一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)熒光分析【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子及其制備方法和應(yīng)用。該熒光納米復(fù)合粒子的制備包括以下步驟：先將羅丹明6G溶解于蒸餾水中，再用巰基化學(xué)物功能化得到羅丹明6G巰基功能化的化學(xué)物，利用硅源前驅(qū)物在高溫和高壓下水解與縮合，制備得到羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。該熒光復(fù)合物不易泄露，經(jīng)過多次水洗，仍有較強(qiáng)的熒光特性。通過改變硅源前驅(qū)物、NH3·H2O兩者的比例可以制備出不同粒徑大小的二氧化硅包覆熒光素。本發(fā)明的復(fù)合熒光物其外殼二氧化硅有生物親和性，可以用于蛋白質(zhì)的標(biāo)記，成為納米生物標(biāo)記的新型材料。該熒光納米顆粒的標(biāo)記方法也為生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)提供了一種新型的分析方法。
【專利說明】一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)熒光分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有高穩(wěn)定性和抗漂白性的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在生物學(xué)與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域里，探索和發(fā)展高靈敏度的非同位素檢測(cè)方法一直是研究者十分關(guān)注的課題，其中熒光分析法是一種重要的非同位素方法，熒光標(biāo)記生物分子(如蛋白質(zhì))在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究各領(lǐng)域里發(fā)揮了重要的作用。但傳統(tǒng)的熒光分析方法存在一些難以克服的缺陷，1、多數(shù)熒光試劑存在光漂白的現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光信號(hào)不穩(wěn)定；2、熒光泄露現(xiàn)象嚴(yán)重；3、熒光試劑及其光解產(chǎn)物對(duì)活體細(xì)胞有一定的毒副作用；4、傳統(tǒng)的生物分子熒光標(biāo)記方法，只能在生物分子的活性基團(tuán)上連接少數(shù)的幾個(gè)熒光分子，分析靈敏度有限。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合了納米技術(shù)與材料制備技術(shù)而發(fā)展起來的復(fù)合熒光染料顆粒的制備為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的材料、技術(shù)和方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種熒光泄漏少，光化學(xué)穩(wěn)定性高的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法；
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法得到的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子；
[0005]本發(fā)明的再一目的在于提供上述羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，包括以下操作步驟:
[0007](I)將摩爾比為1:5~5:1的巰基化合物與羅丹明6G(Rhodamine6G)溶解在蒸餾水中反應(yīng)，得到混合液；
[0008](2)將步驟(1)所得混合液在保護(hù)氣體氛圍下，在低溫5°C~15°C且黑暗條件中進(jìn)行反應(yīng)；
[0009](3)加入硅源前驅(qū)物、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于溫度50°C -150°C條件和1.5-4.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓條件下進(jìn)行反應(yīng)，所述硅源前驅(qū)物與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為300:1~900:1 ;
[0010](4)將步驟(3)所得產(chǎn)物離心分離、洗滌，得到羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0011]步驟(1)所述巰基化合物為巰基乙醇、巰基乙酸、苯硫酚或半胱氨酸。
[0012]步驟(3)所述硅源前驅(qū)物為正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或硅酸鈉。
[0013]步驟(1)所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為100:1~200:1。
[0014]步驟(2)所述保護(hù)氣體為氮?dú)饣驓鍤狻?br> [0015]步驟(3)所述硅源前驅(qū)物、氨水和蒸餾水的體積比為1:1: 20~1: 4: 50。
[0016]一種根據(jù)上述方法制備的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0017]上述羅丹明熒光納米復(fù)合粒子在生物標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是在細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
[0018]上述的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子在生物標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是在細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0020]本發(fā)明羅丹明熒光納米復(fù)合粒子具備良好的生物安全性，易與各種生物分子通過多種方式偶聯(lián)，可以用來標(biāo)記生物大分子，不會(huì)對(duì)生理活動(dòng)造成危害；通過外殼材料的包被可以避免外界環(huán)境因素對(duì)粒子中熒光染料Rhodamine6G的漂白作用，其光學(xué)穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的標(biāo)記法有明顯提高；包裹作用還能使更多的發(fā)光分子連接在生物分子上起到信號(hào)放大作用；該復(fù)合粒子不僅保持了染料分子的光學(xué)活性，而且染料在較大濃度下不會(huì)發(fā)生自聚、泄漏現(xiàn)象；本發(fā)明納米熒光復(fù)合型材料可應(yīng)用于檢測(cè)生命體系內(nèi)的痕量活性物質(zhì)，以便在細(xì)胞和單分子水平上獲取生命過程的化學(xué)與生物信息，了解生物分子及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對(duì)生命活動(dòng)機(jī)理的闡釋和疾病的早期診斷具有非常重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是羅丹明熒光復(fù)合粒子的TEM圖(透射電子顯微鏡圖)。
[0022]圖2是羅丹明及羅丹明熒光復(fù)合粒子的熒光泄露圖，a為羅丹明單體的熒光泄露，b為羅丹明熒光復(fù)合粒子的熒光泄露。
[0023]圖3是羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的激光共聚焦圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0025]實(shí)施例1
[0026](I)將摩爾比為1:5的巰基乙醇與羅丹明6G溶解在蒸餾水中，得到混合液；所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為100:1 ；
[0027](2)將步驟(1)所得混合液在氮?dú)夥諊?，在低?°C且黑暗條件中進(jìn)行偶合反應(yīng)12h,得至Ij Rhodamine6G_APS 溶液；
[0028](3)加入硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于45°C溫度下攪拌反應(yīng)12h，得到懸濁液；所述硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為300:1 ;硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水的體積比為1:1: 20;
[0029](4)將步驟(3)所得懸濁液離心分離(離心轉(zhuǎn)速為8000rm/min)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌兩次，得到粒徑50nm左右的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0030]經(jīng)TEM粒徑檢查，其羅丹明熒光納米復(fù)合粒子粒徑在50nm左右，粒子的分散性好，如圖1所示。
[0031]實(shí)施例2
[0032](I)將摩爾比為1:5的巰基乙酸與羅丹明6G溶解在蒸餾水中，得到混合液；所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為100:1 ；
[0033](2)將步驟⑴所得混合液在氮?dú)夥諊?，在低?5°C且黑暗條件中進(jìn)行偶合反應(yīng) 12h，得到 Rhodamine6G-APS 溶液；
[0034](3)加入硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于95°C溫度下攪拌反應(yīng)lh，得到懸濁液；所述硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為300:1 ;硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水的體積比為1:1: 20;
[0035](4)將步驟(3)所得懸濁液離心分離(離心轉(zhuǎn)速為8000rm/min)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌兩次，得到粒徑80nm左右的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0036]經(jīng)熒光泄露檢查，其羅丹明熒光納米復(fù)合粒子粒徑1800秒，熒光強(qiáng)度只減少13%，如圖2所示。
[0037]實(shí)施例3
[0038](I)將摩爾比為1:5的巰基乙酸與羅丹明6G溶解在蒸餾水中，得到混合液；所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為100:1 ；
[0039](2)將步驟⑴所得混合液在氮?dú)夥諊?，在低?0°C且黑暗條件中進(jìn)行偶合反應(yīng) 12h，得到 Rhodamine6G-APS 溶液；
[0040](3)加入硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于65°C溫度下攪拌反應(yīng)8h，得到懸濁液；所述硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為500:1 ;硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水的體積比為1: 3: 30;
[0041](4)將步驟(3)所得懸濁液離心分離(離心轉(zhuǎn)速為8000rm/min)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌兩次，得到粒徑IOOnm左右的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0042]經(jīng)激光共聚焦檢查，其羅丹明熒光納米復(fù)合粒子具有明顯的紅色熒光，如圖3(a)。
[0043]實(shí)施例4 [0044](I)將摩爾比為5:1的苯硫酚與羅丹明6G溶解在蒸餾水中，得到混合液；所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為200:1 ;
[0045](2)將步驟(1)所得混合液在氮?dú)夥諊?，在低?2°C且黑暗條件中進(jìn)行偶合反應(yīng) Ih,得到 Rhodamine6G_APS 溶液；
[0046](3)加入硅源前驅(qū)物正硅酸甲酯、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于55°C溫度下攪拌反應(yīng)5h，得到懸濁液；所述硅源前驅(qū)物正硅酸甲酯與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為800:1 ;硅源前驅(qū)物正硅酸甲酯、氨水和蒸餾水的體積比為1: 3: 40;
[0047](4)將步驟(3)所得懸濁液離心分離(離心轉(zhuǎn)速為8000rm/min)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌兩次，得到粒徑50nm左右的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0048]經(jīng)激光共聚焦檢查，其羅丹明熒光納米復(fù)合粒子具有明顯的紅色熒光，如圖3(b)
[0049]實(shí)施例5
[0050](I)將摩爾比為4:1的半胱氨酸與羅丹明6G溶解在蒸餾水中，得到混合液；所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為150:1 ;
[0051](2)將步驟(1)所得混合液在氬氣氛圍下，在低溫5°C且黑暗條件中進(jìn)行偶合反應(yīng)5h,得至Ij Rhodamine6G_APS 溶液；
[0052](3)加入硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于85°C溫度下攪拌反應(yīng)10h，得到懸濁液；所述硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為700:1 ;硅源前驅(qū)物正硅酸乙酯、氨水和蒸餾水的體積比為1: 4: 40;
[0053](4)將步驟(3)所得懸濁液離心分離(離心轉(zhuǎn)速為8000rm/min)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌兩次，得到粒徑50nm左右的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0054]實(shí)施例6[0055](1)將摩爾比為1:1的半胱氨酸與羅丹明6G溶解在蒸餾水中，得到混合液；所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為180:1 ；
[0056](2)將步驟(1)所得混合液在氬氣氛圍下，在低溫10°C且黑暗條件中進(jìn)
[0057]行偶合反應(yīng)6h，得到Rhodamine6G_APS溶液；
[0058](3)加入硅源前驅(qū)物硅酸鈉、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于75°C溫度下攪拌反應(yīng)3h，得到懸濁液；所述硅源前驅(qū)物硅酸鈉與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為400:1 ;硅源前驅(qū)物硅酸鈉、氨水和蒸餾水的體積比為1: 3: 30;
[0059](4)將步驟(3)所得懸濁液離心分離(離心轉(zhuǎn)速為8000rm/min)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌兩次，得到粒徑50nm左右的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
[0060]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟: (1)將摩爾比為1:5~5:1的巰基化合物與羅丹明6G溶解在蒸餾水中反應(yīng)，得到混合液； (2)將步驟(1)所得混合液在保護(hù)氣體氛圍下，在低溫5°C~15°C且黑暗條件中進(jìn)行反應(yīng)； (3)加入硅源前驅(qū)物、氨水和蒸餾水，置于密閉避光的容器中，于溫度50°C_150°C條件和1.5-4.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓條件下進(jìn)行反應(yīng)，所述硅源前驅(qū)物與步驟(1)所述羅丹明6G的摩爾比為300:1~900:1 ; (4)將步驟(3)所得產(chǎn)物離心分離、洗滌，得到羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于:步驟(I)所述巰基化合物為巰基乙醇、巰基乙酸、苯硫酚或半胱氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述硅源前驅(qū)物為正硅酸 乙酯、正硅酸甲酯或硅酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于:步驟⑴所述蒸餾水和羅丹明6G的摩爾比為100:1~200:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于:步驟(2)所述保護(hù)氣體為氮?dú)饣驓鍤狻?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述硅源前驅(qū)物、氨水和蒸餾水的體積比為1:1: 20~1: 4: 50。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述方法制備的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的羅丹明熒光納米復(fù)合粒子在生物標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C09K11/02GK104004511SQ201410183249
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】胡云睿, 張念椿, 馮衍秋, 陳武凡, 馮前進(jìn), 龔劍, 張志德, 盧廣文, 朱祥林 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)