用于空間解析熒光相關(guān)光譜學(xué)的光墊顯微鏡的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01280008835. 0的申請的分案申請。
[0002] 原申請的申請日：2012年02月14日
[0003] 原申請的【申請?zhí)枴?01280008835. 0
[0004] 原申請的發(fā)明名稱：用于空間解析熒光相關(guān)光譜學(xué)的光墊顯微鏡
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及光學(xué)顯微鏡，特別是涉及具有限定的焦體（focal volume)的光學(xué)顯微 鏡，以及適合于樣品濃度波動(dòng)測定的方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 擴(kuò)散從根本上有助于可溶性分子的運(yùn)動(dòng)，從而從根本上有助于從細(xì)胞分裂和細(xì)胞 內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)到組織起源時(shí)的激素調(diào)節(jié)以及到發(fā)育過程中的形態(tài)發(fā)生原梯度等 許多生物進(jìn)程的時(shí)空方面。在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中量化生物分子的擴(kuò)散性質(zhì)是非常有挑戰(zhàn)性 的。能夠直接分析擴(kuò)散過程的裝置和方法是非常少的且都是為個(gè)別問題專門定制的。
[0007] 確定生物分子特別是蛋白質(zhì)的且特別是在它們的自然環(huán)境中的性質(zhì)和行為，是說 明和分析它們的功能和在細(xì)胞過程和發(fā)育過程背后的機(jī)理的關(guān)鍵步驟。熒光相關(guān)光譜學(xué) (FCS) [1，2]是已知的用于分析分子迀移率的方法，分子迀移率提供了關(guān)于標(biāo)記分子的移動(dòng) 的和不動(dòng)的部分、它們的擴(kuò)散性質(zhì)和濃度、以及相互作用的不同標(biāo)記分子的共擴(kuò)散的信息。
[0008] 共焦激光掃描顯微鏡（共焦顯微鏡）是目前選擇用于具有高分辨率的活細(xì)胞成像
[3]和用于FCS的儀器，因?yàn)楣步辜す鈷呙栾@微鏡與利用雪崩光電二極管（APD)的超敏光子 計(jì)數(shù)結(jié)合使衍射極限成像（diffraction limited imaging)成為可能。利用共焦激光掃描 顯微鏡的FCS測定已經(jīng)被應(yīng)用于量化發(fā)信號(hào)時(shí)涉及的蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的動(dòng)力學(xué)（由EMBL 作出的[4]和由其他人作出的[5])，以研究具有出口能力（export-competent)的mRNP的 成熟[6, 7]或表征形態(tài)發(fā)生原梯度[8]。利用共焦激光掃描顯微鏡的FCS測定在本公開內(nèi) 容中被稱為共焦FCS。然而，由于共焦FCS數(shù)據(jù)采集的一個(gè)點(diǎn)接著另一個(gè)點(diǎn)的連續(xù)做法所 施加的內(nèi)在局限性，連同因失焦的光照而導(dǎo)致的輸入到樣本中的光子的總熒光光子產(chǎn)率過 低，使得共焦FCS實(shí)驗(yàn)仍然具有挑戰(zhàn)性[9]。通常，共焦激光掃描顯微鏡僅允許在特定的所 選的位置上測定每個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)[4, 10, 11]。
[0009] 換而言之，共焦FCS沒有提供足夠的空間解析信息以產(chǎn)生原本能夠?qū)⒖缭秸麄€(gè)細(xì) 胞或生物體的分散過程和其它來自FCS的蛋白質(zhì)參數(shù)（例如蛋白質(zhì)相互作用）視覺化的細(xì) 胞和其它生物樣品的圖像。
[0010] 已知方法和裝置的另一個(gè)缺點(diǎn)是擴(kuò)散的空間解析成像是有限的或不可能的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本公開內(nèi)容教導(dǎo)了具有用于照明樣品或物體的照明光路和用于觀察樣品的觀 察光路的顯微鏡。所述顯微鏡包括在所述照明光路中的照明光路聚焦裝置，所述照明光 路聚焦裝置限定基本上為二維的樣品或物體照明區(qū)域，所述照明區(qū)域沿著所述照明光路 的照明方向和其垂直方向延伸。所述二維物體或樣品照明區(qū)域可以被視為光帶或光片 (light-sheet)。由于照明光被成形為所述二維樣品照明區(qū)域，因此所述照明光路聚焦裝置 可以被理解為光路成形裝置。
[0012] 所述顯微鏡在所述照明光路中進(jìn)一步包含照明區(qū)域界定裝置，所述裝置用于有選 擇地對所述基本上二維的物體照明區(qū)域的一部分進(jìn)行照明，其中至少在照明方向和/或其 垂直方向上對所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分進(jìn)行界定。因此所述光帶在照明方 向和其垂直方向中的至少一個(gè)方向上被界定，基本上形成也稱為"光墊（light pad)"的所 述基本上二維的物體照明區(qū)域的一部分。所述基本上二維的物體照明區(qū)域的厚度和所述光 墊的厚度比照明方向長度及其垂直方向的寬度小的多。例如，所述基本上二維的物體照明 區(qū)域的該部分在照明方向上的長度和在垂直方向的寬度可以是所述基本上二維的物體照 明區(qū)域的該部分的厚度的約6倍或大于約6倍。
[0013] 所述照明光路聚焦（和成形）裝置可以包括柱面透鏡、畸變成形透鏡 (anamorphicalIy shaped lens)、一維陣列的球面或非球面透鏡中的至少一個(gè)。所述照明 光路聚焦（和成形）裝置還可以包括至少一個(gè)畸變成形反射鏡。
[0014] 所述照明區(qū)域界定裝置可以至少包括第一孔，其用于在照明方向上界定所述基本 上二維的物體照明區(qū)域的該部分。所述照明區(qū)域界定裝置還可以至少包括第二孔，其用于 在垂直于照明方向的方向上界定所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分。所述第一孔和 所述第二孔中的至少一個(gè)可以是可調(diào)節(jié)的，且可以是圓形光圈或矩形孔或狹縫。
[0015] 所述觀察光路的觀察方向可以是基本垂直于所述照明方向。然后對所述基本上二 維的物體照明區(qū)域進(jìn)行調(diào)節(jié)以使其位于檢測物鏡的焦平面內(nèi)。在這方面，所述顯微鏡可以 基于具有至少在照明方向上被界定的照明區(qū)域的單一平面照明顯微鏡。本公開內(nèi)容也可以 聯(lián)合使用其它觀察方向。
[0016] 所述檢測光路或觀察光路可以包括至少一個(gè)允許將檢測區(qū)域界定在所述基本上 二維的照明區(qū)域的該部分的空間濾波器。
[0017] 可以使用一個(gè)或多個(gè)檢測器像素陣列（如C⑶照相機(jī)或EM-C⑶照相機(jī)中的至少 一個(gè)）來實(shí)施樣品的觀察和檢測，利用所述觀察光路將所述基本上二維的物體照明區(qū)域和 檢測區(qū)域投射/成像到所述檢測器像素陣列。
[0018] 本公開內(nèi)容還教導(dǎo)了用于觀察/檢測樣品的方法。所述方法包括通過使照明光束 聚焦到在所述照明光束的照明方向和其垂直方向延伸的基本上二維的物體照明區(qū)域，來照 明樣品的二維部分，其中照明所述二維部分進(jìn)一步包括界定所述基本上二維的物體照明區(qū) 域以有選擇地照明所述基本上二維的物體照明區(qū)域的一部分，其中在照明方向和垂直于照 明方向的方向中的至少一個(gè)方向上對所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分進(jìn)行界定。 可以將所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分稱為光墊。
[0019] 所述方法可以包括移動(dòng)所述基本上二維的物體照明區(qū)域或所述基本上二維的物 體照明區(qū)域的該部分中的至少一個(gè)使其穿過所述樣品。這可以用于掃描整個(gè)所述樣品。通 過至少移動(dòng)一個(gè)照明物鏡、通過移動(dòng)照明光路聚焦裝置或其元件、通過用掃描單元進(jìn)行掃 描、通過移動(dòng)所述照明區(qū)域界定裝置和通過改變所述照明光路的準(zhǔn)直（這可以通過例如用 空間光調(diào)制器（SLM)或用具有可變曲率的反射鏡操作波前來完成），可以在樣品中以3D的 方式進(jìn)行所述基本上二維的物體照明區(qū)域和/或其所述部分的移動(dòng)。
[0020] 為了獲得例如熒光分子在所述基本上二維的物體照明區(qū)域和檢測區(qū)域的分布圖 像，可以將來自所述樣品的光在一定時(shí)間內(nèi)在檢測器像素陣列的每個(gè)像素上的記錄合并。
[0021] 可以以一系列短時(shí)間間隔記錄在檢測器像素陣列的每個(gè)像素上的來自所述樣品 的光，可以將時(shí)空相關(guān)性分析應(yīng)用于所述記錄，以獲得針對檢測器陣列上的每個(gè)像素的FCS 數(shù)據(jù)。
[0022] 所述方法可以進(jìn)一步包括測定在所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分中的 信號(hào)波動(dòng)?？梢詫υ诿總€(gè)像素上或一區(qū)域上或所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分的 熒光強(qiáng)度時(shí)間追蹤進(jìn)行波動(dòng)分析。所述波動(dòng)分析可以是時(shí)間自相關(guān)性分析、來自不同像素 的信號(hào)之間的時(shí)間互相關(guān)性分析、來自不同光譜通道的信號(hào)之間的時(shí)間互相關(guān)性分析、光 子計(jì)數(shù)直方圖、來自不同像素的信號(hào)之間的光子符合分析、來自不同光譜通道的信號(hào)之間 的光子符合分析和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法中的至少一種。
【附圖說明】
[0023] 當(dāng)閱讀了參照附圖的詳細(xì)說明時(shí)，本發(fā)明的進(jìn)一步的方面和細(xì)節(jié)將變得明顯，其 中：
[0024] 圖1顯示了以衍射極限的光墊進(jìn)行的基于光片的FCS成像；
[0025] 圖2更詳細(xì)地顯示了圖Ia中的顯微鏡；
[0026] 圖3a至3c示意說明了光學(xué)光墊；
[0027] 圖4示意說明了光墊顯微鏡的光學(xué)性質(zhì)；
[0028] 圖5顯示了在溶液中的ID - FCS測定；
[0029] 圖6顯示了細(xì)胞培養(yǎng)基對聚焦光片的影響；
[0030] 圖7顯示了在用所述光墊顯微鏡記錄的MDCK細(xì)胞內(nèi)和來自果蠅幼蟲的翅成蟲盤 內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度和迀移率的FCS成像結(jié)果；
[0031] 圖8顯示了活體內(nèi)的用于對比的共焦FCS測定；
[0032] 圖9顯示了關(guān)于來自果蠅幼蟲的翅成蟲盤和3T3細(xì)胞的ID-FCS測定；和
[0033] 圖10顯示了通過FCS成像，對3T3細(xì)胞中的HPl α迀移率進(jìn)行的空間解析分析。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明現(xiàn)在將參照附圖進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解的是這里所描述的本發(fā)明的實(shí)施例、 實(shí)施方案和方面僅僅是范例，并沒有以任何方式限制權(quán)利要求的保護(hù)范圍。本發(fā)明由權(quán)利 要求和它們的等同物所限定。應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案或方面的特征可以與本 發(fā)明中與之不同的一個(gè)或多個(gè)方面和/或?qū)嵤┓桨傅奶卣鹘Y(jié)合，還應(yīng)當(dāng)理解的是實(shí)施例和 實(shí)施方案的特征并非都是實(shí)施本發(fā)明所必須的。
[0035] 本公開內(nèi)容教導(dǎo)了稱為光墊（light-pad)顯微鏡1的新的顯微鏡。所述光墊 (light-pad)顯微鏡1由三個(gè)模塊組成，如例如在圖Ia和更詳細(xì)的圖2中所示：（i)從照明 光束20產(chǎn)生衍射極限的光片22的照明裝置2 ;所述衍射限制的光片22在至少一個(gè)方向上 被界定，從而限定所述光墊10 ; (ii)能夠沿著光片22和/或光墊10的焦點(diǎn)區(qū)的檢測光路 40和50中的至少一個(gè)進(jìn)行觀察的檢測單元4 ;以及可選的（iii)能夠方便地將試樣或樣品 8的特定區(qū)域定位至光墊10的焦點(diǎn)之內(nèi)的倒置顯微鏡6。
[0036] 當(dāng)只有試樣8的橫截面被光片22照明時(shí)，本公開內(nèi)容的光墊顯微鏡1提供了對熒 光激發(fā)的完全的空間控制，從而避免了不需要的失焦曝光。與此同時(shí)，所有的發(fā)射光子起源 于光片22的焦平面，且不需要基于它們的空間起源的光子濾波。
[0037] 光墊顯微鏡1基于兩個(gè)正交排列的物鏡，即照明物鏡21和檢測物鏡41。所述照 明物鏡21和檢測物鏡41可以是長工作距離的物鏡，例如40x/0. 8NA物鏡，但并不限于該 40x/0. 8NA物鏡。應(yīng)當(dāng)理解的是也可以使用其它具有不同放大倍數(shù)和/或數(shù)值孔徑的物鏡。 所述照明物鏡21和檢測物鏡41可以是相同的或可以是具有不同的放大倍數(shù)和/或數(shù)值孔 徑的不同物鏡。所述照明物鏡21和檢測物鏡41可以浸入容納樣品8的皮氏培養(yǎng)皿82中。
[0038] 光墊顯微鏡1可以與被認(rèn)為有助于成像或FCS的任何波長或任何波長組合一起使 用，可根據(jù)所述樣品8和用于研究樣品8的染料而定。為了檢測GFP熒光，例如可以使用具 有例如2W的輸出功率的氬激光