半菁類熒光染料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一類半菁類熒光染料，具有通式I的結構。通式I中，R1選自H、C1?6烷基、苯基、C1?6烷基任意取代的苯基、SO3R5和COOR5；所述的R5選自H和C1?6烷基；R2選自H、C1?6烷基、SO3R6和COOR6；所述的R6選自H和C1?6烷基；R3和R4各自獨立地選自H和C1?6烷基；Y?為Cl?、Br?或者I?。本發(fā)明所述的半菁類熒光染料對人血清白蛋白具有良好的響應速度、可逆的熱穩(wěn)定性、優(yōu)異的選擇性和近紅外的發(fā)射波長，并且能達到1.73mg/L的最低檢測限。本發(fā)明的熒光染料可應用到人尿中血清白蛋白的檢測和活細胞共聚焦熒光成像。
【專利說明】
半菁類熒光染料
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬精細化工領域，涉及一類適用于生物樣品中血清白蛋白檢測的熒光染料 及其在細胞成像中的應用。
【背景技術】
[0002] 人血清白蛋白（Human Serum Albumin，簡稱HSA)是人血衆(zhòng)中重要的蛋白質，約占 血漿總蛋白的60 %。在生物體系中，體液中人血清白蛋白不僅起著維持血液正常滲透壓作 用，而且還承擔著類固醇激素、膽色素、藥物分子和代謝產(chǎn)物等運輸功能。此外，血漿中人血 清白蛋白含量的異常與一些疾病密切相關，例如肝炎、肝硬化和腎臟病等。
[0003] 在醫(yī)學上人血清白蛋白可用于治療燒傷與休克，用于補充因手術、意外事故或者 大出血所致的血液丟失，也可作為血漿的增容劑。對于健康人群，血清白蛋白在血清中的含 量為35~50g/L，在尿中的含量低于30mg/L。在臨床上，血清白蛋白含量被認為是一個關于 肝臟和腎臟的生物功能以及相關疾病可靠的指標。例如，通過檢測離體尿液樣本，測得尿液 樣本中有過量的血清白蛋白，可用于腎功能損傷的輔助診斷，起到早期預警的作用。
[0004] 熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、實時原位、檢測限低和可視化檢測等優(yōu)點，并 且還能克服傳統(tǒng)方法中存在的樣品預處理過程復雜、儀器價格昂貴、無法實時分析等缺點， 因此在生物檢測領域引起廣泛的關注。然而到目前為止，盡管有一些針對人血清白蛋白的 熒光探針已被報道，但是由于其檢測限低（>30mg/L)、穩(wěn)定性差和發(fā)射波長短(<600nm)，大 多數(shù)探針都很難在復雜的生物樣品中檢測微量的人血清白蛋白。因此，開發(fā)對人血清白蛋 白性能優(yōu)良的小分子熒光探針具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明首先提供一種半菁類熒光染料，具有通式I的結構：
[0006]
[0007] 通式I中，
[0008] Ri選自Η、&-6烷基、苯基、&-6烷基任意取代的苯基、S03RdPC00R5;所述的R 5選自Η和 Cl-6烷基；
[0009] R2選自Η、&-6烷基、S03R6和C00R 6;所述的R6選自6烷基；
[0010] R3和R4各自獨立地選自^PCi-6烷基；
[0011] Y-為 Cl-、Br-或者 I-。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供上述半菁類熒光染料的制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0013] (1)化合物1和化合物2按照摩爾比1:1.2~1.5反應制備化合物3;
[0014]
[0015] (2)化合物3和化合物4按照摩爾比1:1.0~1.2反應制備通式I的化合物，
[0016]
[0017] 本發(fā)明的上述半菁類熒光染料是本發(fā)明的發(fā)明人利用結構中存在多個扭曲位點 的半菁染料為開發(fā)平臺，基于扭曲分子內電荷轉移（Twisted Intramolecular Charge Transfer，簡稱TICT)機理設計合成的一類可與人血清白蛋白疏水空腔結合的增強型的焚 光探針。該類熒光探針對人血清白蛋白具有良好的響應速度(5s)、可逆的熱穩(wěn)定性(5~60 °C)、優(yōu)異的選擇性和近紅外的發(fā)射波長(>680nm)，并且能達到1.73mg/L的最低檢測限。并 且還能應用到活細胞共聚焦熒光成像。
[0018] 基于此，本發(fā)明提供上述本發(fā)明的半菁類熒光染料在白蛋白識別和檢測中的應 用。
[0019] 具體地，本發(fā)明提供上述本發(fā)明的半菁類熒光染料在制備白蛋白識別和檢測試劑 中的應用。進一步，本發(fā)明的目的也在于提供一種白蛋白檢測試劑，含有上述本發(fā)明的半菁 類熒光染料。所述的白蛋白檢測試劑中含有有效劑量的本發(fā)明所述的半菁類熒光染料。可 用于實驗室或臨床生物樣品中人血清白蛋白的檢測。所述的生物樣品可舉例但不限于離體 尿樣。
【附圖說明】
[0020] 本發(fā)明附圖25幅，如下所示：
[0021] 圖1是本發(fā)明的1(^]\1探針町1?-!?六在？85(1〇111]\1?!17.4)緩沖溶液中，加入10(^]\1 HSA激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。橫坐標為波長(nm)，縱坐標為歸一化強度。激發(fā)光波長為580nm〇
[0022] 圖2是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在不同溶劑的熒光發(fā)射譜圖（圖2a)和相應在不 同溶劑的吸光度（圖2b)。橫坐標為波長(nm)，激發(fā)光波長為580nm〇
[0023] 圖3是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，加入2(^]? HSA攪拌后，掃描結合后的紫外可見吸收光譜(圖3)。橫坐標為波長(nm)，縱坐標為吸光度。 [0024]圖4是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在不同的甘油/PBS(v/v)混合溶液體系中熒光發(fā) 射圖譜（圖4)。激發(fā)光波長為580nm 〇
[0025] 圖5是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，加入0.1、0.2、 0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1·0、2·0、3·0、4·0、5·0、6·0、8·0、10·0、15·0、20·0、30·0、 50.0、70.0、90.0、95.0、100.0、105.0、110.(^]\1的!^4熒光強度的變化。橫坐標為波長(11111)， 激發(fā)光波長為580nm〇
[0026] 圖6是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，加入0.1、0.2、 0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1·0、2·0、3·0、4·0、5·0、6·0、8·0、10·0、15·0、20·0、30·0、 50.0、70.0、90.0、95.0、100.0、105.0、110.(^]\1的批厶紫外吸收的變化。橫坐標為波長(11111)。
[0027] 圖7是本發(fā)明的1(^]?探針町1?-!^六-2在?83(1〇111]\1?!17.4)緩沖溶液中，加入0.2、 0·4、0·6、0·8、1·0、1·2、1·4、1·6、1·8、4·0、6·0、8·0、10·0、12·0、14·0、16·0、18·0、20·0μΜ的 HSA熒光強度的變化。橫坐標為波長(nm)，激發(fā)光波長為580nm〇
[0028] 圖8是本發(fā)明的1(^1探針見1?-!^在?83(1〇1111?!17.4)緩沖溶液中，提取熒光強度 在F 68Qnm隨著不同HSA加入量的變化圖。橫坐標為不同HSA加入量(μΜ)，激發(fā)光波長為580nm〇
[0029] 圖9是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，加入0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.(^1的批4熒光強度的變化。激發(fā)光波長為58011111，縱坐標 為熒光強度。
[0030] 圖10本發(fā)明的1(^]?探針町1?-!?六-2在？85(1〇111]\1?!17.4)緩沖溶液中，加入0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8以1的批4熒光強度的變化。激發(fā)光波長為58011111，縱坐標 為熒光強度。
[0031] 圖11是本發(fā)明的1(^1探針祖1?-!^4在1^3(1〇11^?!17.4)緩沖溶液中時間穩(wěn)定性， 每隔5min掃描一次焚光強度。橫坐標為不同的時間(min)，激發(fā)光波長為580nm。
[0032] 圖12是本發(fā)明的探針NIR-HSA的Job，s Plot曲線。[染料+HSA] = ΙΟμΜ,橫坐標[染 料]/ ([染料+HSA ])分別從0.1到1.0作圖，激發(fā)光波長為580nm。
[0033] 圖13是本發(fā)明的5μΜ探針NIR-HSA在rosaOmM pH 7.4)緩沖溶液中，加入5(^]?的 HSA響應時間后在0~400s內每隔Is掃面一下熒光強度。激發(fā)光波長為580nm。
[0034] 圖14是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，分別加入ImM 鈉離子(2)、lmM鎂離子(3)、lmM鈣離子(4)、lmM鋅離子(5)、lmM鉀離子(6)、lmM鉛離子(7)、 ImM猛尚子（8)、lmM銨根尚子(9)、lmM銀尚子（10)、100μΜ HSA(ll)時F68〇nm處的焚光強度的 變化。其中1為空白對照，激發(fā)光波長為580nm。
[0035] 圖15是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，分別加入ImM 氟離子(2)、ImM氯離子(3)、ImM溴離子(4)、ImM碘離子(5)、ImM硝酸根離子(6)、ImM亞硝酸根 離子(7)、ImM高氯酸根離子(8)、ImM硫酸根(9)、ImM硫氰酸根離子（10)、ImM醋酸根（11 )、ImM 磷酸氫根離子（12)、ImM碳酸根離子（13)、ImM碳酸氫根（14)、100yMHSA(15)時F68Qnm處的熒 光強度的變化。其中1為空白對照，激發(fā)光波長為580nm。
[0036] 圖16是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中，分別加入50μ Μ組氨酸（2)、50μΜ甘氨酸(3)、50μΜ色氨酸(4)、50μΜ苯丙氨酸（5)、50μΜ絲氨酸(6)、50μΜ天冬 酰胺（7)、50μΜ谷氨酰胺（8)、50μΜ天門冬氨酸（9)、50μΜ半胱氨酸（10)、100yMHSA( 11)時 F680nm處的熒光強度的變化。其中1為空白對照，激發(fā)光波長為580nm 〇 [0037] 圖17是本發(fā)明的1(^1探針祖1?-!?4-2在1^(1〇11^?!17.4)緩沖溶液中，分別加入 ImM鈉離子（2)、ImM鎂離子（3)、ImM鈣離子(4)、ImM鋅離子（5)、ImM鉀離子(6)、ImM鉛離子 (7)、ImM猛尚子（8)、ImM錢根尚子（9)、ImM銀尚子（10)、100μΜ HSA( 11)時F68〇nm處的焚光強 度的變化。其中1為空白對照，激發(fā)光波長為580nm。
[0038] 圖18是本發(fā)明的1(^1探針祖1?-!?4-2在1^(1〇11^?!17.4)緩沖溶液中，分別加入 ImM氟離子(2)、ImM氯離子(3)、ImM溴離子(4)、ImM碘離子(5)、ImM硝酸根離子(6)、ImM亞硝 酸根離子（7)、ImM高氯酸根離子(8)、ImM硫酸根(9)、ImM硫氰酸根離子（10)、ImM醋酸根 (11)、111^磷酸氫根離子（12)、111^碳酸根離子（13)、111^碳酸氫根（14)、10(^1!?4(15)時 F680nm處的熒光強度的變化。其中1為空白對照，激發(fā)光波長為580nm 〇
[0039] 圖19是本發(fā)明的1(^1探針祖1?-!?六-2在1^(1〇11^?!17.4)緩沖溶液中，分別加入 50μΜ組氨酸（2)、50μΜ甘氨酸（3)、50μΜ色氨酸（4)、50μΜ苯丙氨酸（5)、50μΜ絲氨酸（6)、50μΜ 天冬酰胺(7)、50μΜ谷氨酰胺(8)、50μΜ天門冬氨酸(9)、50μΜ半胱氨酸（10)、lOOyMHSA(11)時 F680nm處的熒光強度的變化。其中1為空白對照，激發(fā)光波長為580nm 〇
[0040] 圖20是本發(fā)明的5μΜ探針NIR-HSA以及5μΜ探針NIR-HSA加入15μΜ HSA在pH值為4、 5、6、7、7 · 4、8、9時F68〇nm熒光強度。激發(fā)光波長為580nm。
[0041 ] 圖21是本發(fā)明的1(^1探針祖1?-!^4在1^3(1〇11^?!17.4)緩沖溶液中，在不同溫度 下的熒光強度。圖2la是溫度從5°C~60°C的熒光圖譜；圖2lb是60°C~5°C的熒光圖譜。激發(fā) 光波長為580nm〇
[0042] 圖22是本發(fā)明的1(^1探針祖1?-!^4在1^3(1〇11^?!17.4)緩沖溶液中熱穩(wěn)定性。圖 22a是溫度在60°C的環(huán)境下，每隔5min掃描一下焚光光譜；圖22b為提取F697nm處的焚光強 度，橫坐標為時間(min)，激發(fā)光波長為580nm。
[0043] 圖23是本發(fā)明的ΙΟμΜ探針NIR-HSA在roS(10mM pH 7.4)緩沖溶液中5°(：的熒光強 度。1為5 °C加熱到60 °C過程中取5 °C的熒光強度;2為60 °C加熱到5 °C過程中取5 °C的熒光強 度;3為在60°C環(huán)境下持續(xù)2h后降溫到5°C的熒光強度，激發(fā)光波長為580nm。
[0044] 圖24是本發(fā)明探針NIR-HSA的細胞成像實驗。用10μΜ探針NIR-HSA和lOOyMHSA混合 無血清培養(yǎng)基孵育正常肝細胞HL-7702-個小時后，然后進行細胞成像(d-fha-c為無血清 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞成像。a、b兩圖為HL-7702細胞成像，a、d為熒光圖，b、e為明場圖。c、f為相 應的疊加圖細胞成像。
[0045] 圖25是本發(fā)明探針在檢測人尿樣中血清白蛋白測試。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明所述的半菁類熒光染料，具有通式I的結構：
[0047]
[0048] 通式I中，
[0049] 所述心選自Η、&-6烷基、苯基、&-6烷基任意取代的苯基、S0 3R5和⑶0R5;所述的R5選 自11和(^6烷基；優(yōu)選所述的h選自Η、(^6烷基、苯基和(^-6烷基任意取代的苯基；更為優(yōu)選 地，所述的Ri選自Η、苯基和烷基;最為優(yōu)選地，所述的辦是甲基或苯基。
[0050] 所述R2選自H、6烷基、S03R6和C00R6;所述的R 6選自!1和&-6烷基；優(yōu)選所述的R2選 自11和&-6烷基。
[0051 ] 所述R3選自!1和&-6烷基，優(yōu)選4烷基；
[0052] 所述R4選自11和&-6烷基，優(yōu)選4烷基；
[0053] Y-為 Cl-、Br-或者 Γ，優(yōu)選 Br-或者 Γ。
[0054] 更為具體的實施方式中，所述的半菁類熒光染料選自以下化合物：
[0055]
[0056] 另一方面，本發(fā)明提供所述半菁類熒光染料的制備方法，包括如下步驟：
[0057] (1)化合物1和化合物2按照摩爾比1:1.2~1.5反應制備化合物3;
[0058]
[0059] (2)化合物3和化合物4按照摩爾比1:1.0~1.2反應制備通式I的化合物：
[0060]
[0061]【具體實施方式】中，所述的半菁類熒光染料的制備方法包括如下步驟：
[0062] (1)以乙腈為反應溶劑，化合物1和化合物2按照摩爾比1:1.2~1.5回流反應，薄板 層析色譜(TCL)監(jiān)測反應進行程度，完全反應后體系冷卻到室溫;待固體完全沉淀后，真空 抽濾，所得的固體用乙醚洗滌，最后將得到的固體產(chǎn)物放在真空干燥箱過夜干燥，即得到化 合物3;
[0063]針對易揮發(fā)的化合物2,該反應過程中優(yōu)選在Ν2氣體保護下進行；
[0064] (2)以乙酸酐為溶劑，化合物3和化合物4按照摩爾比1:1.0~1.2，在他保護下回流 反應，薄板層析色譜(TCL)監(jiān)測反應進行程度，完全反應后體系冷卻到室溫，加入冰水淬滅 反應；乙酸乙酯萃取三次，然后用鹵水洗滌有機相三次，無水硫酸鈉干燥過夜，減壓抽濾，旋 蒸;經(jīng)柱分離技術純化得到通式I的化合物。
[0065] 下面的實施例可以使本領域的普通技術人員更加全面地理解本發(fā)明的內容，但不 加以任何方式限制本發(fā)明。
[0066] 實施例1
[0067] 化合物NIR-HSA的合成
[0068] 化合物NIR-HSA的合成步驟如下：
[0069]
[0070] (1)化合物3的合成
[0071] 將2-甲基苯并噻唑（0.5(^，3.93禮）、碘乙烷（0.628,4!1^)溶于151111乙腈中，在吣惰 性氣體保護下，回流8h。待反應體系冷卻到室溫后，加入20ml的乙醚，反應體系有大量的固 體沉淀析出。然后，減壓抽濾，用5ml的乙醚洗滌三次后，放在真空干燥箱過夜干燥。得到 0.84 8的化合物3，產(chǎn)率70%。
[0072] (2)化合物NIR-HSA的合成
[0073] 將化合物3 (0.31 g，ImM)、4-二甲氨基肉桂醛(0.18，ImM)溶于10ml乙酸酐中，加熱 回流30min后，待反應體系冷卻到室溫，加入15ml蒸餾水淬滅反應。然后，用20ml的乙酸乙酯 萃取三次，然后加入無水硫酸鈉過夜干燥。減壓抽濾，旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)后用硅膠柱分離提純 得到藍綠色固體0.30g，產(chǎn)率65%。洗脫劑的極性:二氯甲烷/甲醇從100/1-50/1梯度淋洗。 化合物的結構經(jīng)過核磁和高分辨質譜表征。
[0074] 4 匪R(400MHz，DMS0) :S8.34(d，J = 8.1，lH)，8.19(d，J = 8.4，lH)，8.02(dd，J = 14·4，11·0，1Η)，7.81(t，J = 7.7，lH)，7.71(t，J = 7.7，lH)，7.55(d，J = 8.8,2H)，7.47(d，J = 15·0，1Η，），7.37((1, J= 14.5,1H)，7· 22(dd，J= 14.9,11.0,1H)，6.80(d，J = 8.8,2H)， 4.74(q，J = 7.2,2H)，3.05(s，6H)，1.44(t，J = 7.1，3H).
[0075] 13C 匪R(101MHz，Me0D):δ170·13,152.28,151.73,148.37,140.87,130.61， 129.26,127.74,127.63,124.23,122.94,122.29,115.92,112.25,112.01,111.62,43.77， 13.76.
[0076] HRMS-ESI:m/z理論值：C2iH23N2S+，335 · 1576;實測值：335 · 1582。
[0077] 實施例2
[0078] 化合物NIR-HAS-2的合成
[0079] 化合物NIR-HAS-2的合成步驟如下：
[0080]
4
[0081 ] (1)化合物6的合成
[0082] 將2-甲基苯并噻唑（0.5(^，3.93禮）、溴化芐（0.688,4111]\〇溶于151111甲苯中，在吣惰 性氣體保護下，回流8h。待反應體系冷卻到室溫后，加入20ml的乙醚，反應體系有大量的固 體沉淀析出。然后，減壓抽濾，用5ml的乙醚洗滌三次后，放在真空干燥箱過夜干燥。得到 〇.8以的化合物6，產(chǎn)率65%。
[0083] 將化合物6(0.32g，ImM)、4_二甲氨基肉桂醛(0.18, ImM)溶于10ml乙酸酐中，加熱 回流30min后，待反應體系冷卻到室溫，加入15ml蒸餾水淬滅反應。然后，用20ml的乙酸乙酯 萃取三次，然后加入無水硫酸鈉過夜干燥。減壓抽濾，旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)后用硅膠柱分離提純 得到藍綠色固體0.30g，產(chǎn)率65%。洗脫劑的極性:二氯甲烷/甲醇從100/1~50/1梯度淋洗。 化合物的結構經(jīng)過核磁和高分辨質譜表征。
[0084] 4 MMR(400MHz，Me0D):S8.20-8.12(m，lH)，8.05(dd，J=14.2，ll.lHz，lH)，7.95 (d,J = 8.1Hz,lH) ,7.78-7.69(m,lH) ,7.67(dd,J=11.2,4.1Hz,lH) ,7.55(d,J = 9.0Hz, 2H),7.40(dd ,J = 9.3,3.6Hz,3H),7.28(d ,J = 6.8Hz,2H),7.25-7.16(m,2H),7.16-7.08(m, lH),6.75(d,J=9.0Hz,2H),5.96(s,3H),5.96(s,2H),3.08(s,6H).
[0085] 13C 匪R(126MHz，Me0D):Sl73.10，154.84，154.52，152.11，142.90，134.63, 132.48,130.61,130.51,129.91,129.14,128.85,127.67,124.77,124.73,123.18,117.02， 113.22,111.31,52.22,40.21.
[0086] HRMS-ESI :m/z理論值:C2iH23N2S+，397 · 1733;實測值：397 · 1745。
[0087] 實施例3
[0088] 化合物NIR-HSA在roS(10mM pH 7.4)結合HSA后激發(fā)光譜與發(fā)射光譜歸一化實驗： 使用實例1合成的探針NIR-HSA先用二甲基亞砜溶劑在容量瓶中配成母液。然后用微量進樣 器取樣，用TOSaOmMpH 7.4)將熒光探針NIR-HSA母液的濃度稀釋到ΙΟμΜ，并確保二甲基亞 砜的加入體積小于總體積的千分之一。隨后加入50μΜ的HSA混合均勻，改變不同的激發(fā)波 長，從520~600nm每間隔10nm，掃描一次焚光光譜。然后選定最大的焚光發(fā)射波長，反掃描 染料的激發(fā)波長，歸一化處理的染料激發(fā)光譜與發(fā)射光譜見圖1。左曲線為激發(fā)光譜，右曲 線為發(fā)射光譜。
[0089] 所用儀器為安捷倫熒光分光光度計(型號:G9800A，編號MY15210003)。
[0090] 實施例4
[0091]探針NIR-HSA在不同溶劑的熒光發(fā)射與紫外可見吸收光譜實驗：
[0092]用微量進樣器從探針NIR-HSA母液中取樣，分別加入到1，4-二氧六環(huán)、二氯甲烷、 乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇兒^二甲基甲酰胺和?83(1〇11^!17.4)，最終稀釋成1(^肌1?-HSA溶液，用580nm作為激發(fā)波長，測試結果如圖2a所示。從測試的結果分析發(fā)現(xiàn)該探針分子 對溶液的極性較為敏感，在二氯甲烷中熒光最強，相反在PBS(10mM pH 7.4)最弱。通過測試 該化合物在不同溶劑的紫外可見吸收譜圖，結果發(fā)現(xiàn)1〇μΜ NIR-HSA探針在二氯甲烷中出現(xiàn) 紅移，并且吸收強度最高;在PBS(10mM pH 7.4)出現(xiàn)藍移，并且吸收強度最低。除此之外，在 其他的溶劑中紫外可見吸收圖譜相似。
[0093] 所用儀器為安捷倫紫外可見分光光度計（型號:G6860A，編號MY1523004)和安捷倫 熒光分光光度計（型號:G9800A，編號MY15210003)。
[0094] 實施例5
[0095] 探針NIR-HSA-2與HSA結合后紫外吸收光譜實驗：
[0096] 使用實例2合成的探針NIR-HSA-2先用二甲基亞砜溶劑在容量瓶中配成母液。然后 用微量進樣器取樣，用roS(10mM pH 7.4)將熒光探針NIR-HSA母液的濃度稀釋到10μΜ，并確 保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。隨后加入20μΜ的HSA混合均勻，用紫外可 見分光光度計測試探針NIR-HSA-2與HSA空腔結合后紫外吸收光譜。經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)最大吸收 峰大約在575nm附近（圖3)。
[0097] 實施例6
[0098] 探針NIR-HSA粘度實驗：
[0099]用注射器分別量取甘油與roS(10mM，pH 7.4)的體積，分別配制的甘油/PBS(10mM pH 7.4)(￥八)體積比0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1、10/0的混合溶液待 用。然后用微量進樣器從母液中取探針NIR-HSA加入上述配制好的混合液，最終配制的探針 的濃度為1〇μΜ。超聲10分鐘，除掉其中的氣泡后靜置，在熒光分光光度計上測量其發(fā)射光 譜。如圖4是測試的熒光光譜結果，不難發(fā)現(xiàn)隨著甘油的比重增加，探針NIR-HSA的熒光強度 增大?？赡苁且驗殡S著溶液體系的粘度增大，探針分子存在的扭轉得以抑制。激發(fā)態(tài)的能量 從以扭轉熱福射形式耗散轉變到以焚光形式釋放。
[0100] 實施例7
[0101 ]探針化合物NIR-HSA對HSA的濃度滴定熒光光譜實驗：
[0102] 用微量進樣器從母液中取樣，稀釋成1(^1的1^5(1〇11^?!17.4)溶液，并確保二甲 基亞諷的加入量小于總體積的千分之一。依次加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、70.0、90.0、95.0、 100.0、 105.0、110. ΟμΜ的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再檢測其熒光變化情況。 測試結果如圖5所示，隨著HSA的加入量越多，其熒光強度不斷的增加，在強度增加的同時， 發(fā)射波長稍有藍移現(xiàn)象，藍移了 20nm左右。
[0103] 實施例8
[0104] 探針化合物NIR-HSA對HSA的濃度滴定紫外可見光譜實驗：
[0105]用微量進樣器從母液中取樣，稀釋成1(^1的1^5(1〇11^?!17.4)溶液，并確保二甲 基亞諷的加入量小于總體積的千分之一。依次加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、70.0、90.0、95.0、 100.0、 105.0、110. ΟμΜ的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再檢測紫外可見光譜變化 情況。測試結果如圖6所示，隨著HSA的加入量越多，在512nm處的紫外可見光譜吸收強度下 降，在下降的同時，稍有紅移現(xiàn)象，紅移13nm左右。
[0106] 實施例9
[0107] 探針化合物NIR-HSA-2對HSA的濃度滴定熒光光譜實驗：
[0108] 用微量進樣器從探針祖1?-批4-2母液中取樣，稀釋成1(^1的1^3(1〇11^?!17.4)溶 液，并確保二甲基亞砜的加入量小于總體積的千分之一。依次加入〇 .2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2、1.4、1.6、1.8、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.(^]\1的!^厶溶液。每加入一 次HSA需等待10s以上再檢測其熒光變化情況。測試結果如圖7所示，隨著HSA的加入量越多， 其熒光強度不斷的增加。
[0109] 實施例10
[0110] 探針化合物NIR-HSA對HSA的濃度滴定飽和性實驗：
[0111] 具體實驗操作在實例6的基礎上，提取在680nm處的熒光強度隨著HSA加入量作圖， 如圖8所示，隨著HSA的加入量越大，F(xiàn) 68Qnm熒光強度越大，大約待其加入量達到100μΜ時，熒 光強度達到最大值。
[0112] 實施例11
[0113] 探針化合物NIR-HSA對HSA的檢測限實驗：
[0114] 微量進樣器從探針見1?-批4母液中取樣，稀釋成1(^1的?83(1〇11^?!17.4)溶液，并 確保二甲基亞砜的加入量小于總體積的千分之一。依次加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9、1. ΟμΜ的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再檢測熒光光譜變化情況。 然后取700nm處的熒光強度如圖9所示，隨著HSA加入量越大，熒光強度增加量呈線性關系。 將熒光強度與HSA濃度可做一條直線，線性系數(shù)R2 = 0.9978。測試五次空白對照，通過檢測 限的計算公式DL = 3〇/k，其中〇為五次空白對照的標準方差，k為擬合直線的斜率。進而可計 算得到探針NIR-HSA對HSA的檢測限為1.73mg/L。
[0115] 實施例12
[0116] 探針化合物NIR-HSA-2對HSA的檢測限實驗：
[0117] 微量進樣器從探針見1?-批4-2母液中取樣，稀釋成1(^1的?83(1〇1111?!17.4)溶液， 并確保二甲基亞砜的加入量小于總體積的千分之一。依次加入〇 .2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6、1.8μΜ的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再檢測熒光光譜變化情況。然后 取700nm處的熒光強度如圖10所示，隨著HSA加入量越大，熒光強度增加量呈線性關系。將熒 光強度與HSA濃度可做一條直線，線性系數(shù)R 2 = 0.9993。測試五次空白對照，通過檢測限的 計算公式DL = 3〇/k，其中〇為五次空白對照的標準方差，k為擬合直線的斜率。進而可計算得 到探針NIR-HSA對HSA的檢測限為0.930mg/L。
[0118] 實施例13
[0119]探針化合物NIR-HSA溶液穩(wěn)定性實驗：
[0120] 將探針分子祖1?-!^的母液稀釋到1(^1的1^(1〇11^?!17.4)溶液，并確保二甲基 亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。用焚光分光光度計每隔5min掃描一次焚光光譜， 共掃描70min，提取其在700nm處的熒光強度，繪制隨著時間變化的散點圖，如圖11下排點所 不。然后加入1〇〇μΜ的HSA混合均勾，同樣用焚光分光光度計每隔5min掃描一次焚光光譜，提 取其在680nm處的熒光強度繪制隨著時間變化的散點圖，如圖11上排點所示。
[0121] 實施例14
[0122] 探針化合物NIR-HSA與HSA配位比實驗：
[0123] 將探針分子NIR-HSA的母液和HSA母液在PBS(10mM pH 7.4)溶液按照[染料]/([染 料]+ [批厶])=0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0的比值關系進行配制，其中[染 料]+ [HSA] = 10yM，然后用熒光分光光度計分別掃描上述不同混合體系的熒光光譜，提取 680nm處的熒光強度與[染料]/([染料]+ [HSA])比值作圖，如圖12所示[染料V([染料]+ [HSA]) = 0.5時兩條擬合直線交匯，可以測出NIR-HSA與HSA配位比為1:1。
[0124] 實施例15
[0125] 探針化合物NIR-HSA與HSA響應時間實驗：
[0126] 將探針分子NIR-HSA的母液稀釋到5μΜ的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并確保二甲基亞 砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后用焚光分光光度計進行時間掃描焚光強度，每 隔Is掃描一次，共掃描400s。在35s時加入50μΜ的HSA，繼續(xù)用熒光分光光度計進行時間掃 描，最終得到680nm處的熒光強度與時間做一條曲線，得圖13。從圖中可以看出，加入HSA后 熒光立刻有增強的趨勢，5s后熒光強度可達到最大。由此說明了探針NIR-HSA對體外的HSA 的迅速響應。
[0127] 實施例16
[0128] 探針化合物NIR-HSA陽離子選擇性實驗：
[0129] 用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，稀釋成ΙΟμΜ的roS(10mM pH 7.4)溶液， 并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后分別加入l〇〇yMHSA，lmM鈉離 子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鉀離子、鉛離子、錳離子、銨根離子、鎳離子。靜置1分鐘后掃描 熒光光譜，提取其680nm處的熒光強度做柱狀圖。測試結果如圖14,從結果可以看出，該探針 對其他陽離子離子基本沒有響應，而對HSA的響應較強。
[0130] 實施例17
[0131] 探針化合物NIR-HSA陰離子選擇性實驗：
[0132] 用微量進樣器取配制的見1?^母液少許，稀釋成1(^的1^(1〇1111?!17.4)溶液， 并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后分別加入1〇〇μΜ HSA，lmM氟離 子、氯離子、溴離子、碘離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、高氯酸根離子、硫酸根、硫氰酸根 離子、醋酸根、磷酸氫根離子、碳酸根離子、碳酸氫根。靜置1分鐘后掃描熒光光譜，提取其 680nm處的熒光強度做柱狀圖。測試結果如圖15,從結果可以看出，該探針對其他陰離子離 子基本沒有響應，而對HSA的響應較強。
[0133] 實施例18
[0134] 探針化合物NIR-HSA氨基酸選擇性實驗：
[0135] 用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，稀釋成ΙΟμΜ的roS(10mM pH 7.4)溶液， 并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后分別加入1〇〇μΜ HSA，50yM組氨 酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、醋酸 根、磷酸氫根離子、碳酸根離子、碳酸氫根。靜置1分鐘后掃描焚光光譜，提取其680nm處的焚 光強度做柱狀圖。測試結果如圖16,從結果可以看出，該探針對其他陰離子離子基本沒有響 應，而對HSA的響應較強，說明了探針NIR-HSA對HSA離子具有很好的選擇性。
[0136] 實施例19
[0137] 探針化合物NIR-HSA-2陽離子選擇性實驗：
[0138] 用微量進樣器取配制的祖1?-批4-2母液少許，稀釋成1(^1的1^(1〇11^?!17.4)溶 液，并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后分別加入20μΜ HSA，lmM鈉 離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鉀離子、鉛離子、錳離子、銨根離子、鎳離子。靜置1分鐘后掃 描熒光光譜，提取其680nm處的熒光強度做柱狀圖。測試結果如圖17,從結果可以看出，該探 針NIR-HSA-2對其他陽離子離子基本沒有響應，而對HSA的響應較強。
[0139] 實施例20
[0140] 探針化合物NIR-HSA-2陰離子選擇性實驗：
[0141] 用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，稀釋成10μΜ的roS(10mM pH 7.4)溶液， 并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后分別加入20μΜ HSA，lmM氟離 子、氯離子、溴離子、碘離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、高氯酸根離子、硫酸根、硫氰酸根 離子、醋酸根、磷酸氫根離子、碳酸根離子、碳酸氫根。靜置1分鐘后掃描熒光光譜，提取其 680nm處的熒光強度做柱狀圖。測試結果如圖18,從結果可以看出，該探針NIR-HSA-2對其他 陰離子離子基本沒有響應，而對HSA的響應較強。
[0142] 實施例21
[0143] 探針化合物NIR-HSA-2氨基酸選擇性實驗：
[0144] 用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，稀釋成10μΜ的roS(10mM pH 7.4)溶液， 并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。然后分別加入20μΜ HSA，50yM組氨 酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、醋酸 根、磷酸氫根離子、碳酸根離子、碳酸氫根。靜置1分鐘后掃描焚光光譜，提取其680nm處的焚 光強度做柱狀圖。測試結果如圖19,從結果可以看出，該探針對其他陰離子離子基本沒有響 應，而對HSA的響應較強，說明了探針NIR-HSA-2對HSA離子具有很好的選擇性。
[0145] 實施例22
[0146] 探針化合物NIR-HSA在不同pH值影響實驗：
[0147] 用鹽酸與氫氧化鈉來調節(jié)pH值，配制成pH=4、5、6、7、7.4、8、9緩沖溶液。然后用微 量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，分別稀釋成5μΜ的溶液，并確保二甲基亞砜的加入體 積小于總體積的千分之一。靜置1分鐘后掃描熒光光譜，提取其680nm處的熒光強度做柱狀 圖。如圖20(左半邊），表明熒光強度基本不受pH值影響。隨后加入15μΜ的HAS，混合均與，靜 置1分鐘后掃描熒光光譜，提取其680nm處的熒光強度做柱狀圖。如圖20(右半邊），在生理pH 值時，得到較為理想的熒光強度。
[0148] 實施例23
[0149] 探針化合物NIR-HSA在變溫過程實驗：
[0150] 用微量進樣器取配制的探針NIR-HSA母液少許，稀釋成ΙΟμΜ的roS(10mM pH 7.4) 溶液，并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。調節(jié)熒光分光光度計的恒溫 控制裝置，分別設置5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 °C溫度梯度。在相應溫度下，靜置5min 以達到體系穩(wěn)定。然后用熒光分光光度計掃描熒光光譜，如圖21a，表明隨著溫度的升高，對 應的熒光強度降低。反過來，來探究升溫后的可逆性，從上述的60°C采取梯度降溫的方式來 探究溫度對探針的影響。具體的溫度設置為60、50、40、35、30、25、20、15、10、5°(：，靜置51^11 以達到體系穩(wěn)定。然后用熒光分光光度計掃描熒光光譜，如圖21b，表明隨著溫度的降低，對 應的熒光強度增大。
[0151] 實施例24
[0152] 探針化合物NIR-HSA在高溫環(huán)境下穩(wěn)定性實驗
[0153] 用微量進樣器取配制的探針NIR-HSA母液少許，稀釋成ΙΟμΜ的roS(10mM pH 7.4) 溶液，并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。調節(jié)熒光分光光度計的恒溫 控制裝置，設置成60°C，放入樣品槽，靜置5min以達到體系溫度穩(wěn)定，然后用熒光分光光度 計每隔5min掃描一次熒光光譜，共掃描120min，測試結果如圖22a。提取700nm處的熒光強度 與時間作圖，如圖22b，表明探針NIR-HSA在高溫下具有良好的熱穩(wěn)定性。待2h后，調節(jié)恒溫 控制裝置，設置溫度為5°C，待溫度達到之后繼續(xù)靜置5min以達到體系溫度穩(wěn)定，然后用熒 光分光光度計掃描熒光光譜，取700nm處的熒光強度與實例17兩個過程中探針NIR-HSA在5 °C的70〇11111熒光強度值作圖，如圖23，表明探針NIR-HSA在高溫下2h后結構沒有被破壞，仍具 有溫度的可逆性。
[0154] 實施例25
[0155] 探針NIR-HSA的活細胞實驗：
[0156] 用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，用無血清培養(yǎng)基稀釋成ΙΟμΜ NIR-HSA 和lOOyMHSA混合溶液培養(yǎng)，在37°C，5%⑶2下孵育正常肝細胞HL-7702-個小時，然后使用 激光共聚焦進行細胞成像實驗。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60X)觀察，重復三次。激發(fā)波長： 559nm，接收波段為:600到700nm。成像結果如圖24，a、d兩圖為HL-7702細胞成像的熒光圖， b、e為明場圖，c、f為兩個通道的疊加圖。其中a-c為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝細胞HL-7702空 白對照。熒光圖顯示了探針NIR-HSA結合HSA復合物很容易進入細胞，并且可用于活細胞熒 光成像。
[0157] 實施例26
[0158] 探針NIR-HSA在人尿樣中的實驗：
[0159] 收集男性志愿者的新鮮尿液，用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，稀釋成10 μΜ的尿液溶液，并確保二甲基亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。其中尿液中的尿微 量白蛋白的含量在大連醫(yī)科大學附屬二院進行測試，測試結果是〇.41yM(27mg/L)。分別再 往稀釋成 1〇μΜ 的尿液溶液加入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、21、26、31、36、41、 51、61、71、81、91、10lyMHSA，混合均勻，靜置2min以達到體系溫度穩(wěn)定，然后用熒光分光光 度計掃描其熒光光譜。如圖25測試結果所示，隨著人血清白蛋白的增加，熒光強度隨著增 強。取700nm處的熒光強度與濃度擬合一條直線，線性良好的關系R 2 = 0.9994，表明可以通 過該方法檢測人尿中的人血清白蛋白，進而推測該其腎功能可能出現(xiàn)損傷，起到早期預警 與識別的作用。
[0160] 為了考察探針NIR-HSA在尿液檢測人血清白蛋白的準確性，還進行了以下實驗測 試。用微量進樣器取配制的NIR-HSA母液少許，稀釋成ΙΟμΜ的上述尿液溶液，并確保二甲基 亞砜的加入體積小于總體積的千分之一。分別加入20μΜ、30μΜ人血清白蛋白，混合均勻，靜 置2min以達到體系溫度穩(wěn)定，然后用熒光分光光度計掃描其熒光光譜，每個濃度的樣品測 試三次。取700nm處的熒光熒光強度，用擬合的直線關系方程式y(tǒng) = 2.13x+36.89,計算出其 中的濃度分別為22.00±0.22以]\1、32.61±0.034]\1，加標回收率分別為108.79%、107.23%， 相對應的相對標準偏差分別為1.00%、〇. 09%。探針NIR-HSA可以準確檢測人尿中的血清白 蛋白的含量，有實際的應用價值。
【主權項】
1. 半菁類熒光染料，具有通式I的結構：通式I中， Ri選自H、&-6烷基、苯基、Ci-6烷基任意取代的苯基、SO3RdPCOOR 5;所述的R5選自H和Cu 烷基； R2選自H、C1-6烷基、SO3R6和COOR 6;所述的R6選自!1和&-6烷基； R3和R4各自獨立地選自11和&-6烷基； Y-為 Cl-、Br-或者 Γ。2. 根據(jù)權利要求1所述的半菁類熒光染料，其特征在于，所述的心選自HXm烷基、苯基 和d-6烷基任意取代的苯基。3. 根據(jù)權利要求1所述的半菁類熒光染料，其特征在于，所述的此選自!1和&-6烷基。4. 根據(jù)權利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R3和R4各自獨立地選自烷基。5. 根據(jù)權利要求1所述的半菁類熒光染料，選自以下化合物：6. 權利要求1所述的半菁類熒光染料的制備方法，包括如下步驟： (1) 化合物1和化合物2按照摩爾比1:1.2~1.5反應制備化合物3;(2) 化合物3和化合物4按照摩爾比1:1.0~1.2反應制備通式I的化合物，z ·千乂利安n/yn也tfJ干首失滅兀朱料在白蛋白識別和檢測中的應用。8.白蛋白檢測試劑，含有的權利要求1所述的半菁類熒光染料。
【文檔編號】C09B23/14GK106009760SQ201610343736
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】彭孝軍, 李海東, 姚起超, 樊江莉, 杜健軍
【申請人】大連理工大學, 大連科榮生物技術有限公司