專利名稱：苯系化合物兼性厭氧降解菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于降解微生物技術(shù)領(lǐng)域，也屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉 及一株苯系化合物兼性厭氧降解菌。
背景技術(shù)：
苯系化合物是一類易揮發(fā)的芳香烴類化合物，包括苯、甲苯、乙苯、鄰、間、對二 甲苯等，除了存在于汽油燃料中，苯系化合物作為原材料還被廣泛應(yīng)用于橡膠、潤滑劑、 染料、洗滌劑、藥品和農(nóng)藥的生產(chǎn)制造中(Romy Chakraborty, John D. Coates. 2005. Hydroxylationand Carboxylation-Two Crucial Steps of Anaerobic Benzene Degradation by DechloromonasStrain RCB. Applied and environmental microbiology, Sept. 2005，p. 5427-5432)。苯系化合物在石油烴中含量不高然而卻很受重視，是石油 烴中水溶性最好的組分，沉積物-水彌散系數(shù)相對較低(Coleman，W. Ε.，J. W. Munch, R. P. Streicher，H. P. Ringhand, and F. C. Kopfler. 1984. Identification and measurement of components in gasoline, kerosene, and no. 2 fuel oil thatpartition into the aqueous phase after mixing. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 13 :171—178·)，弱口及附于 含水層物質(zhì)，而且是可逆吸附，在地下水中易于遷移，構(gòu)成了地下水中常見的有機(jī)污染物。 其具有嚴(yán)重的致癌、致畸、致突變性，被許多國家列為優(yōu)先控制污染物。生物降解是苯系化合物自然衰減的重要機(jī)制，也是控制地下水中溶解的苯系化合 物遷移的主要措施(Silvia A. Mancini，Ania C. Ulrich, Georges Lacrampe-Couloume, et al.2003.Carbonand Hydrogen Isotopic Fractionation during Anaerobic Biodegradation of Benzene. Applied andenvironmental microbiology, Jan. 2003, p. 191-198)。有分子氧存在的條件下，苯系化合物可以被生物降解。然而，地下水中溶 解氧的快速消耗對微生物會產(chǎn)生大量的厭氧區(qū)，因此，在過去的二十年中許多研究都集 中在苯系化合物的厭氧生物降解上，但厭氧降解機(jī)理仍然沒有完全清楚。同時(shí)，厭氧苯 系化合物生物降解面臨著降解反應(yīng)產(chǎn)能較低，降解不易進(jìn)行徹底等問題。相比之下，兼 性厭氧微生物降解苯系化合物技術(shù)更具實(shí)際意義。已有研究發(fā)現(xiàn)的苯系化合物降解菌 主要有假單胞菌(Pseudomonas)、不動桿菌(Acinetobacter)、芽孢桿菌(Bacillus)、 紅球菌(Rhodococcus)、諾卡氏菌(Nocardia)、羅爾其Jf通氏菌(Ralstonia)、產(chǎn)堿桿菌 (Alcaligenes)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株苯系化合物兼性厭氧降解菌，它能夠在兼氧條件下降解 苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯。本發(fā)明所提供的苯系化合物兼性厭氧降解菌，其特征是它為施氏微桿菌 (Microbacterium schleiferi) HBSD-C CCTCC NO :M209284，已于 2009 年 11 月 27 日保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號CCTCC NO :M209284。
所述的施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD_C的菌落形態(tài)淺黃色、 圓形、半透明、邊緣整齊、凹陷、表面光滑；細(xì)胞為直桿狀，革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動；主要生 化特征氧化酶陽性，接觸酶陽性，利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不利用麥芽糖，反硝化陽性，明 膠水解陰性，兼性厭氧，在4°C 41°C生長(不可以在60°C生長)。所述的苯系化合物包括苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯中的任意一種或任意二種以上 的混合，任意二種以上混合時(shí)為任意配比。本發(fā)明從大慶油田某地區(qū)受原油污染的土壤中篩選分離得到一株新的施氏微桿 菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C，它能夠在兼氧條件下降解苯、甲苯、二甲苯、均三 甲苯，對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，可以應(yīng)用于受苯系化合物污染地下水的治理修復(fù)。為兼氧苯系化合 物微生物降解機(jī)理的研究提供了重要基礎(chǔ)，將在環(huán)境污染治理修復(fù)，特別是受苯系化合物 污染地下水治理實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。


圖 1 為施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C 的菌落形態(tài)圖。圖2為施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C的PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳 圖(C 擴(kuò)增產(chǎn)物，M =Marker)。圖3為施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C的苯系化合物72h降解 性能柱狀圖。圖 4a 為 pH 對施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C 生長的影響圖。圖4b為溫度對施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD_C生長的影響圖。圖4c為含鹽量對施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C生長的影響圖。
具體實(shí)施例方式1 一株苯系化合物兼性厭氧降解菌的篩選方法1.1材料準(zhǔn)備1.1.1 菌源采集大慶油田油污區(qū)，表層以下5-lOcm的土壤樣品。1.1. 2 培養(yǎng)基無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基0.42g · L-1NaNO3,0. 27g · L-1NH4Cl, 7. 9g · L^1Na2HPO4 · 12H20, 1. 5g · L-1KH2PO4,1. Og · L-1MgSO4 · 7H20,1. OmL · L—1微量元素溶液(微量元素溶液的配比 為2. 14g · IZ1ZnCl2, 2. 5g · IZ1MnCl2 · 4Η20，0· 3g · [1CoCl2 · 6Η20，0· 2g · L-1CuCl2 · 2H20, 0. 4g · IZ1NaMoO4 · 2H20, 4. 5g · IZ1CaCl2 · 2H20, 2. 9g · IZ1FeCl3 · 6H20, 1. Og · IZ1H3BO3, 0. Ig · Lll，IL 去離子水)，0· 472g · Γ1 丁二酸鈉，IL 蒸餾水，pH = 7. 0ο瓊脂培養(yǎng)基1L無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基+20g · Γ1瓊脂。LB 培養(yǎng)基1. Og · L—1 酵母粉(YEAST EXTRACT)，2g · L—1 蛋白胨(TRYPT0NE)， 2g · L-1NaCl, IL 蒸餾水，pH = 7. 0。斜面培養(yǎng)基1.Og ·廠1 酵母粉(YEASTEXTRACT)，2g · L—1 蛋白胨(TRYPT0NE)， 2g · L-1NaCl, 15g · Γ1 瓊脂，IL 蒸餾水，pH = 7. 0。
以上培養(yǎng)基分別于121. 5°C條件下蒸汽滅菌30mins后備用。1. 1. 3實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備氣相色譜儀HP 6890N氣相色譜(具FID檢測器)；色譜柱HP-5毛細(xì)管柱 30mX0. 32mmX0. 25 μ m ；SW-CJ-2FD 超凈工作臺；TGL-16A臺式高速冷凍離心機(jī)；CA-I型靜音無油空氣泵；
SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器；LDZX-40SAI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋；PHX型智能生化培養(yǎng)箱；DHG-9423A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SHA-C型恒溫水浴振蕩器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；78-1磁力攪拌器；海爾BCD-301W H 冰箱；Mastercycler 印 gradient S 銀質(zhì)梯度 PCR 儀；UVP EC3600凝膠成像系統(tǒng)等。1. 2 施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C 的分離1. 2. 1菌株的馴化篩選取5g 土壤樣品于50mL離心管中，用自來水洗滌，在8000r/min條件下離心5mins， 共3次以去除腐殖酸。在IOOmL的搖瓶中加入50mL無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基，分析純的苯、甲 苯、二甲苯、均三甲苯各6. 25 μ L，丁二酸鈉23. 6mg和離心洗滌的土樣搖勻，用硅膠塞和 Parafilm封口膜密封。在30°C、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)2_4天，視菌懸液的渾濁程度決 定是否結(jié)束第一個周期的馴化培養(yǎng)。此后，取菌懸液200 μ L，丁二酸鈉含量等梯度遞減(按 4個梯度，等梯度遞減)，苯系化合物含量等梯度遞增(按4個梯度，等梯度遞減)，其他條件 不變馴化培養(yǎng)。第四個周期時(shí)，50mL培養(yǎng)基中丁二酸鈉含量為零，苯、甲苯、二甲苯、均三甲 苯各50 μ L，得到馴化培養(yǎng)的菌懸液。馴化周期結(jié)束后，菌懸液中的降解菌群能夠利用苯系 化合物作為唯一碳源和能源。馴化條件如表1所示。表1降解菌馴化實(shí)驗(yàn)條件 1. 2. 2菌株的分離純化在1. 5mL滅菌的離心管中，加入馴化培養(yǎng)后的菌懸液50 μ L，無菌水1. OmL，等梯度 稀釋6個梯度。瓊脂培養(yǎng)基滅菌冷卻至40°C左右時(shí)，加入分析純的苯、甲苯、二甲苯、均三甲 苯各200 μ L，搖勻，快速倒平板，冷卻得分離菌落用平板。將第五、第六個濃度梯度稀釋的菌 懸液20 μ L涂布平板上。將平板于30°C條件下，恒溫培養(yǎng)3-5天。挑取長勢好的一個菌落 進(jìn)行純培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)后的菌落。于18mmX 180mm的試管中加入IOmL無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基，加入苯、甲苯、二甲苯、均 三甲苯各10yL，用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)后的菌落接種于其中，硅膠塞和Parafilm封口膜密 封。于30°C、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，取菌懸液涂板，方法同上所述。純培養(yǎng) 2-3次，直至獲得單一菌株，記為菌株HBSD-C[施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C]，觀察記錄平板上菌株生長狀況、菌落特征。將菌株HBSD-A (即純化的菌種)劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，于4°C冰箱儲存，每個 月都用無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基和苯系化合物活化培養(yǎng)(即入IOmL無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基，加入苯、 甲苯、二甲苯、均三甲苯各10 μ L)、涂布平板再接種于斜面上以備后續(xù)試驗(yàn)用。為了長期保 藏菌株HBSD-C，已于2009年11月27日將菌株HBSD-C送中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。2 施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C 的鑒定2. 116S rDNA 全序列測定2. 1. 1細(xì)菌基因組DNA的提取(革蘭氏陽性菌)a)超凈臺內(nèi)將分離得到的菌種HBSD-C接種于含IOg 葡萄糖的LB培養(yǎng)基(用 無菌牙簽蘸取)，5mL/tubeX2，于37°C 220rpm離心過夜。b)超凈臺內(nèi)將IOmL菌液轉(zhuǎn)移至50mL圓底離心管。4°C 5000rpm離心20min。c)棄上清，加入1. 2mL IOmM Tris-Cl (三羥甲基氨基甲烷緩沖液)(PH8. 0)/25% Sucrose, vortex 懸浮，分裝到 2 只 1. 5mL EP 管(0. 6mL/EP)。d)加入lOmg/mL溶菌酶(新鮮配制)，使終濃度為lmg/mL，混勻，37°C水浴IOmin。e)加入200g · L^1SDS (十二烷基磺酸鈉溶液)，使其終濃度為5g · L—1 ；加入蛋白酶 K，使終濃度為100 μ g/mL，輕柔混勻。50°C水浴3h，期間不時(shí)顛倒混勻。f)冷至室溫，加入等體積酚/氯仿，充分顛倒混勻lOmin。g)室溫 5000rpm 離心 15min，取上清。h)重復(fù)步驟f)、步驟g) —次。i)加入等體積氯仿，充分顛倒混勻lOmin。室溫5000rpm離心15min，取上清。j)兩只EP合并，分至3只EP管(約0. 4mL/EP)。k)每EP管加入2體積預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積的3M NaOAC (醋酸鈉)(使其 終濃度為0. 3M)，-20°C沉淀2h或過夜。1)0°C離心，最大轉(zhuǎn)速(或5000rpm)，棄上清。m)加入半管(約700 μ 1)70%乙醇洗滌，4°C離心，最大轉(zhuǎn)速(或5000rpm)，棄上清。η)室溫干燥。ο)溶于適量 TE (ΡΗ7. 4) (20 50 μ L)，加入 10mg/mL RNase (RNA 水解酶)，使終濃度為 20 μ g/mL, 37°C水浴 2h。ρ)重復(fù)酚/氯仿抽提，無水乙醇/3M NaOAC沉淀，70%乙醇洗滌。(步驟及方法同 上)。q)用適量3dH20 (滅菌三蒸水)溶解DNA沉淀。r)_20°C 保存。2. 1. 216S rDNA 基因的 PCR 擴(kuò)增a) PCR擴(kuò)增引物P1 正向引物 5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，P2 反向引物 5，GGTTACCTTGTTACGACTT3，b)反應(yīng)體系在50yL反應(yīng)體積中，加入IyL模板DNA(0. lyg)，0. 5yL Pl和P2(終濃度為 0. 5 μ Μ)，1 μ LdNTP (每種 NTPO. 2mM)，0. 5 μ LTaq 聚合酶(2U)禾口 5 μ L 10 X PCR 緩沖液。PCR 擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5mins ；在94°C變性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)30 次；最后72°C終延伸lOmins。將PCR產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。2. 1. 316S rDNA 全序列測定PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，用Applied Biosystem 373ADNA測序儀進(jìn)行測序。本發(fā)明采用對16S rDNA全序列測定和分析的方法對細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。 以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到長度為1420bp的擴(kuò)增帶(用瓊脂糖凝膠電泳檢測)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序 列。序列如下<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120>苯系化合物兼性厭氧降解菌<160>1420<210>1<211>1420bp<212>DNA<213> 施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C<400>11 TGGCCGCGTGCTTTACACATGCGAGTCGGACGGTGAAGCAGAGCTTGCTCTGTGGATCAG
61 TGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAATCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAA121 ACGGCGTCTAATACCGGATACGAGCTGCGAAGGCATCTTCAGCAGCTGGAAAGAATTTCG181 GTCAGGGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGTC241 GACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT301 CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGC361 CGCGTGAGGGACGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGT421 GACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG481 GGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCT
541 GCTGTGAAAACCCGAGGCTCAACCTCGGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCG601 GTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACC661 GATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCA721 AACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGACC781 ATTCCACGGTTTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCG841 CAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTA901 ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAAT961 GGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG1021 AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAAT1081 GGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAA1141 TCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTG1201 CAATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCA1261 ACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATA1321 CGTTCCGGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGTAAGTCGGTAACACCCGAAGCC1381 GGTGGCCCAACCCTTCTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTTGGA根據(jù)降解菌HBSD-C的上述特性，將其鑒定為施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)02.2菌落形態(tài)特征以及生理生化特性2. 2.1菌落形態(tài)特征見圖1。苯系化合物降解菌HBSD-C的菌落呈淺黃色、圓形、半透明、邊緣整齊、凹 陷、表面光滑。2. 2. 2生理生化特征生理生化性質(zhì)的測定參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第八版的方法。見表2。表2降解菌HBSD-C主要的生理生化特征
表中符號說明“ + ”90%以上的菌株為陽性，“_”:90%以上的菌株為陰性。表2說明細(xì)胞為直桿狀，革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動；主要生化特征氧化酶陽性， 接觸酶陽性，利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不利用麥芽糖，反硝化陽性，明膠水解陰性，兼性厭 氧，在4°C 41°C生長(不可以在60°C生長)。2. 3 施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C 為新的菌株測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與國際GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比 較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株與Microbacterium schleiferi (施氏微桿菌)的同源性高達(dá)99%以上。綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C為新的菌株(即一株苯系化合物兼性厭氧降解菌)。已于2009年11 月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號CCTCC NO :M209284。3 一株苯系化合物兼性厭氧降解菌的應(yīng)用3. 1施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C對苯系化合物的降解性能a)用接種環(huán)挑取斜面冷藏保存的少量施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C菌苔，接種于接種于含苯、甲苯、二甲苯和均三甲苯各10 μ L，無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基 IOmL的已滅菌30mL (Φ 18*180mm)試管中，于30°C條件下恒溫振蕩活化培養(yǎng)36h后，得到活 化培養(yǎng)的菌懸液；b)將IOOmL搖瓶經(jīng)滅菌冷卻至常溫后，在超凈臺內(nèi)，加入50mL無機(jī)鹽分離培 養(yǎng)基，分析純的苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各10 μ L，活化培養(yǎng)的菌懸液50 μ L，硅膠塞和 ParafiIm封口膜密封。單一苯系化合物初始濃度約為175. 8mg/L,同時(shí)設(shè)不接種的空白樣；c)將實(shí)驗(yàn)樣和空白樣于30°C恒溫水浴振蕩培養(yǎng)；
d)72h后，對培養(yǎng)后的實(shí)驗(yàn)樣和培養(yǎng)后的空白樣中四種苯系化合物的含量用頂 空——?dú)庀嗌V法進(jìn)行測定。測試前，將樣品在6(TC、2(K)r/min條件下平衡30mins。測試 條件為HP6890N氣相色譜儀，帶FID，色譜柱為HP_530mX0. 32mmX0. 25 ym毛細(xì)管柱，高純 氮?dú)庾鲚d氣。柱溫初始溫度40°C，保持lmin，以6°C /min的速度升溫至80°C，保持4min ； 檢測室溫度250°C ；汽化室溫度220°C。取100 ii L頂空氣體進(jìn)樣。苯系化合物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和圖3所示。表3兼氧降解菌HBSD-C對苯系化合物72h的降解率 表3說明一株苯系化合物兼性厭氧降解菌能夠它能夠在兼氧條件下降解苯、甲 苯、二甲苯和均三甲苯，對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。3. 2用施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C對受苯系化合物污染地 下水的處理采集大慶油田油污區(qū)受苯系化合物污染地下水500mL(即水樣)，將水樣于4°C條 件下密封保存，2周內(nèi)分析測試。經(jīng)測定該受苯系化合物污染地下水中苯、甲苯、鄰二甲苯和 均三甲苯含量分別為 12. 546mg/L、4. 152mg/L、7. 213mg/L、5. 976mg/L。a)用接種環(huán)挑取斜面冷藏保存的少量施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi) HBSD-C菌苔，接種于含苯、甲苯、二甲苯和均三甲苯各10 iiL，無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基10mL的已 滅菌30mL(①18*180mm)試管中，于30°C條件下恒溫振蕩活化培養(yǎng)36h后，得到活化的菌懸 液；b)將100mL搖瓶經(jīng)滅菌冷卻至常溫后，加入50mL受苯系化合物污染地下水，活化 的菌懸液50 u L，硅膠塞和Parafilm封口膜密封，得到實(shí)驗(yàn)水樣；同時(shí)設(shè)不接種的空白水 樣；c)將實(shí)驗(yàn)水樣于30°C恒溫水浴振蕩培養(yǎng)；將空白樣于30°C恒溫水浴振蕩培養(yǎng)。d)72h后，對培養(yǎng)后的實(shí)驗(yàn)水樣(得到降解后的地下水)和培養(yǎng)后的空白樣中四種 苯系化合物的含量用頂空——?dú)庀嗌V法進(jìn)行測定。測試前，將樣品在60°C、200r/min條 件下平衡30mins。測試條件同上所述。苯系化合物降解效果如表4所示。表4兼氧降解菌HBSD-C對苯系化合物72h的降解率 3. 3施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C最適生長的基本條件實(shí)驗(yàn)a)為了考察在不同溫度、不同pH、不同含鹽量條件下，菌株HBSD-C的生長情況，在 其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，分別調(diào)節(jié)LB培養(yǎng)基的溫度為4°C、15°C、25°C、4(TC ；pH為4、 5、7、9 ；含鹽量為1%、2%、3%、4%，每隔24小時(shí)測定培養(yǎng)液的光密度值( ·。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如 圖4a至圖4c。b)從圖4a可以看出，菌株HBSD-C在4°C環(huán)境中生長緩慢，而在15°C、25°C、40°C條 件下的OD6tltl值均較高，最適生長溫度在25°C左右；從圖4b可以看出，菌株在酸性環(huán)境中生 長情況微弱，而在PH7 9的中性及弱堿性環(huán)境中均能較好的生長；從圖4c可以看出，降解 菌在1%、2%、3%、4%的鹽度中均能生長，各種生長情況差異不大，適宜在 2%相對 較低的鹽度環(huán)境生長。
權(quán)利要求
苯系化合物兼性厭氧降解菌，其特征是它為施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD C CCTCC NOM209284，已于2009年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM209284。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯系化合物兼性厭氧降解菌，其特征是所述的施氏微桿菌 (Microbacterium schleiferi)HBSD-C的菌落形態(tài)淺黃色、圓形、半透明、邊緣整齊、凹陷、 表面光滑；細(xì)胞為直桿狀，革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動；主要生化特征氧化酶陽性，接觸酶陽 性，利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不利用麥芽糖，反硝化陽性，明膠水解陰性，兼性厭氧，在4°C 41°C生長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯系化合物兼性厭氧降解菌，其特征是所述的施氏微桿菌 (Microbacterium schleiferi) HBSD-C 的全序列如下1TGGCCGCGTGCTTTACACATGCGAGTCGGACGGTGAAGCAGAGCTTGCTCTGTGGATCAG61TGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAATCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAA 121 ACGGCGTCTAATACCGGATACGAGCTGCGAAGGCATCTTCAGCAGCTGGAAAGAATTTCG 181 GTCAGGGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGTC 241 GACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT 301 CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGC 361 CGCGTGAGGGACGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGT 421 GACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG 481 GGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCT 541 GCTGTGAAAACCCGAGGCTCAACCTCGGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCG 601 GTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACC 661 GATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCA 721 AACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGACC 781 ATTCCACGGTTTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCG 841 CAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTA 901 ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAAT 961 GGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG 1021 AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAAT 1081 GGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAA 1141 TCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTG 1201 CAATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCA 1261 ACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATA 1321 CGTTCCGGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGTAAGTCGGTAACACCCGAAGCC 1381 GGTGGCCCAACCCTTCTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTTGGA。
全文摘要
本發(fā)明屬于降解微生物技術(shù)領(lǐng)域。苯系化合物兼性厭氧降解菌，其特征是它為施氏微桿菌(Microbacterium schleiferi)HBSD-C CCTCC No.M209284，已于2009年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No.M209284。菌落形態(tài)淺黃色、圓形、半透明、邊緣整齊、凹陷、表面光滑；細(xì)胞為直桿狀，革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動；主要生化特征氧化酶陽性，接觸酶陽性，利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不利用麥芽糖，反硝化陽性，明膠水解陰性，兼性厭氧，在4℃～41℃生長。本發(fā)明能夠在厭氧條件下降解苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯，它對濃度約為175.8mg/L的苯系化合物3d的降解率在25.9％至41.2％之間。
文檔編號C02F103/06GK101892178SQ20101016030
公開日2010年11月24日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者余楚, 呂敦玉, 周建偉, 周愛國, 李萍, 童蕾, 蔡鶴生 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)