氨基酸類雙光子熒光染料的制作方法
【專利摘要】氨基酸類雙光子熒光染料，所述熒光染料具有通式I的結(jié)構(gòu)。該類雙光子熒光染料在腫瘤活細(xì)胞中非核酸區(qū)域以及非腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有較低的熒光背景，在腫瘤活細(xì)胞中核酸區(qū)域內(nèi)具有較強的熒光信號，且對腫瘤活細(xì)胞內(nèi)核酸具有很強的專一性標(biāo)記。這類化合物具有一定水平的水溶性，同時具有良好的細(xì)胞膜通透性。并且還具有較大的有效的雙光子吸收截面。本發(fā)明的這類化合物同時還具有較低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異。。
【專利說明】氨基酸類雙光子熒光染料

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類含有氨基酸結(jié)構(gòu)的雙光子熒光染料、其制備方法，以及利用該類 熒光染料對腫瘤活細(xì)胞或組織中谷胱甘肽的識別及定量檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 核酸（Nucleic Acids)是細(xì)胞內(nèi)能夠起到生物體遺傳信息攜帶和傳遞的生物 大分子。核酸按其組成成分可分為核糖核酸（RNA)和脫氧核糖核酸（DNA)。DNA分子是 一類含有生物物種的遺傳信息的鏈狀結(jié)構(gòu)或者呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雙鏈分子，RNA分子是一類 負(fù)責(zé)DNA遺傳信息的翻譯和表達單鏈分子。核酸存在于所有動植物細(xì)胞、微生物體內(nèi)， 是生命的最基本物質(zhì)之一，對生物的生長、遺傳、變異等現(xiàn)象起著重要的決定作用。近些 年來，核酸除了具有原來已被研宄的作用之外，還被發(fā)現(xiàn)了新的作用，例如日本工業(yè)技術(shù) 院產(chǎn)業(yè)技術(shù)融合領(lǐng)域研宄所已經(jīng)研制出可治療白血病的人造核酸，此種核酸可主觀發(fā)現(xiàn) 引起白血病的遺傳基因并將其剪除，此種人造核酸將來有望成為治療白血病的主要藥物 (Nature，2000, 406, 473-474)。所以建立一種簡便的、快速的、有效的、靈敏的、特異性識別 腫瘤細(xì)胞內(nèi)的核酸以及可對其定量成像的技術(shù)或方法是一項重要的工作。
[0003] 現(xiàn)有識別及檢測核酸的方法種類很多，例如PCR技術(shù)、高效液相色譜法來分析、 紫外分光光度法等。但上述方法在實際成像應(yīng)用中存在以下缺陷：細(xì)胞膜的通透性差、無 法實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的選擇性問題等等。隨著顯微成像技術(shù)的發(fā)展，熒光染料在顯微成像 研宄中已經(jīng)成為最重要的依附工具。熒光標(biāo)記的光學(xué)分子成像為核酸的相關(guān)基礎(chǔ)研宄提 供了一種很好的解決方法。目前，菲啶類（EB、PI)、吖啶類（AO)、咪唑類（Hoechst、DAPI) 和花菁家族類（Cy、Τ0Τ0、SYT0)等熒光染料都已經(jīng)應(yīng)用到核酸相關(guān)研宄中。然而，這些染 料具有一些無法改變的缺點，比如：菲啶染料類中的溴化乙錠（EB)具有致癌性，GoldView 對皮膚、眼睛具有一定的刺激性等等。更重要的是，這些傳統(tǒng)的單光子熒光染料與新發(fā)展 起來的雙光子熒光染料相比，在近紅外激發(fā)、暗場成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激 發(fā)、高橫向分辨率與縱向分辨率、降低生物組織吸光系數(shù)及降低組織自發(fā)熒光干擾等方面 (Nature, 1999, 2:989-996. ；Science, 1997, 275:530. ；Angewandte Chemie International Edition, 2001，40:2098.)具有一定的缺陷。因此，構(gòu)建并制備低/無毒性、高膜通透性、可 選擇性識別腫瘤細(xì)胞中的核酸類雙光子染料仍然存在巨大挑戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的，首先在于提供一類氨基酸類雙光子熒光染料，所述染料具有通式I 的結(jié)構(gòu)：
[0005]
[0006] 通式I中：

【權(quán)利要求】
1. 氨基酸類雙光子熒光染料，具有通式I的結(jié)構(gòu)：
L#L2各自獨立地選自C卜8烷基、-0(CH2) n-、- (CH2)n0-、-0 (CH2)n0-、-NH(CH2) n-、- (CH2)nNH-和-NH(CH2)nNH-，其中n是 1-8 的整數(shù)。
2. 權(quán)利要求1所述的氨基酸類雙光子熒光染料，其特征在于：所述的R選自：
3. 權(quán)利要求1所述的氨基酸類雙光子熒光染料，其特征在于：所述的Li選自Ci_8烷 基、-0 (CH2)n-、-NH(CH2) n-、- (CH2)nNH-或-NH(CH2)nNH-。
4. 權(quán)利要求1所述的氨基酸類雙光子熒光染料，其特征在于：所述的L2選自Ci_8烷 基、-(CH2)n〇-、-〇 (CH2)n-或-〇 (CH2)n〇-。
5. 權(quán)利要求1所述的氨基酸類雙光子熒光染料，選自化合物Ai-A4:
o
6. 權(quán)利要求1所述的氨基酸類雙光子熒光染料的制備方法，包括如下步驟： 1)H-R-Br與濃硝酸按摩爾比1:1-1:5反應(yīng)，制備化合物H-R-N02; 反應(yīng)溫度為30-150°C，反應(yīng)時間為1-20小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 2) 化合物11-1?-腸2與化合物B:按摩爾比1:1-1:5反應(yīng)，制備化合物C2:
反應(yīng)溫度30-150°C，反應(yīng)時間1-10小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 3) 化合物C2與還原劑按摩爾比1:5-1:20反應(yīng)，制備化合物C3:
反應(yīng)溫度25-KKTC，反應(yīng)時間1-10小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；還原劑選自鋅粉、鐵粉、氯化亞錫和鈀碳； 4) 化合物(：3與化合物B2按摩爾比1:5-1:20反應(yīng)，制備化合物C4:
反應(yīng)溫度為25-90°C，反應(yīng)時間為1-10小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、乙酸乙酯或其混合物； 5) 化合物(；經(jīng)水解反應(yīng)制備化合物I，反應(yīng)體系加入1-10倍于化合物C4摩爾當(dāng)量的 三氟乙酸，醋酸或者氫氧化鈉； 反應(yīng)溫度為25-50°C，反應(yīng)時間為1-6小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 水或其混合物。
7. 權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的氨基酸類雙光子熒光染料在生物檢測與標(biāo)記 中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求7所述的氨基酸類雙光子熒光染料在生物檢測與標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在 于所述的生物檢測與標(biāo)記目標(biāo)物為腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織中的核酸。
【文檔編號】C09B15/00GK104479396SQ201410667110
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】仉華, 蔣濤, 聶亞敏, 陳粵華, 王魁, 蔣凱 申請人:河南師范大學(xué)