其進行上述操作，反復(fù)離心清洗至溶液體系pH值在6. 5。E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理，超聲功率為lkW，頻率為15kHz，超聲時間 20min ；F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液于3000rpm高速離心處理，取上清液即為碳化硅量子點突光標記材料。實施例3一種水相碳化硅量子點材料，其pH值為6. 6，碳化硅量子點濃度為0. 04mol/L,量子點呈近球狀，直徑為3nm。其具體制備步驟為A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻；B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌10分鐘，其中，^ -SiC顆粒粒徑為lOOnm，^ -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入60g P-SiC顆粒；C.將步驟B中的混合物于70°C腐蝕I小時；D.將上述混合物于500rpm低速離心后，抽出腐蝕液，加入高純水400ml，攪拌5min，離心分離后再對其進行上述操作，反復(fù)離心清洗至溶液體系pH值在6. 6。E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理，超聲功率為lkW，頻率為15kHz，超聲時間 20min ；F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液于2900rpm高速離心處理，取上清液即為碳化硅量子點突光標記材料。
實施例4一種水相碳化硅量子點材料，其pH值為6. 7，碳化硅量子點濃度為0. 05mol/L,量子點呈近球狀，直徑為4nm。其具體制備步驟為A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻；B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌10分鐘，其中，P -SiC顆粒粒徑為60nm，^ -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入65g P-SiC顆粒；C.將步驟B中的混合物于60°C腐蝕I小時；
D.將上述混合物于700rpm低速離心后，抽出腐蝕液，加入高純水220ml，攪拌5min，離心分離后再對其進行上述操作，反復(fù)離心清洗至溶液體系pH值在6. 7。E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理，超聲功率為lkW，頻率為15kHz，超聲時間 20min ；F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液于2800rpm高速離心處理，取上清液即為碳化硅量子點突光標記材料。實施例5一種水相碳化硅量子點材料，其pH值為6. 8，碳化硅量子點濃度為0. 03mol/L,量子點呈近球狀，直徑為2nm。其具體制備步驟為A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻；B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌10分鐘，其中，P -SiC顆粒粒徑為80nm，^ -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入75g P-SiC顆粒；C.將步驟B中的混合物于80°C腐蝕I小時；D.將上述混合物于650rpm低速離心后，抽出腐蝕液，加入高純水330ml，攪拌5min，離心分離后再對其進行上述操作，反復(fù)離心清洗至溶液體系pH值在6. 8。E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理，超聲功率為lkW，頻率為15kHz，超聲時間 20min ；F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液于3000rpm高速離心處理，取上清液即為碳化硅量子點突光標記材料。實施例6I、出芽短梗霉菌(Aureobasidium pulIuans 948)培養(yǎng)條件斜面培養(yǎng)基(W/V):蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 6. 0121°C滅菌20mino種子液培養(yǎng)基(W/V):2%葡萄糖，2% 酵母膏，0. 5%K2HP04，0. l%NaCl，
0.02%MgS04 7H20，0. 06%(NH4)2SO4,初始 pH 6. 5，8 磅滅菌(121°C ) 20min ；發(fā)酵培養(yǎng)基4%葡萄糖，2% 酵母膏，0. 5%K2HP04,0. l%NaCl,0. 02%MgS04 7H20,0.06%(NH4)2SO4,初始pH 6. 5，8磅滅菌(121°C )20min ;配成60ml溶液，向溶液中加入5ml實施例I制得的水相碳化娃量子點材料。2、實驗方法將生化培養(yǎng)箱內(nèi)保藏的斜面菌種刮取兩環(huán)到配好的種子培養(yǎng)基內(nèi)進行活化，28°C，200r/min，培養(yǎng)2天。再將活化的菌種以7%的接種量將種子液菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-4天后，在熒光顯微鏡下觀察活體細胞形貌。通過實施例6和圖3可知I、本專利制備的SiC熒光材料無細胞毒性，對于活體細胞生長無影響，可以顯示出芽短梗霉菌在不同時間段內(nèi)的形貌(開始時為粒狀，球狀，而長時間生長后則變成絲須狀)；2、出芽短梗霉菌細胞可以長時間發(fā)熒光，說明SiC熒光材料不易被淬滅；3、在培養(yǎng)液內(nèi)添加SiC熒光材料即可實現(xiàn)熒光染色，方法簡便有效。實施例I 將擬南芥(Arobidopsis thaliana L.)(生態(tài)型為Columbia)種子經(jīng)過消毒以后散布在GM基本培養(yǎng)基上，其中添加體積比40%的實施例3制得的水相碳化硅量子點材料。4°C放置4天后移至生長室培養(yǎng)，溫度為20-22°C，光照條件為16小時光照，8小時黑暗，幼苗生長10天后用于觀察根部切片在熒光顯微鏡下觀察細胞結(jié)構(gòu)與形貌。通過實施例7以及圖4可知I、本專利制備的SiC熒光材料無細胞毒性，對于活體細胞生長無影響，可以顯示出擬南芥根部的形貌，并且根部不同部位熒光強弱有所差別，生長旺盛的部位(根突部位)熒光比較強烈；2、擬南芥根部細胞可以長時間發(fā)熒光，說明SiC熒光材料不易被淬滅；3、在 培養(yǎng)液內(nèi)添加SiC熒光材料即可實現(xiàn)熒光染色，方法簡便有效。
權(quán)利要求
1.一種水相碳化硅量子點材料，其特征在于碳化硅量子點濃度為0. 03-0. 06mol/L,量子點呈近球狀，直徑為2-5nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水相碳化硅量子點材料，其特征在于水相碳化硅量子點材料的pH值為6. 4-6.8。
3.制備如權(quán)利要求I或2所述的水相碳化硅量子點材料的方法，其特征在于其具體步驟為 A.將質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸和質(zhì)量濃度為65%的硝酸按照體積比3:1配制成腐蝕液，并攪拌均勻； B.將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米P-SiC粉末置于步驟A配置的腐蝕液中，攪拌反應(yīng)，3 -SiC顆粒粒徑為50-100nm C.將步驟B中的混合物靜置反應(yīng)； D.將上述混合物離心后,抽出腐蝕液,加入高純水,利用高純水對腐蝕后的SiC顆粒進行離心清洗； E.對離心清洗后的水溶液進行超聲處理； F.對經(jīng)過超聲處理的水溶液進行離心處理，取上清液即為碳化硅量子點熒光標記材料,離心速度為2800-3000rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水相碳化硅量子點材料的制備方法，其特征在于步驟B中^ -SiC顆粒與腐蝕液的混合比例為每IOOml腐蝕液中加入60g-80g 3 -SiC顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水相碳化硅量子點材料的制備方法，其特征在于步驟C中反應(yīng)溫度為60°C _80°C，反應(yīng)時間為I小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水相碳化硅量子點材料的制備方法，其特征在于步驟D中離心速度為500-800rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水相碳化硅量子點材料的制備方法，其特征在于步驟D中離心清洗后溶液體系PH值為6. 4-6. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水相碳化硅量子點材料的制備方法，其特征在于步驟E中超聲功率為lkW，頻率為15kHz，超聲時間為20min。
9.一種權(quán)利要求I或2所述的水相碳化硅量子點材料用于熒光標記材料的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及量子點的生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無細胞毒性水相碳化硅量子點及其制備方法，以及該量子點作為熒光材料的應(yīng)用。本發(fā)明首先采用硝酸和氫氟酸混合配制的腐蝕液將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)納米β-SiC顆粒腐蝕成為網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，然后通過超聲波的空化效應(yīng)將其打破，形成不同粒徑的碳化硅納米顆粒，最后通過高速離心作用獲得粒徑可控的量子點，并將這些量子點首次成功的應(yīng)用于活體細胞的熒光標記成像。本發(fā)明工藝簡單，成本低廉，工藝參數(shù)易于控制，制得的量子點無毒、生物相容性較好，光致發(fā)光效應(yīng)顯著，可以應(yīng)用于活體細胞長時程熒光標記。
文檔編號C09K11/65GK102719248SQ20121020838
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者孫祥鳴, 宋月鵬, 張麗麗, 李永, 李江濤, 柳洪潔, 許令峰, 高東升 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)