專利名稱：一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及到從多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)的污染點(diǎn)篩選、分離、純化并強(qiáng)化馴化出高效降解PCBs的新菌株Raoultella terrigenaLY402，及對(duì)該菌株性能的研究，屬于環(huán)境生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾十年來(lái)，化學(xué)工業(yè)的快速發(fā)展使得大量的有害廢物被排放到自然環(huán)境中，其中，12類有機(jī)污染物因?yàn)榉€(wěn)定性強(qiáng)、難以自然生物降解、對(duì)人體和環(huán)境危害巨大而被聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署列為優(yōu)先控制的持久性有毒有機(jī)污染物。多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)是其中最具有代表性的一類，也被稱為二惡英(dioxins)類似化合物。
PCBs是一組由一個(gè)或多個(gè)氯原子取代聯(lián)苯分子中的氫原子而形成的具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的氯代芳香族化合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有209種同系物。PCBs具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、熱傳導(dǎo)性和絕緣性，曾在世界范圍內(nèi)被大量生產(chǎn)，主要被作為變壓器油、添加劑等應(yīng)用在電力、化工等行業(yè)，80年代中期被停止生產(chǎn)。對(duì)PCBs的毒理研究表明，少量的PCBs即可對(duì)人產(chǎn)生嚴(yán)重的致癌、致畸作用，極強(qiáng)的穩(wěn)定性也使其很難被自然界中的微生物降解，會(huì)在自然界中長(zhǎng)期存在，在動(dòng)植物體內(nèi)富集并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)環(huán)境和人類健康危害巨大。近十幾年來(lái)，有關(guān)PCBs污染土壤修復(fù)方法的研究一直是學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。物理的、化學(xué)的及生物的方法均被采用研究PCBs污染點(diǎn)的修復(fù)。其中，生物修復(fù)方法因具備修復(fù)費(fèi)用低、能徹底清除污染物、不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染而被認(rèn)為是最有前景的修復(fù)手段。目前對(duì)PCBs的生物修復(fù)手段主要通過(guò)優(yōu)勢(shì)微生物的生物降解實(shí)現(xiàn)。微生物降解主要有好氧降解和厭氧降解兩種方式。好氧降解是通過(guò)開環(huán)破壞PCBs，而厭氧降解則是從高氯取代的同系物中通過(guò)催化還原移走氯，即把高氯代同系物變成低氯代同系物，通過(guò)改變同系物的分布來(lái)減少氯取代的數(shù)量和位點(diǎn)、降低混合物的毒性而使混合物更易被好氧微生物降解。
迄今為止，PCBs好氧降解和厭氧降解已經(jīng)有20余年的研究歷程，已經(jīng)從污染點(diǎn)篩選出了40余種PCBs好氧降解菌株，對(duì)每種菌株的PCBs降解性能進(jìn)行了詳細(xì)的研究，除了少數(shù)幾株菌能夠降解6個(gè)氯以下的PCBs外，其余只能降解低于4氯的PCBs[C.MhiritetN.et al，Bioremediation of sites polluted by commercial PCBsproblematical questions andperspectives，Bull Inst Pasteur 1997，95，3-28(review)；賈凌云等，生物降解多氯聯(lián)苯的研究進(jìn)展，現(xiàn)代化工，2002(增刊)24-28；Josephine Borja et al，Polychlorinated biphenyls and their biodegradation(review)，Process Biochemistry 2005(40)1999-2013]。其中，降解效果最好的是假單胞菌(Pseudomonas sp.)LB400。在美國(guó)通用電子公司(General Electric Company GE)的兩篇專利U.S.Pat.No.4,843,009和5,009,999中，詳細(xì)描述了Pseudomonas sp.LB400的篩選、分離和純化方法，并實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株對(duì)低氯取代PCBs占主體的Aroclor 1242(主要為2、3、4氯取代的PCBs)和Aroclor 1254(主要為3、4、5氯取代的PCBs)有較快的降解速率，但對(duì)鄰位或2，3位點(diǎn)或3，4位點(diǎn)被氯取代的PCBs不具有降解能力，專利中未對(duì)高于6氯取代的PCBs進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，也未對(duì)含有大量土著菌的實(shí)際土壤進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。1987年，美國(guó)通用電子公司[Bedard，D.L.，J.A.Bergeron.Studies of a PCB-Contaminated Industrial Sludge.In Seventh Progress Report for the Research andDevelopment Program for the Destruction of PCBs.1988，pp.17-21.General Electric Co.Corporate Research and Development，Schenectady，NY.]在紐約附近進(jìn)行了首次PCBs生物修復(fù)的區(qū)域放大實(shí)驗(yàn)，污染地PCBs的初始濃度范圍從50到525ppm。修復(fù)方法為將假單胞菌屬的LB400菌株投放到污染地，監(jiān)測(cè)PCBs濃度的變化，發(fā)現(xiàn)在4個(gè)月內(nèi)，PCBs的濃度只降低了約20％，其降解速率遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)室水平。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際PCBs的污染點(diǎn)，高氯取代的PCBs同系物毒性更大，更難被降解。目前，PCBs污染點(diǎn)的生物修復(fù)還存在諸多問(wèn)題沒(méi)有解決，因而阻礙了生物修復(fù)技術(shù)在實(shí)際污染點(diǎn)的應(yīng)用。存在的主要問(wèn)題如下(1)目前發(fā)現(xiàn)的降解菌株只能降解部分PCBs，鄰位或2，3位點(diǎn)或3，4位點(diǎn)被氯取代的PCBs以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能被微生物有效降解；(2)在好氧降解中需要加入聯(lián)苯作為誘導(dǎo)底物，聯(lián)苯本身也是一種有毒的有機(jī)化合物，其加入會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，所以在實(shí)際的降解過(guò)程中要盡可能解除聯(lián)苯的添加，必須獲得不需要聯(lián)苯作為底物仍能降解PCBs的菌株；(3)在實(shí)際的PCBs污染點(diǎn)，由于雜菌等環(huán)境因素的影響，優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量和活性受到很大影響，對(duì)PCBs的降解效率顯著降低，在實(shí)際土壤體系中達(dá)到明顯的降解一般需要幾個(gè)月甚至幾年的時(shí)間；因此，篩選能夠降解所有PCB的同系物，特別是降解6氯以上的高毒性PCB同系物的微生物菌株，提高其在實(shí)際PCBs污染點(diǎn)的生存能力和降解速率，降低二次污染，是微生物修復(fù)技術(shù)邁向?qū)嵱没年P(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌株及獲得方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的(1)鄰位或2，3位點(diǎn)或3，4位點(diǎn)被氯取代的以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能被微生物有效降解；(2)聯(lián)苯作為誘導(dǎo)底物會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染；(3)在實(shí)際污染點(diǎn)降解效率低的不足。特提出本發(fā)明的技術(shù)解決方案。
本發(fā)明的基本構(gòu)思是首先從PCBs污染點(diǎn)大量篩選、分離、純化能夠降解PCBs的菌株，從中進(jìn)一步篩選出高效菌株，以解決鄰位或2，3位點(diǎn)或3，4位點(diǎn)被氯取代的以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能被有效生物降解的問(wèn)題。目前，在環(huán)境體系中進(jìn)行有效的篩選，進(jìn)而進(jìn)行合理的馴化是獲得高效PCBs降解菌株的有效途經(jīng)。從環(huán)境中篩選PCBs降解菌的理論基礎(chǔ)是雖然在自然環(huán)境中幾乎不存在能夠降解PCBs的微生物，但自然界中的微生物尤其是細(xì)菌較易發(fā)生變異，長(zhǎng)期在PCBs存在的環(huán)境中生存，基因會(huì)發(fā)生某些突變，使得某些微生物能夠利用或部分利用PCBs，如果將其純化并在較高的PCBs濃度下進(jìn)一步馴化、強(qiáng)化，將顯著提高其降解能力。因此，在篩選、分離純化降解菌株方面，采用以聯(lián)苯為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，用稀釋及平板劃線法分離純化菌株，以對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解速率為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選純菌株，利用聯(lián)苯培養(yǎng)基中外加PCBs混合物的方法對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行反復(fù)的強(qiáng)化馴化以穩(wěn)定菌株性狀，提高對(duì)PCBs的降解效率。
其次，為了避免聯(lián)苯作為誘導(dǎo)底物對(duì)環(huán)境造成二次污染，本發(fā)明的基本構(gòu)思是以能夠促進(jìn)降解菌的生長(zhǎng)并能提高PCBs的降解速率為準(zhǔn)則篩選能夠取代聯(lián)苯的環(huán)境友好碳源。
最后，為了確定降解菌在PCBs實(shí)際污染點(diǎn)的降解能力和范圍，分別采用水相體系和土壤相體系對(duì)低氯和高氯取代的PCBs進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，并在降解體系中加入取代聯(lián)苯的碳源，以提高在實(shí)際污染點(diǎn)的生物修復(fù)效率。
本發(fā)明所提出的一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法，包括從多氯聯(lián)苯的污染點(diǎn)取樣，經(jīng)過(guò)初篩、分離、純化菌株，再經(jīng)篩選及強(qiáng)化馴化PCBs降解菌株的步驟，獲得了一株高效降解PCBs的新菌株，其特征在于
a)經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC鑒定，該菌株的種屬為Raoultella terrigena，別名為Klebsiella terrigena，命名為L(zhǎng)Y402，保藏中心編號(hào)為1420，該菌株是兼性厭氧菌，能夠在溫度-20℃～60℃、pH值為3.0～12.0的環(huán)境中存活，適宜生長(zhǎng)的溫度為20℃～40℃，適宜生長(zhǎng)的pH值為5.0～10.0；b)該菌株Raoultella terrigena LY402的獲得方法，是第一步采用1～3g/L聯(lián)苯為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，利用第二步稀釋及平板劃線法分離純化菌株，通過(guò)第三步檢測(cè)不同菌株對(duì)2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解能力進(jìn)一步篩選，得到該P(yáng)CBs降解菌株，該菌株對(duì)2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的3～5天降解率為59.26％～64.69％；為了進(jìn)一步提高該菌株對(duì)PCBs的降降解能力，第四步采用了2g/L聯(lián)苯及PCBs混合物為碳源進(jìn)行強(qiáng)化馴化，其中，PCBs是商用Aroclor 1242與Aroclor1260的等量混合物，含量為10-50mg/L，馴化時(shí)間為2-3個(gè)月，2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的3天降解率提高到86.7％，提高了25％以上。
本發(fā)明的進(jìn)一步特征在于篩選出能夠取代聯(lián)苯、促進(jìn)PCBs降解的其它碳源，該菌株分別采用聯(lián)苯、葡萄糖、甘油、非離子表面活性劑OP-10、Tween-20、Tween-80、Triton-100以及生物表面活性劑蔗糖脂為碳源，3天～5天，對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解率分別為79.21～85.43％、20.50～28.13％、18.32～25.46％、38.61～46.71％、46.52～57.63％、48.45～63.78％、43.54～55.69％和85.24～86.73％，其中，每種碳源的用量均為2g/L，2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的用量為2mg/L，通過(guò)篩選證實(shí)該菌株利用聯(lián)苯以外的其它碳源也能降解PCB，并獲得了可以取代聯(lián)苯的高效碳源—蔗糖脂。
應(yīng)用一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法，其特征在于a)在好氧的水相體系中，針對(duì)2mg/L的Arolor1242，在30℃，經(jīng)過(guò)70小時(shí)的降解，Aroclor 1242的總降解率為98.02～99.15％，其中不同氯取代PCBs的降解速率為2氯99.21～99.92％，3氯82.71～99.91％，4氯68.77～99.93％，5氯43.32～86.42％，6氯18.94～77.92％，7氯16.32～51.64％，對(duì)2-5氯取代的PCBs降解效率明顯高于6-7氯取代物；b)在兼性厭氧條件下即100％水含量的土壤泥漿體系中，針對(duì)2.8mg/Kg土壤的Aroclor1260，在30℃，經(jīng)過(guò)8天降解，Aroclor 1260的總降解率為96.55％，其中，不同氯取代PCBs的降解速率為2氯15.39～92.59％、3氯7.74～78.99％、4氯-13.65～96.85％、5氯50.31～99.20％、6氯86.91～99.46％、7氯98.87～99.88％、8氯93.36～99.84％，9氯99.55％，對(duì)5-9氯PCBs降解效率明顯高于2-4氯取代物；c)在好氧及兼性厭氧的條件下，該菌株能夠降解2-9氯不同氯取代位點(diǎn)的PCBs。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是①篩選得到了PCBs高效降解菌株—Raoultellaterrigena LY402，這是目前提出的唯一一株能夠降解2-9氯不同取代位點(diǎn)PCBs的兼性厭氧菌，采用該降解菌解決了鄰位或2，3位點(diǎn)或3，4位點(diǎn)被氯取代的、以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能有效生物降解的難題；②篩選獲得了取代聯(lián)苯的高效碳源—蔗糖脂，解決了聯(lián)苯作為PCBs降解菌碳源對(duì)環(huán)境造成的二次污染問(wèn)題；③在PCBs污染的水相，PCBs(Aroclor1242)的70小時(shí)生物降解率達(dá)到98.02～99.15％；在土壤相，PCBs(Aroclor1260)的8天的生物降解率達(dá)到96.55％，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)值。
附表說(shuō)明共設(shè)兩個(gè)表，分別說(shuō)明如下表1 Raoultella terrigena LY402在水相中對(duì)Aroclor 1242中各組分的降解率降解條件好氧降解，降解時(shí)間70小時(shí)，降解菌濃度OD650nm＝1.0，Aroclor1242濃度2mg/L，即2ppm，降解的溶液為1ml蔗糖脂合成培養(yǎng)基，降解在30℃、150轉(zhuǎn)/分的搖床中進(jìn)行。
表頭說(shuō)明降解率一欄中的1、2、3表示同時(shí)進(jìn)行的三個(gè)平行樣實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)即在所有實(shí)驗(yàn)條件相同情況下進(jìn)行的兩組或多組實(shí)驗(yàn)。
降解率＝降解樣中PCBs的減少總量/對(duì)照樣PCBs的總量×100％分析設(shè)備日本島津2010氣相色譜儀，電子捕獲檢測(cè)器(ECD)色譜柱毛細(xì)管氣相色譜柱型號(hào)DB-1701，內(nèi)徑0.25mm，涂層厚度0.25μm，長(zhǎng)度60m分析條件分析時(shí)間120分鐘，標(biāo)準(zhǔn)品定性，八氯萘作為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)樣1μL，不分流進(jìn)樣。程序升溫，爐溫初始溫度150℃，以1.1℃/min的速度升溫至280℃，進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別是290℃和310℃，載氣純度為99.999％的超純氮。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)70小時(shí)的降解，平行實(shí)驗(yàn)樣1、2、3的Aroclor 1242的總降解率分別為98.02、98.23％和99.15％其中，不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯99.21～99.92％，3氯82.71～99.91％，4氯68.77～99.93％，5氯43.32～86.42％，6氯18.94～77.92％，7氯16.32～51.64％，降解結(jié)果說(shuō)明，在好氧情況下，對(duì)2-5氯取代的PCBs降解效率明顯高于6-7氯取代物。
表2 Raoultella terrigena LY402在土壤相中對(duì)Aroclor 1260各組分的降解率降解條件50g的粘土，Aroelor1260在其中的濃度為2.8mg/kg土壤，即2.8ppm，降解菌濃度為109個(gè)/g土壤，土著菌濃度為1011個(gè)/g土壤，含水量100％，為兼性厭氧體系，土壤的含水量用蔗糖脂合成培養(yǎng)基調(diào)節(jié)，在30℃靜止放置。
分析儀器、色譜柱、分析條件、降解率計(jì)算方法同表1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)降解2天，Aroclor 1260的總降解率為30.71％，其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯32.00～61.53％、3氯43.03～83.83％、4氯24.26～83.83％、5氯19.00～42.73％、6氯19.18～20.85％、7氯16.84～43.68％、8氯17.52～29.95％，9氯26.30％；(2)降解4天，Aroclor 1260的總降解率為76.85％其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯-5.26～84.25％、3氯-41.74～72.07％、4氯-41.64～56.91％、5氯36.67～72.96％、6氯46.96～52.41％、7氯49.33～68.50％、8氯45.86～62.33％，9氯55.99％；(3)降解6天，Aroclor 1260的總降解率為95.40％其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯26.24～91.43％、3氯63.46～82.45％、4氯-19.04～80.79％、5氯0.83～95.43％、6氯84.27～99.23％、7氯97.01～99.87％、8氯90.16～98.41％，9氯98.32％；(4)降解8天，Aroclor 1260的總降解率為96.55％；其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯15.39～92.59％、3氯7.74～78.99％、4氯-13.65～96.85％、5氯50.31～99.20％、6氯86.91～99.46％、7氯98.87～99.88％、8氯93.36～99.84％，9氯99.55％。結(jié)果說(shuō)明，在兼性厭氧條件下，對(duì)5-9氯PCBs降解效率明顯高于2-4氯取代物。
注解Aroclor是PCBs混合物的商品名稱，12代表聯(lián)苯環(huán)上的12個(gè)碳原子，42和60分別表示PCBs混合物中氯含量為42％和60％。氯含量越高表示PCBs混合物中高氯代的PCBs同系物越多。
菌種保藏說(shuō)明Raoultella terrigena LY402目前保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，保藏日期為2005年7月20日，保藏中心編號(hào)為1420。
并在此特向?qū)＠痔峁?1)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所檢測(cè)鑒定報(bào)告(2005)微檢字第139號(hào)；(2)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心所作出的保藏受理通知書及存活性報(bào)告書。
具體實(shí)施例方式
以下詳述本發(fā)明的最佳實(shí)施例。
實(shí)施例1
PCBs降解菌株的篩選Raoultella terrigena LY402降解菌株的獲得是通過(guò)篩選、分離純化、強(qiáng)化馴化等步驟進(jìn)行，具體如下第一步，初步篩選配制以聯(lián)苯為碳源并含各種礦物質(zhì)的液體合成培養(yǎng)基，將PCBs污染土壤加入到合成培養(yǎng)基中，其中能夠利用聯(lián)苯生長(zhǎng)的細(xì)菌將大量繁殖，將其反復(fù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)5～10次，依據(jù)傳代培養(yǎng)的混合菌對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解能力確定進(jìn)一步進(jìn)行菌株分離純化的對(duì)象。
配置聯(lián)苯含量分別為1和3g/L的液體合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中礦物鹽組成相同，含量各為KH2PO41.7g/L，K2HPO44.4g/L，NH4Cl2.1g/L，NaCl3.0g/L，酵母浸膏0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.195g/L，MnSO4.H2O 0.05g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.003g/L，pH值為7.0-7.2。將從不同污染點(diǎn)采到的土壤樣品各取1克，分別加入到50毫升的初篩培養(yǎng)基中，在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中培養(yǎng)3-5天，再取菌懸液1毫升，加入到50毫升的初篩培養(yǎng)基中，在相同條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)5-10次，其中能夠大量繁殖的菌株均能夠利用聯(lián)苯作為碳源。取上述來(lái)自不同污染點(diǎn)的菌懸液10毫升，分別加入2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯，使其濃度為2mg/L，在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中降解3-5天，用正己烷萃取2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯，用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)確定2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的殘余量，其目的是減少進(jìn)一步分離純化的工作量。在50個(gè)土壤樣品的菌懸液中，均發(fā)現(xiàn)有利用聯(lián)苯的微生物生長(zhǎng)，但只有三個(gè)樣品含有能夠降解2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的微生物。
第二步，菌株的分離純化配制聯(lián)苯液體培養(yǎng)基，組成與第一步相同，但在其中加入10-15g/L的瓊脂，使其成為固體培養(yǎng)基并在表面皿中鋪成固體平板，將第一步中能夠降解2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的混合菌懸液分別用無(wú)菌水稀釋100～10000倍，在固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間2-5天，從中分離出12個(gè)不同的單菌落，再用相同成分的液體培養(yǎng)基分別進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
第三步，降解PCBs菌株的進(jìn)一步篩選取第二步中已經(jīng)分離純化的12種細(xì)菌的菌懸液各50毫升，離心，取沉淀的菌泥，加入0.1mol/L的磷酸緩沖液中，使其OD650nm＝1.0，分別加入2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯，使其濃度為2mg/L，在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中降解3天和5天，檢測(cè)其中2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的殘余量，結(jié)果有三個(gè)菌株對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯有降解，將菌株命名為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)菌株對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的3天和5天的降解率分別為13.21％和18.34％、25.82％和33.51％、59.26％和64.69％，其中3號(hào)菌株的降解效果最顯著。
第四步，3號(hào)菌株的進(jìn)一步強(qiáng)化馴化按照第一步的方法制備聯(lián)苯液體合成培養(yǎng)基，外加10和50mg/L等比例的Aroclor 1242與Aroclor 1260混合物，作為3號(hào)菌株的強(qiáng)化馴化培養(yǎng)基，對(duì)3號(hào)菌株進(jìn)行3個(gè)月的傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同第一步，其中聯(lián)苯的用量為2g/L。強(qiáng)化馴化過(guò)程中，每隔10天對(duì)3號(hào)菌株的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯降解能力進(jìn)行一次測(cè)試。測(cè)試方法為取菌懸液50毫升，離心，取沉淀的菌泥，加入0.1mol/L的磷酸緩沖液中，使其OD650nm＝1.0，分別加入2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯，使其濃度為2mg/L，在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中降解3天，利用GC-ECD檢測(cè)其中2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的殘余量，計(jì)算降解率。10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的相對(duì)降解率分別為65.8％、70.1％、78.2％、81.4％、83.2％、85.5％、86.8％、87.1％、86.7％，結(jié)果顯示出強(qiáng)化馴化能夠提高3號(hào)菌株的降解效率，但在2個(gè)月以后菌株的降解效果已基本穩(wěn)定，即可將2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯降解約85％以上，降解能力提高25％以上。
實(shí)施例2菌株的鑒定和特性經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)鑒定，3號(hào)菌株的種屬為Raoultella terrigena，別名為Klebsiella terrigena，命名為L(zhǎng)Y402，該菌株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，保藏日期為2005年7月20日，保藏中心編號(hào)為1420，該菌株是兼性厭氧菌。對(duì)該菌株能夠生長(zhǎng)的溫度和酸度范圍進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。首先利用200毫升蔗糖脂合成培養(yǎng)基對(duì)Raoultella terrigena LY402進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基的組成與實(shí)施例1中的第一步相同，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌體密度達(dá)到OD650nm＝1.0時(shí)，停止培養(yǎng)，將菌懸液平均分裝在20個(gè)樣品管中，每管的菌懸液體積為10毫升，取出10管進(jìn)行溫度耐受實(shí)驗(yàn)，另外10管進(jìn)行酸度耐受實(shí)驗(yàn)。取的溫度范圍是-80℃、-20℃、0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、60℃、80℃、100℃；pH值范圍是1.0、2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0(用0.1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)菌懸液的pH值)。20個(gè)樣品管在上述不同的環(huán)境條件下放置24小時(shí)，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌懸液的密度，用0.1％的次甲基蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞的存活程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在-80℃、-20℃、0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、60℃、80℃、100℃的溫度下，懸浮液的菌密度分別是0.83、0.94、0.95、1.08、1.2、1.58、1.45、0.98、0.64、0.34，在100℃，細(xì)胞沉降嚴(yán)重，幾乎未發(fā)現(xiàn)活的細(xì)胞。在80℃，部分細(xì)胞沉降，有約3/5的細(xì)胞存活，在-80℃，約70％的細(xì)胞存活，-20℃～60℃，細(xì)胞活性較好，但只在20℃～40℃有明顯的生長(zhǎng)。在不同pH值情況下，LY402生長(zhǎng)狀況和活性檢測(cè)結(jié)果如下在pH值為1.0、2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0的酸度下，懸浮液的菌密度分別是0.23、0.56、0.85、1.28、1.42、1.67、1.68、1.38、0.92、0.31，在pH1.0及pH14.0，幾乎沒(méi)有LY402存活，在pH2.0的體系中，約有1/3的LY402存活，在pH3.0～12.0，LY402均具有較好的活性，在pH5.0～10.0，LY402有明顯的生長(zhǎng)。
實(shí)施例3取代聯(lián)苯、促進(jìn)PCBs生物降解碳源的篩選分別以聯(lián)苯、葡萄糖、甘油、非離子表面活性劑OP-10、Tween-20、Tween-80、Triton-100以及生物表面活性劑蔗糖脂為碳源，外加與實(shí)施例1第一步中初篩培養(yǎng)基含量相同的礦物質(zhì)，制備8種液體合成培養(yǎng)基，其中，碳源的用量為2g/L。取Raoultella terrigena LY402菌懸液1毫升，分別加入到上述50毫升含有不同碳源的8種培養(yǎng)基中，在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中培養(yǎng)3-5天，使其達(dá)到菌密度OD650nm＞2.0，取出，傳代培養(yǎng)3次。分別將不同碳源培養(yǎng)的50毫升菌懸液離心，取沉淀的菌泥，加入0.1mol/L的磷酸緩沖液中，使其OD650nm＝1.0，分別加入2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯，使其濃度為2mg/L。在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中降解3天和5天，利用GC-ECD檢測(cè)其中2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的殘余量，計(jì)算2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯降解率分別為79.21％和85.43％、20.50％和28.13％、18.32％和25.46％、38.61％和46.71％、46.52％和57.63％、48.45％和63.78％、43.54％和55.69％、85.24％和86.73％，其中，以生物表面活性劑蔗糖脂為碳源的菌株對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解效率最高。
實(shí)施例4Raoultella terrigena LY402對(duì)好氧體系中Aroclor 1242的降解取1ml濃度為2mg/L的Aroclor 1242正己烷溶液，加入到5ml的滅菌瓶中，同樣方法制備12瓶，用氮?dú)獯蹈?，使PCBs吸附到玻璃瓶底部。將生長(zhǎng)于蔗糖脂合成培養(yǎng)基中的OD650nm＝1.0的菌懸液分別取出1ml加入到上述9個(gè)吸附瓶中，剩余的3個(gè)吸附瓶加不含降解菌的蔗糖脂合成培養(yǎng)基，以此作為對(duì)照樣，用8層紗布封口，使空氣自由進(jìn)入，過(guò)程完全好氧。其中，每個(gè)瓶中Aroclor 1242濃度均為2mg/L，在30℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中降解，降解4、10、70小時(shí)，分別取出3瓶降解樣、1瓶對(duì)照樣，正己烷萃取，GC-ECD分析其中Aroclor 1242的濃度，降解率的計(jì)算方法是降解樣中PCBs的減少總量除以對(duì)照樣中PCBs的總量再乘以100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示降解時(shí)間為4、10、70小時(shí)時(shí)，三個(gè)平行樣Aroclor 1242的總降解率分別為71.87％、74.68％和75.03％；96.13％、97.16％和97.62％；98.02、98.23％和99.15％。在70小時(shí)時(shí)，對(duì)Aroclor 1242中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯99.21～99.92％，3氯82.71～99.91％，4氯68.77～99.93％，5氯43.32～86.42％，6氯18.94～77.92％，7氯16.32～51.64％。降解結(jié)果說(shuō)明，在好氧情況下，對(duì)2-5氯取代的PCBs降解效率明顯高于6-7氯取代物，對(duì)于低氯取代PCBs占主體的Aroclor 1242(主要為2氯、3氯、4氯取代的PCBs同系物)，好氧降解效果顯著。
實(shí)施例5Raoultella terrigena LY402對(duì)兼性厭氧體系中Aroclor1260的降解取50ml濃度為2.8mg/L的Aroclor1260(主要成分為高氯取代的PCBs)正己烷溶液，與25g的粘土混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，PCBs均勻地吸附在粘土表面，再與25g含有土著菌的粘土混勻。用這一方法制備了每Kg土壤含2.8mgAroclor 1260(2.8ppm)的模擬PCBs污染土壤。利用蔗糖脂合成培養(yǎng)基培養(yǎng)Raoultella terrigena LY402，使其濃度達(dá)到OD650nm＝2.0，取菌懸液50ml加入到50g含有2.8mg/Kg土壤的Aroclor1260的粘土中，混合均勻，制成100％水含量的泥漿體系，其中，降解菌濃度為109個(gè)/g土壤，土著菌濃度為1011個(gè)/g土壤。在30℃靜止放置。每隔兩天取出2克濕重的泥漿，利用索氏萃取(正己烷為萃取劑)將土壤中的PCBs充分脫附下來(lái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，定容，GC-ECD分析其中PCBs同系物含量的變化，利用60米長(zhǎng)的DB1701色譜柱定性、定量了從2氯取代～9氯取代的102種PCBs同系物，結(jié)果表明(1)降解2天，Aroclor 1260的總降解率為30.71％，其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯32.00～61.53％、3氯43.03～83.83％、4氯24.26～83.83％、5氯19.00～42.73％、6氯19.18～20.85％、7氯16.84～43.68％、8氯17.52～29.95％，9氯26.30％；(2)降解4天，Aroclor 1260的總降解率為76.85％，其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯-5.26～84.25％、3氯-41.74～72.07％、4氯-41.64～56.91％、5氯36.67～72.96％、6氯46.96～52.41％、7氯49.33～68.50％、8氯45.86～62.33％，9氯55.99％；
(3)降解6天，Aroclor 1260的總降解率為95.40％，其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯26.24～91.43％、3氯63.46～82.45％、4氯-19.04～80.79％、5氯0.83～95.43％、6氯84.27～99.23％、7氯97.01～99.87％、8氯90.16～98.41％，9氯98.32％；(4)降解8天，Aroelor 1260的總降解率為96.55％，其中不同氯取代PCBs的降解速率分別為2氯15.39～92.59％、3氯7.74～78.99％、4氯-13.65～96.85％、5氯50.31～99.20％、6氯86.91～99.46％、7氯98.87～99.88％、8氯93.36～99.84％，9氯99.55％。
從以上結(jié)果說(shuō)明，在100％水含量的泥漿體系中，6氯取代以上的PCBs同系物均得到了有效的降解，8天的降解率為86.91～99.46％，其中，絕大部分高氯取代的PCBs同系物8天的降解率達(dá)到90％以上。對(duì)于5氯以下取代的PCBs同系物，在降解第二天時(shí)，降解速率明顯高于6氯取代以上的PCBs同系物，降解效果明顯，但隨著降解時(shí)間的增加，降解速率增加緩慢，明顯低于6氯取代以上的PCBs同系物，個(gè)別低氯取代的PCBs同系物，其含量在第四天有明顯的增加，但隨著降解時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，其含量逐漸減少。以上的數(shù)據(jù)說(shuō)明，靜止的泥漿體系，是一缺氧環(huán)境，在降解初期，水中有一定的溶氧量，好氧降解占主導(dǎo)，所以低氯取代同系物降解效果明顯，但隨著氧氣的消耗，體系逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿毖跎踔羺捬醯沫h(huán)境，高氯取代同系物含量的迅速減少，部分低氯取代PCBs同系物的增加說(shuō)明高氯取代的PCBs存在明顯的脫氯現(xiàn)象，即高氯取代的PCBs同系物脫掉一部分氯原子成為某些低氯取代的PCB。但在缺氧嚴(yán)重的情況下，低氯取代同系物的降解速度緩慢，由此推測(cè)，向降解體系中補(bǔ)充空氣，提高水中溶氧量，低氯取代的PCBs同系物將得到快速降解。
附表表1 Raoultella terrigena LY402在水相中對(duì)Aroclor1242中各組分的降解率

續(xù)表1首頁(yè)

表2 Raoultella terrigena LY402在土壤相中對(duì)Aroclor 1260各組分的降解率

續(xù)表2首頁(yè)

續(xù)表2次頁(yè)

權(quán)利要求
1.一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法，包括從多氯聯(lián)苯的污染點(diǎn)取樣，經(jīng)過(guò)初篩、分離、純化菌株，再經(jīng)篩選及強(qiáng)化馴化PCBs降解菌株的步驟，獲得了一株降解PCBs的新菌株，其特征在于a)經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC鑒定，該菌株的種屬為Raoultella terrigena，別名為Klebsiella terrigena，命名為L(zhǎng)Y402，保藏中心編號(hào)為1420，該菌株是兼性厭氧菌，能夠在溫度-20℃～60℃、pH值為3.0～12.0的環(huán)境中存活，適宜生長(zhǎng)的溫度為20℃～40℃，pH值為5.0～10.0；b)該菌株Raoultella terrigena LY402的獲得方法，是第一步采用1～3g/L聯(lián)苯為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，利用第二步稀釋及平板劃線法分離純化菌株，通過(guò)第三步檢測(cè)不同菌株對(duì)2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解能力進(jìn)一步篩選，得到該P(yáng)CBs降解菌株，該菌株對(duì)2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的3～5天降解率為59.26％～64.69％；為了進(jìn)一步提高該菌株對(duì)PCBs的降解能力，第四步采用了2g/L聯(lián)苯及PCBs混合物為碳源進(jìn)行強(qiáng)化馴化，其中，PCBs是商用Aroclor 1242與Aroclor 1260的等量混合物，含量為10-50mg/L，馴化時(shí)間為2-3個(gè)月，2mg/L的2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的3天降解率提高到86.7％，提高了25％以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法，其特征在于篩選出能夠取代聯(lián)苯、促進(jìn)PCBs降解的其它碳源，菌株Raoultellaterrigena LY402分別采用聯(lián)苯、葡萄糖、甘油、非離子表面活性劑OP-10、Tween-20、Tween-80、Triton-100以及生物表面活性劑蔗糖脂為碳源，3天～5天，對(duì)2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的降解率分別為79.21～85.43％、20.50～28.13％、18.32～25.46％、38.61～46.71％、46.52～57.63％、48.45～63.78％、43.54～55.69％和85.24～86.73％，其中，每種碳源的用量均為2g/L，2，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯的用量為2mg/L，通過(guò)篩選證實(shí)該菌株利用聯(lián)苯以外的其它碳源也能降解PCB，并獲得了可以取代聯(lián)苯的高效碳源—蔗糖脂。
3.應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述的一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法，其特征在于a)在好氧的水相體系中，針對(duì)2mg/L的Arolor1242，在30℃，經(jīng)過(guò)70小時(shí)的降解，Aroclor 1242的總降解率為98.02～99.15％，其中不同氯取代PCBs的降解速率為2氯99.21～99.92％，3氯82.71～99.91％，4氯68.77～99.93％，5氯43.32～86.42％，6氯18.94～77.92％，7氯16.32～51.64％，對(duì)2-5氯取代的PCBs降解效率明顯高于6-7氯取代物；b)在兼性厭氧條件下即100％水含量的土壤泥漿體系中，針對(duì)2.8mg/Kg土壤的Aroclor 1260，在30℃，經(jīng)過(guò)8天降解，Aroclor 1260的總降解率為96.55％，其中，不同氯取代PCBs的降解速率為2氯15.39～92.59％、3氯7.74～78.99％、4氯-13.65～96.85％、5氯50.31～99.20％、6氯86.91～99.46％、7氯98.87～99.88％、8氯93.36～99.84％，9氯99.55％，對(duì)5-9氯PCBs降解效率明顯高于2-4氯取代物；c)在好氧及兼性厭氧的條件下，該菌株能夠降解2-9氯不同氯取代位點(diǎn)的PCBs。
全文摘要
環(huán)境生物工程領(lǐng)域中的一株降解多氯聯(lián)苯的兼性厭氧菌及獲得方法，包括從多氯聯(lián)苯的污染點(diǎn)取樣，經(jīng)過(guò)初篩、分離、純化菌株，再經(jīng)篩選及強(qiáng)化馴化PCBs降解菌株的步驟，獲得了一株高效降解PCBs的新菌株Raoultella terrigena LY402。該菌株為兼性厭氧菌，能夠利用生物表面活性劑蔗糖脂為碳源快速降解2，3′，4，4′－四氯聯(lián)苯；在好氧情況下對(duì)Aroclor1242的70小時(shí)降解率為98.02～99.15％；在兼性厭氧情況下，對(duì)土壤中Aroclor1260的8天降解率為96.55％。優(yōu)點(diǎn)①能夠降解不同取代位點(diǎn)的PCBs；②能夠利用蔗糖脂高效降解PCBs，無(wú)二次污染。
文檔編號(hào)B09C1/10GK1793311SQ20051004791
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者賈凌云, 文成玉, 蔣彩平, 楊鳳林 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)