專利名稱：一株防治植物病害的生防細(xì)菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一株防治植物病害的生防菌株及其菌劑，所得到的生物藥劑及其方法屬 于生物防治領(lǐng)域。該生防菌株及其菌劑為植物病害的生物防治提供了一種新的高效生物 農(nóng)藥，是一種很好的化學(xué)農(nóng)藥替代品。
二背景技術(shù)：
植物病害一直嚴(yán)重地威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，人類防治植物病害可以追溯到幾千年前，過(guò) 去使用的藥劑多為植物性或無(wú)機(jī)化學(xué)農(nóng)藥。上世紀(jì)40年代初期，有機(jī)合成農(nóng)藥大量使 用，雖然在保證農(nóng)作物穩(wěn)定、高產(chǎn)方面起到重要作用，但是由于化學(xué)農(nóng)藥本身的缺點(diǎn)及 長(zhǎng)期不合理使用，逐漸暴露出一些嚴(yán)重的問(wèn)題，如抗藥性、農(nóng)藥殘留和病蟲害再猖獗， 即3R問(wèn)題(Resistance、 Residue、 Resurgence)。 3R問(wèn)題的出現(xiàn)引起了人們的廣泛關(guān)注， 于是生物防治的研究開發(fā)應(yīng)用被提到了議事日程，并得到各國(guó)政府的重視。從植物病害 防治的角度來(lái)講，生物防治是利用生物活體或其代謝產(chǎn)物對(duì)有害生物進(jìn)行防治。目前， 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從土壤中篩選到許多有益的微生物，為植物病害的生物防治提供了大量的 可利用資源，并且許多生防菌已開發(fā)成為生防制劑，廣泛用于生產(chǎn)。在各類防治植物病 害的生物農(nóng)藥中，細(xì)菌制劑是較多的一類，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有數(shù)十個(gè)相關(guān)產(chǎn)品登記。已開發(fā) 成功的細(xì)菌生防制劑主要為芽孢桿菌(BaczX丄Mspp.)、熒光假單胞桿菌(i^ei^o/nomw /LMomsce"s)和放射土壤桿菌"gra6a"en'wn raJz'o6acfer)。目前用于生防的芽孢桿菌種 類主要有枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌等。熒光假單胞菌能夠防治多 種植物病害，如小麥全蝕病、棉花幼苗猝倒病、馬鈴薯軟腐病等。利用細(xì)菌防治植物土 傳病害，最著名的當(dāng)屬放射土壤桿菌K-84菌系。該菌可有效地防治根癌土壤桿菌引起 的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病，并且已在澳大利亞、美國(guó)、加拿大等9個(gè)國(guó) 家推廣應(yīng)用。
近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外深入研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)許多植物存在著一類稱作為植物根部促 生細(xì)菌和植物內(nèi)生細(xì)菌的有益微生物，除促進(jìn)植物生長(zhǎng)外，它們還能抑制根部病原菌的
生長(zhǎng)，減輕植物病害，并且可作為激活劑誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性，成為細(xì)菌生防制劑的 開發(fā)熱點(diǎn)。其中，最早商業(yè)化生產(chǎn)的植物根部促生細(xì)菌是枯草芽孢桿菌A13， A13能有 效抑制植物病原菌的繁殖，促進(jìn)許多植物的生長(zhǎng)。用A13處理種子可以提高胡蘿卜產(chǎn)量 48%，燕麥產(chǎn)量33%和花生產(chǎn)量37%。 1990年美國(guó)Auburn大學(xué)的科研人員進(jìn)一步將A13 應(yīng)用在棉花和豌豆上并實(shí)現(xiàn)了商品化。
Pasteur在1876年從無(wú)菌葡萄果汁中提取到內(nèi)生細(xì)菌，從此植物內(nèi)生細(xì)菌逐漸引起 了人們的關(guān)注。我國(guó)陳延熙教授等曾從植物體內(nèi)篩選出有益的芽孢桿菌并將其制成植物 微生物制劑，在水稻、小麥、棉花、油菜、牧草等50多種植物上應(yīng)用，對(duì)作物具有增 產(chǎn)、防病、改善品質(zhì)、抗旱、防寒等作用。楊海蓮等用從水稻中分離得到的內(nèi)生陰溝腸 桿菌的菌液噴灑水稻葉片，結(jié)果表明處理后能夠明顯提高水稻對(duì)白葉枯病、稻瘟病、紋 枯病的抗性。Brooks等已經(jīng)證明分離自橡樹的內(nèi)生芽孢桿菌、假單胞菌對(duì)橡樹枯萎病 菌有拮抗活性。用內(nèi)生的脫氮假單胞菌處理橡樹后接種病原菌，防效為50%。 Sayonara 等從甘藍(lán)、白菜葉子中分離到3種內(nèi)生細(xì)菌對(duì)甘藍(lán)黑腐病原菌甘藍(lán)致病變種有拮抗活 性。綜上所述，基于生物防治的安全性和有效性，通過(guò)篩選抗菌譜廣、生防活性高的新 型細(xì)菌菌株，進(jìn)而制備出高效的生防菌劑，將有利于更好地防治植物病害，減少化學(xué)農(nóng) 藥的污染。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題和需求，篩選出一株抗菌譜 廣、活性高、對(duì)環(huán)境安全的新型生防細(xì)菌菌株，制備出高效的生防菌劑，更好地防治農(nóng) 業(yè)植物病害，減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染。
技術(shù)方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容
本發(fā)明是從作物根際土壤中分離篩選到1株具有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為產(chǎn) 酶溶桿菌，菌株代號(hào)為OHll。產(chǎn)酶溶桿菌作為一種生防細(xì)菌，在國(guó)內(nèi)屬首次報(bào)道，是
一種新型的生防細(xì)菌。主要生物學(xué)特性為ff (革蘭氏陰性)，菌體為短桿狀，大小為
3.2x0.4/mi，氧化酶、接觸酶、檸檬酸利用反應(yīng)為陽(yáng)性；脂酶反應(yīng)、V.P.反應(yīng)、H引哚反應(yīng) 為陰性；不能水解淀粉。菌株OHll現(xiàn)保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心(北京)，保藏日期2007/03/19，保藏號(hào)CGMCCN0.1978。使用上述高效生防菌株生產(chǎn)菌劑的工藝為:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐—產(chǎn) 品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)。
本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施步驟為
1) 將生防菌株0H11試管種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。
2) 將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接種入500升種子 罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨5g/L、玉米粉 10g/L、黃豆粉20g/L、酵母提取物2g/L、硫酸胺6g/L、蔗糖20 g/L、 KH2P04 3 g/L、 MgS04.7H20 4.8 g/L、 MnS04.H20 0.02 g/L 、 FeS04.7H20 0.01 g/L、 CaCl2.2H20 0.12 g/L、 NaCl 2.4 g/L、生物素0.1 mg/L、泛酸鈣6 mg/L、硫胺素 1.2mg/L、核黃素3mg/L、維生素B6 0.01 mg/L。
3) 將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的10%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基 與種子罐培養(yǎng)基相同。
4) 在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中溶氧量為15%—20%，攪拌速度為210 rpm/min，發(fā)酵溫度為30'C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為72h,發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到 101QCFU/mL以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液 體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體劑型。
有益效果
使用該發(fā)明生產(chǎn)的生防菌劑具有生產(chǎn)使用成本低、使用方便、防治效果好等優(yōu)點(diǎn)， 適合于農(nóng)業(yè)植物病害的生物防治。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民的身體健康，提 高農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要的意義。
試驗(yàn)證明，菌株OH11產(chǎn)生包括幾丁質(zhì)酶、/3-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶等多種胞外 水解酶，能有效抑制真菌，細(xì)菌的生長(zhǎng)。菌株0H11對(duì)油菜菌核病菌和辣椒疫霉病菌抑 菌圈直徑都大于22mm，對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌的拮抗作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到50mm。 OH11可有效地防治植物病原真菌、細(xì)菌、線蟲等病害，總體防治效果在50%—70%。 在溫室盆栽試驗(yàn)中，OH11對(duì)辣椒疫病和番茄青枯病的防治效果分別達(dá)到了 83.6%和 86.4%。
目前對(duì)植物病害的防治主要采取化學(xué)農(nóng)藥防治和抗病品種利用?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治由 于農(nóng)藥殘留量大，對(duì)生態(tài)環(huán)境污染嚴(yán)重，病原菌容易產(chǎn)生抗性水平，逐漸使化學(xué)農(nóng)藥失 去藥效。而抗病品種也常常因?yàn)椴≡菀卓朔淇剐远獾教蕴?。而本研究中分離得 到的產(chǎn)酶溶桿菌具有抗菌譜廣、防治效果好、環(huán)境安全、無(wú)污染等特點(diǎn)，與現(xiàn)有的防治 方法相比，本研究所獲得的產(chǎn)酶溶桿菌具有更為廣闊的應(yīng)用前景。
四

圖1生防菌株OH11的形態(tài)特征OH11菌株的革蘭氏染色、鞭毛染色、滑行運(yùn)動(dòng)、 菌落形態(tài)圖
A: OHll菌株革蘭氏染色；B: OH11菌株鞭毛染色； C: OHll菌株滑行運(yùn)動(dòng)；D: OH11菌株菌落形態(tài)
圖2生防菌株OHll的透射電鏡照片
圖3生防菌株OH11的抑菌活性
圖4生防菌株OHU對(duì)植物病原真菌菌絲的抑制作用
圖5生防菌株OH11對(duì)植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用
圖6生防菌株OH11防治植物病害的溫室試驗(yàn)
五具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是從作物根際土壤中分離篩選到的1株較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為產(chǎn)酶 溶桿菌，菌株代號(hào)為OHll。產(chǎn)酶溶桿菌作為一種生防細(xì)菌，在國(guó)內(nèi)屬首次報(bào)道，是一 種新型的生防細(xì)菌。OH11菌株現(xiàn)保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心(北京)，保藏日期2007/03/19，保藏號(hào)CGMCCN0.1978，該菌具有抗菌譜廣、活 性高、防治效果好、環(huán)境安全性高等特性。
(1) 生防細(xì)菌的分離取江蘇省農(nóng)科院院內(nèi)蔬菜、水稻、棉株、果樹根表lmm土 層土樣共27份。將采集的土樣(經(jīng)2mm土壤篩過(guò)篩)10 g加入裝有90 mL無(wú)菌水的 三角瓶中(內(nèi)裝玻璃珠若干)，搖床振蕩20min，然后進(jìn)行3 4次10倍系列稀釋。吸 取稀釋液100 /xL于NA平板上均勻涂布，每個(gè)稀釋度中設(shè)3次重復(fù)于28 'C下培養(yǎng)2 3 天。稀釋度以每平板菌落數(shù)100 150為宜，挑取不同類型的菌落于NA平板上純化3 次，隨后劃線于NA斜面，于4"C保存?zhèn)溆?。將土壤?xì)菌在NA平板上活化后分別移入 100 mLNA培養(yǎng)液中，150 rpm/min、 28 。C振蕩培養(yǎng)48 h得到土壤細(xì)菌菌液。在PDA與 NA等比例混合平板中央放置病原真菌菌絲塊(直徑7mm)，四周呈對(duì)角線放置4個(gè)直 徑為7mm的濾紙片，3個(gè)接種待測(cè)細(xì)菌菌懸液5 pL， 1個(gè)設(shè)無(wú)菌水處理為對(duì)照，每處 理重復(fù)3次，28t)培養(yǎng)，待對(duì)照處理真菌生長(zhǎng)至平板邊緣測(cè)定抑菌圈。通過(guò)此方法，我 們從作物根際土壤中分離到1056株細(xì)菌，篩選出7個(gè)具有較強(qiáng)拮抗活性的菌株。
(2) 生防細(xì)菌的鑒定 通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、脂肪酸分析和16SrDNA 序列分析，其中1株細(xì)菌被鑒定為產(chǎn)酶溶桿菌a^o6acfer e"zymogewes)，菌株代號(hào)為OHll。抑菌試驗(yàn)表明，0H11對(duì)辣椒疫霉、瓜果腐霉、甘薯軟腐病菌、油菜菌核病菌、 水稻紋枯病菌、棉花枯萎病菌、茄根腐病菌、棉花黃萎病菌、番茄青枯病菌、甘藍(lán)黑腐 病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌等重要植物病原菌均有 較強(qiáng)拮抗作用。產(chǎn)酶溶桿菌作為一種生防細(xì)菌，在國(guó)內(nèi)屬首次報(bào)道，是一種新型的生防 細(xì)菌。
(3) 發(fā)酵條件的優(yōu)化 采用單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)產(chǎn)酶溶桿菌OH11液體發(fā)酵的主要 影響因子溫度、轉(zhuǎn)速等進(jìn)行了探討，確定了最佳培養(yǎng)條件為溫度為3(TC、轉(zhuǎn)速為210 rpm/min;通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化 后的培養(yǎng)基為胰蛋白胨5g/L、玉米粉10g/L、黃豆粉20g/L、酵母提取物2g/L、硫 酸胺6 g/L、蔗糖20 g/L、 KH2P04 3 g/L、 MgS04.7H20 4.8 g/L、 MnS04.H20 0.02 g/L 、 FeS04.7H20 0.01 g/L、 CaCl2.2H20 0.12 g/L、 NaCl 2.4 g/L、生物素0.1 mg/L、泛酸鈣6 mg/L、硫胺素1.2mg/L、核黃素3 mg/L、維生素B6 0.01 mg/L。在優(yōu)化條件下，發(fā)酵培 養(yǎng)基中活菌數(shù)在24 h時(shí)達(dá)到8.13x108 CFU/mL， 72 h時(shí)達(dá)到4.8x109 CFU/mL，而在原基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中活菌數(shù)在24 h時(shí)達(dá)到1.87x108 CFU/mL, 72 h時(shí)達(dá)到9.3x108 CFU/mL;在此 基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)搖瓶裝量、發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH值4種因素進(jìn) 行了優(yōu)化,優(yōu)化后的結(jié)果為裝液量40mL/250mL,發(fā)酵時(shí)間72h,接種量109 CFU/mL, 初始pH值7.5。
(4) 施用方法
對(duì)于不同類型的植物病害采用不同的施用方法，施用次數(shù)根據(jù)防病情況而定。對(duì)于 番茄青枯病等維管束病害采用發(fā)酵菌液(濃度為109 CFU/mL)直接灌根的處理方法， 防治效果為70%—85%;對(duì)于種傳病害采用種子包衣的處理方法(包衣劑為羧甲基纖維 素，生防菌濃度為109CFU/mL)，防治效果為50%—70%;對(duì)于水稻稻瘟病等葉部病害 采用直接噴霧的方法(生防菌濃度為109CFU/mL)，防治效果為50%—70%。
權(quán)利要求
1.一株防治植物病害的生防菌株，為革蘭氏染色陰性的產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacterenzymogenes)，菌株代號(hào)為OH11。該菌株于2007年3月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.1978。
2. —種用權(quán)利要求1所述的一株防治植物病害生防菌株生產(chǎn)的生防菌劑是通 過(guò)以下方法生產(chǎn)而成1) 將生防菌株OHll試管種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。2) 將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接種入500升種 子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨5 g/L、玉米粉10 g/L、 黃豆粉20 g/L、酵母提取物2 g/L、硫酸胺6 g/L、蔗糖20 g/L、KH2P043 g/L、MgS04.7H20 4.8 g/L、 MnS04.H20 0.02 g/L 、 FeS04.7H20 0.01 g/L、 CaCl2.2H20 0.12 g/L、 NaCl 2.4 g/L、生物素0.1 mg/L、泛酸鈣6 mg/L、硫胺素1.2 mg/L、核黃素3 mg/L、維生素B6 0.01 mg/L。3) 將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的10%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng) 基與種子罐培養(yǎng)基相同。4) 在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中溶氧量為15%—20%，攪拌速度為210 rpm/min，發(fā)酵溫度為30'C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為72 h,發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到101Q CFU/mL以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或 采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供一株防治植物病害的生防菌株及其菌劑，屬于生物防治領(lǐng)域。所用菌株為革蘭氏染色陰性細(xì)菌，經(jīng)鑒定為產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)，菌株代號(hào)為OH11。菌株OH11無(wú)鞭毛但有滑移性，能產(chǎn)生包括幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶等多種胞外水解酶，能有效抑制真菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)。菌株OH11對(duì)油菜菌核病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌圈直徑都大于22.0mm；對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌的拮抗作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到50mm。將OH11菌種接種入種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將種子液接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同。液體發(fā)酵采用通氧深層發(fā)酵和分批補(bǔ)料工藝，溶氧量為15％-20％，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間72h，初始pH值7.5。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體劑型。生防菌株OH11可有效地防治植物病原真菌、細(xì)菌、線蟲等病害，總體防治效果在50％-70％。溫室盆栽試驗(yàn)中，OH11對(duì)辣椒疫病和番茄青枯病的防治效果分別達(dá)到83.6％和86.4％。菌株OH11具有抗菌譜廣、活性高、對(duì)環(huán)境安全等特性，在農(nóng)藥污染嚴(yán)重的今天，產(chǎn)酶溶桿菌及其菌劑將是一種很好的替代品。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101177671SQ200710190998
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 姜英華, 胡白石, 錢國(guó)良, 冰 韓 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)