復(fù)合熒光微納米體系及其基于一鍋煮法的制備工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光微納米材料，具體是在復(fù)合熒光微納米體系及其基于一鍋煮法的制備工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光成像作為一種常見(jiàn)的成像技術(shù)，以其直觀(guān)、原位的可視化檢測(cè)手段在生物檢測(cè)識(shí)別、醫(yī)學(xué)影像等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用?；跓晒庑盘?hào)重建的熒光成像技術(shù)具有多個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如樣品穿透性強(qiáng)、極高的靈敏度和選擇性，顯示了較好的應(yīng)用前景。熒光成像探針在化學(xué)、生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但傳統(tǒng)有機(jī)染料小分子存在一些難以克服的缺陷，如:性質(zhì)不穩(wěn)定，容易被光漂白，不能長(zhǎng)期使用；有機(jī)染料不適合多色成像，只能被特定的波長(zhǎng)激發(fā)，需要多個(gè)激發(fā)光源才能實(shí)現(xiàn)同時(shí)多色顯示；激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不夠穩(wěn)定，容易隨周?chē)h(huán)境(如PH、溫度等)而變化；有機(jī)熒光染料的激發(fā)和發(fā)射光譜之間的斯托克斯位移較小，使其在動(dòng)物活體熒光成像時(shí)易受到激發(fā)光及來(lái)自動(dòng)物自身的背景的干擾。此外，有機(jī)熒光染料的生物安全性問(wèn)題也局限了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。
[0003]近年來(lái)隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，將靈敏度高的熒光分子與納米技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展制備包載熒光分子的具有微納米結(jié)構(gòu)的復(fù)合體系，將為克服上述問(wèn)題提供新的策略。以往文獻(xiàn)報(bào)道的微納米體系多采用磷脂，白蛋白，糖類(lèi)等作為基質(zhì)材料，構(gòu)建策略也以層層疊加、水-油-水、油_水-油微乳等方法為主，存在步驟復(fù)雜、體系穩(wěn)定性差等不足。而米用高聚物作為基質(zhì)材料雖然可以提高其穩(wěn)定性，但合成工藝復(fù)雜、產(chǎn)率較低，且多采用有毒、污染的有機(jī)溶劑作為介質(zhì)，所得到的聚合物體內(nèi)生物安全性尚無(wú)法評(píng)價(jià)。因此選擇理想的基質(zhì)材料、發(fā)展綠色、高效的構(gòu)建與制備工藝尤其重要。
[0004]聚丙烯酸丁酯是經(jīng)FDA認(rèn)證的生物醫(yī)學(xué)材料，在醫(yī)學(xué)、制藥等領(lǐng)域內(nèi)廣泛應(yīng)用，常被用作制備醫(yī)藥中間體、臨床止血?jiǎng)┑?。基于其良好的生物相容性和體內(nèi)可降解性，開(kāi)發(fā)新型包載熒光分子的復(fù)合微納米體系對(duì)發(fā)展新型生物探針、醫(yī)用造影劑、拓展熒光造影劑的制備工藝、提高熒光微納米探針的生物利用率、為熒光成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛適用具有推動(dòng)作用。同時(shí)，由于某些抗癌藥物分子本身具有熒光特性，發(fā)展包載抗癌藥物分子的微納米體系對(duì)于實(shí)現(xiàn)藥物在病灶區(qū)域的高特異性靶向與釋放，進(jìn)而實(shí)施疾病的早期診斷與治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種復(fù)合熒光微納米體系，該復(fù)合熒光微納米體系具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，所包載物質(zhì)兼具熒光成像與治療功能，有望在體內(nèi)標(biāo)記與示蹤、生物醫(yī)學(xué)影像、靶向診療一體化、藥物篩選與優(yōu)化等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，在生命健康與個(gè)性化醫(yī)療等方面產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種選擇性構(gòu)建上述復(fù)合熒光微納米體系一鍋煮的制備工藝，該制備工藝步驟簡(jiǎn)單、條件溫和、工藝綠色環(huán)保、能耗少、無(wú)三廢及輻射與噪聲等污染，分離與提純工藝操作簡(jiǎn)便，所得體系穩(wěn)定易于保存，是一種選擇性制備復(fù)合熒光微納米體系的通用工藝。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是該復(fù)合熒光微納米體系結(jié)構(gòu)為以聚丙烯酸丁酯為構(gòu)建基質(zhì)，包載組分為羅丹明、香豆素6、尼羅紅、喜樹(shù)堿、阿霉素中的一種或多種組合。
[0008]進(jìn)一步設(shè)置是以聚丙烯酸丁酯為構(gòu)建基質(zhì)，包載組分為羅丹明，該包載羅丹明的復(fù)合焚光微納米體系粒子直徑為1.60±0.16微米，電位為-46.76 ±6.96暈伏；或者該包載羅丹明的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為252.8±46.2納米，電位為-39.54±4.14毫伏。
[0009]進(jìn)一步設(shè)置是以聚丙烯酸丁酯為構(gòu)建基質(zhì)，包載組分為香豆素6，該包載香豆素6的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為4.17±0.96微米，電位為-53.55±4.01毫伏；或者該包載香豆素6的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為979.2 ±31.6納米，電位為-31.70 ± 1.80毫伏。
[0010]進(jìn)一步設(shè)置是以聚丙烯酸丁酯為構(gòu)建基質(zhì)，包載組分為尼羅紅，該包載尼羅紅的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為2.43±0.11微米，電位為-32.16±1.36毫伏，或者該包載尼羅紅的復(fù)合熒光微納米體系的粒子直徑為713.7± 14.1納米，電位為-34.92±0.84毫伏。
[0011]進(jìn)一步設(shè)置是以聚丙烯酸丁酯為構(gòu)建基質(zhì)，包載組分為喜樹(shù)堿，該包載喜樹(shù)堿的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為269.5 ±3.5納米，電位為-43.58 ± 1.97毫伏。
[0012]進(jìn)一步設(shè)置是以聚丙烯酸丁酯為構(gòu)建基質(zhì)，包載組分為阿霉素，該包載阿霉素的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為1.71 ±0.14微米，電位為-63.21 ± 1.96毫伏，或者該包載阿霉素的復(fù)合熒光微納米體系粒子直徑為283.4±2.4納米，電位為-24.73±12.12毫伏。
[0013]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟:
a.將1.5毫升丙烯酸丁酯單體與0.01-0.03毫摩爾熒光物質(zhì)按比例投料于含有穩(wěn)定劑的反應(yīng)體系；所述熒光物質(zhì)為丙羅丹明、香豆素6、尼羅紅、喜樹(shù)堿，阿霉素中的一種或多種組合。
[0014]b.將反應(yīng)體系酸堿度調(diào)至1.5-3.0，常溫?cái)嚢?-16小時(shí)后加入氫氧化鈉稀溶液終止反應(yīng);
c.反應(yīng)體系靜置4-7小時(shí)后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中分離提純；
d.棄去不含微納米體系的清液，以穩(wěn)定劑溶液洗滌、渦旋振蕩數(shù)次，至少重復(fù)離心步驟
2-4 次；
e.離心濃集后得復(fù)合熒光微納米體系。
[0015]本發(fā)明所述新型復(fù)合熒光微納米體系及一鍋煮法選擇性構(gòu)建方法對(duì)發(fā)展新型生物探針、拓展熒光造影劑的制備工藝、提高熒光微納米探針的生物利用率、實(shí)現(xiàn)熒光治療藥物的靶向與釋放及疾病的早期診斷與治療具有重要意義。
[0016]本發(fā)明得到包載羅丹明、香豆素6、尼羅紅、喜樹(shù)堿、阿霉素的多種復(fù)合熒光微納米體系，其通用結(jié)構(gòu)與工藝、樣品實(shí)例如圖1、2所示。體系粒度分布、表面電位表征及多分布指數(shù)可由激光粒度儀測(cè)量得到(如圖3)。包載羅丹明的復(fù)合熒光微納米體系可用于裸鼠皮下注射的熒光標(biāo)記與示蹤，其二維熒光成像效果如圖4得到確認(rèn)。包載阿霉素的復(fù)合熒光微納米體系可用于細(xì)胞層面的標(biāo)記與示蹤，將其與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)，在倒置熒光顯微鏡下可清晰觀(guān)察到細(xì)胞標(biāo)記圖像(如圖5)，從而確認(rèn)該復(fù)合熒光微納米體系在細(xì)胞標(biāo)記與示蹤、熒光治療藥物的靶向與釋放及疾病的診療一體化等方面的廣闊應(yīng)用前景。
[0017]下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1本發(fā)明所涉及的復(fù)合熒光微納米體系的通用結(jié)構(gòu)與工藝；
圖2新型復(fù)合熒光微納米體系樣品圖(從左向右依次為包載羅丹明、香豆素6、尼羅紅、喜樹(shù)堿、阿霉素的復(fù)合熒光微納米體系，對(duì)應(yīng)實(shí)施例1-9);
圖3新型復(fù)合熒光微納米體系的粒度分布與電位表征圖(a-1分別為包載羅丹明、香豆素6、尼羅紅、喜樹(shù)堿、阿霉素的復(fù)合熒光微納米體系，對(duì)應(yīng)實(shí)施例1-9)；
圖4包載羅丹明的復(fù)合熒光微納米體系用于裸鼠皮下注射的熒光成像圖；
圖5包載阿霉素的復(fù)合熒光微納米體系用于HeLa細(xì)胞標(biāo)記示意圖(左圖為明場(chǎng)圖像，右圖為熒光圖像)。
[0019]
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0021]本發(fā)明所米用的制備原料均為商品獲得。
[0022]實(shí)施例1:將丙烯酸丁酯(1.5毫升)、聚乙二醇辛基苯基醚水溶液(250毫升)、羅丹明(9.6毫克)投料入500毫升燒杯，反應(yīng)體系酸堿度調(diào)節(jié)至2.5。常溫下高速攪拌I小時(shí)后加入氫氧化鈉稀溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至分液漏斗靜置6小時(shí)，棄去底層反應(yīng)殘留物。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中純化離心20分鐘，小心收集頂層產(chǎn)物層，并以聚乙二醇辛基苯基醚溶液清洗。至少重復(fù)以上步驟2-4次，濃集后重新分散到聚乙二醇辛基苯基醚溶液中，并于室溫下保存。經(jīng)激光粒度儀測(cè)量，包載羅丹明的復(fù)合熒光微納米體系粒徑為
1.60±0.16微米，表面電位為-46.76±6.96暈伏，由倒置焚光顯微鏡可觀(guān)察其形貌，并確認(rèn)羅丹明的包載效果。將該復(fù)合熒光微納米體系用于裸鼠皮下注射，可清晰觀(guān)察到注射前后與注射過(guò)程中裸鼠皮下的熒光成像圖(如圖4)。
[0023]實(shí)施例2:將丙烯酸丁酯(1.5毫升)、葡聚糖水溶液(100毫升)、羅丹明(9.6毫克)投料入250毫升燒杯，反應(yīng)體系酸堿度調(diào)節(jié)至2.5。常溫下磁力攪拌4小時(shí)后加入氫氧化鈉稀溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)體系靜置6小時(shí)，然后將全部反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中離心30分鐘，棄去上層清液，并以高純水洗滌、渦旋振蕩數(shù)次。至少重復(fù)離心步驟2-4次，濃集后得包載羅丹明的復(fù)合熒光微納米體系，可真空凍干或重新在高純水中分散保存。經(jīng)激光粒度儀測(cè)量，包載羅丹明的復(fù)合熒光微納米體系粒徑為252.8 ± 46.2納米，表面電位為-39.54 ±