專利名稱：一種反硝化細(xì)菌及其用于水體植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境(水體)污染治理技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種反硝化細(xì)菌及其用于水體植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法，具體涉及ー種反硝化細(xì)菌及其用于水體氮素富營養(yǎng)化的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，河流污染是世界上各國都面臨的問題。對(duì)城市污染水體進(jìn)行治理是保護(hù)城市水資源、改善生態(tài)環(huán)境的基本措施。但常用的物理和化學(xué)修復(fù)方法一般投資昂貴、設(shè)備復(fù)雜且不適用于大面積水體污染的修復(fù)治理。而微生物(反硝化細(xì)菌)修復(fù)技術(shù)則因菌落生長受水體中含氧量、可利用碳源種類等限制不能得到廣泛應(yīng)用。截至目前，從自然環(huán)境中分離出的反硝化細(xì)菌大部分屬兼性厭氧菌，在無氧或低氧狀態(tài)下以硝酸根離子(NO3-)作為最終電子受體進(jìn)行反硝化作用；在氧氣濃度較高狀態(tài)下其反硝化作用受 到抑制甚至停止。植物根系的呼吸作用可以降低根系區(qū)域水體或土壌的含氧量，促進(jìn)反硝化細(xì)菌進(jìn)行反硝化作用。此外，環(huán)境中可利用的碳源種類是影響反硝化細(xì)菌存活的重要因素，植物根系能夠分泌多種碳源(糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸)，其中含有反硝化細(xì)菌生存所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。大量研究表明位于植物根際區(qū)的反硝化細(xì)菌種類和數(shù)量明顯高于其他區(qū)域。目前針對(duì)水體污染開展的植物或微生物修復(fù)工作已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但通過植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)對(duì)水體氮素富營養(yǎng)化的治理工作研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于水體氮素富營養(yǎng)化治理的反硝化細(xì)菌。本發(fā)明的另ー目的是提供該反硝化細(xì)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的是提供該反硝化細(xì)菌用于水體氮素富營養(yǎng)化的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一株反硝化細(xì)菌LR，分類命名為假單胞菌LR (Pseudomonas sp. LR)，于2011年5月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為CCTCC N0:M2011159。該假單胞菌LR從江蘇省南京市富營養(yǎng)化河水植物根際區(qū)土壤分離得到。主要生物學(xué)特性為G_，菌體桿狀。吲哚試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵和淀粉水解試驗(yàn)為陰性，V. P試驗(yàn)為陽性；抗生素抗性試驗(yàn)表明LR菌株對(duì)氨芐、紅霉素、氯霉素、鏈霉素有抗性；可利用碳源有檸檬酸鈉、醋酸鈉、麥芽糖、琥拍酸鈉和淀粉，不可利用碳源有乳糖和鹿糖。其16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為JQ652571。所述的保藏號(hào)為CCTCC N0:M2011159的反硝化細(xì)菌LR在氮素富營養(yǎng)化水體污染
治理中的應(yīng)用。所述的保藏號(hào)為CCTCC N0:M2011159的反硝化細(xì)菌LR聯(lián)合傘草(CyperusalternifoliusL.)在氮素富營養(yǎng)化水體污染治理中的應(yīng)用。
一種對(duì)氮素富營養(yǎng)化水體進(jìn)行植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的方法，在氮素富營養(yǎng)化的水體中種植傘草，接種所述的保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159的反硝化細(xì)菌LR ;其中每升水體種植傘草7 15株，每升水體接種濃度為106cFu/ml的保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159的反硝化細(xì)菌LR菌液10ml。一種治理氮素富營養(yǎng)化水體污染的方法，在氮素富營養(yǎng)化的水體中添加傘草根系分泌物，并接種保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159反硝化細(xì)菌LR，每升水體添加50ml傘草根系分泌物，每升水體接種濃度為106cFu/ml的保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159的反硝化細(xì)菌LR菌液10ml，接種后每兩天添加一次傘草根系分泌物，每次每升水體添加40 60ml，優(yōu)選每次每升水體添加50ml ；其中，傘草根系經(jīng)去離子水淋洗后，在相対濕度為75-80%，溫度為25°C，光照強(qiáng)度為3000Lx 5000Lx的氣候室內(nèi)使用去離子水浸泡植物根系4 7h，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/10/體積；所述的傘草根系與用于浸泡根系的去離子水的質(zhì)量體積比為Ig 10 30ml，優(yōu)選 Ig 20ml ο
本發(fā)明所述的N素富營養(yǎng)化液體的標(biāo)準(zhǔn)是由國際衛(wèi)生組織(WHO)于2004年公布的，其標(biāo)準(zhǔn)是 11. 3mg-N/1 (Horing, H. and Chapman, D. :Nitrates and nitritesin drinking water:World Health Organization Drinking Water Series. , IffAPublishing, London (2004).);即含氮量大于或等于11. 3mg-N/l的液體稱為N素富營養(yǎng)化液體，含氮量大于或等于11. 3mg-N/l的水體稱為N素富營養(yǎng)化水體。有益效果本發(fā)明從江蘇省南京市富營養(yǎng)化河水植物根際區(qū)土壤分離得到篩選出一株具有高效反硝化細(xì)菌——假單胞菌LR，該菌株對(duì)檸檬酸鹽為碳源的培養(yǎng)基中硝酸鹽的最終降解率達(dá)90%以上，而且在較高的氮素水平下也有一定的脫氮能力將該菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，用于處理高N02_或高N03_的廢水，將具有重要意義。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將假單胞菌LR與傘草或傘草根系分泌物聯(lián)合用于修復(fù)氮素富營養(yǎng)化水體，菌株LR對(duì)傘草修復(fù)氮素污染水體具有促進(jìn)作用。本發(fā)明提供的假單胞菌LR與傘草或傘草根系分泌物聯(lián)合用于修復(fù)氮素富營養(yǎng)化水體的方法特別適用于自然界的氮素富營養(yǎng)化水體治理。該方法使得污水中反硝化細(xì)菌存活率顯著提高，大幅度提高了修復(fù)系統(tǒng)的去氮率，節(jié)省了外源添加碳源的成本。


圖I菌株LR產(chǎn)氣測定照片。圖2菌株LR在BTB平板上的菌落照片。圖3菌株LR硝態(tài)氮的去除情況。圖4不同碳源對(duì)菌株反硝化脫氮的影響。圖5不同氮源對(duì)菌株LR生長的影響。圖6C/N對(duì)菌株LR的反硝化脫氮(A)及生長(B)的影響。圖7以Hoagland營養(yǎng)液為N素富營養(yǎng)化液體不同處理組的去氮率。圖8以外界污水為N素富營養(yǎng)化液體不同處理組的去氮率。圖9以外界污水為N素富營養(yǎng)化液體外源添加傘草根系分泌物去氮實(shí)驗(yàn)。
生物材料保藏信息反硝化細(xì)菌LR,分類命名為假單胞菌LR (Pseudomonas sp. LR)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏地址是中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2011年5月3日，保藏編號(hào)為 CCTCC N0:M2011159o
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I菌種篩選及鑒定I. I菌種分離及篩選試驗(yàn)所用土壤樣品采自南京市若干河道邊、湖泊邊的水生植 物根系、污水處理廠底泥、以及連云港水稻田土壌。選取生長旺盛的植株，抖落表層大塊土壌后，剰余部分作為植物根際土壌。稱取采集的植物根系土壤樣品10g，放入90mL含玻璃珠的無菌水中，振蕩20min，靜置20-30s，制成菌懸液。以10%的接種量將該菌懸液接到DM培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)。無菌條件下取ImL菌懸液放入盛9mL無菌水玻璃管中，混勻，再依次制成10_2、10' 10_4、10_5、10_6各種濃度稀釋液。取O. ImL上述不同濃度的稀釋液分別涂布于BTB鑒別培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度分別設(shè)置三個(gè)重復(fù)。28°C培養(yǎng)l-3d，挑取周圍有藍(lán)色暈圈的不同形態(tài)的單菌落，經(jīng)多次劃線進(jìn)行純化。挑取分離出來的菌株，在平板上多次劃線純化，直至顯微鏡下觀察顯示無雜菌為止，此時(shí)可認(rèn)為菌株已純化完畢。分離出的菌株在含有硝酸鹽的固體培養(yǎng)基上生長良好，具有潛在的反硝化特性，即為待篩菌株，均接種至斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?。將純化的菌株后分別接入Giltay培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，28°C培養(yǎng)2_14d。挑選產(chǎn)氣快、氣泡多的菌株，進(jìn)ー步檢測培養(yǎng)基中亞硝態(tài)氮和總氮的含量。將篩選出反硝化活性強(qiáng)的菌株斜面保存。上述分離、篩選過程中使用的培養(yǎng)及配方為反硝化基礎(chǔ)(DM)培養(yǎng)基(李妍等，2008)KN032. OgjK2HPO4L Og7MgSO4 ·7Η20 O. 2g，檸檬酸鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH值7. 2。溴百里酚蘭(BTB)鑒別培養(yǎng)基(TAKAYA等，2003) :L_天門冬酰胺酸I. Og,KNO3L 0g, KH2PO4L 0g, FeCl3 · 6H20 0. 05g, CaCl2 · 2H20 0. 2g, MgSO4 · 7H20 I. Og,瓊脂 20g，1%溴百里酚蘭ImL,蒸餾水IOOOmL, pH值7. 0-7. 3。Giltay培養(yǎng)基(土壤微生物研究會(huì)，1983)A溶液ΚΝ032· 0g, L-天門冬酰胺酸I. Og, 1%溴百里酹蘭5mL,蒸懼水500mL ；B 溶液檸檬酸鈉 8. 5g，KH2PO4L 0g, FeCl3 · 6H20 0. 05g, CaCl2 · 2H20 0. 2g,MgSO4 · 7H201. Og,蒸餾水 500mL ；混合A、B兩溶液，調(diào)pH值7· 0-7. 2。通過富集分離、BTB鑒別培養(yǎng)基初篩及Gailty培養(yǎng)基復(fù)篩，最終從從江蘇省南京市富營養(yǎng)化河水植物根際區(qū)土壤樣品中分離出ー株反硝化活性最強(qiáng)產(chǎn)氣反硝化細(xì)菌，菌株命名為LR，并將LR送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO: Μ2011159。產(chǎn)氣照片如圖I。
I. 2反硝化細(xì)菌生理生化指標(biāo)測定菌株的鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等，2001)和《Bergey’s Manualof Determinative Bacteriology〉〉(Buchanan 和 Gibbons, 1986)進(jìn)打。菌株LR為革蘭氏陰性桿菌，BTB固體培養(yǎng)基平板上形成白色圓形，扁平不透明，邊緣略顯突起，干燥無光澤的菌落。菌落照片如圖2。菌株LR屬于兼性厭氧菌，在無氧條件下，反硝化菌以硝態(tài)氮作為最終電子受體，完成硝酸鹽代謝，革蘭氏陰性菌，VP陽性，能使石蕊牛乳胨化。菌株LR能夠利用蔗糖發(fā)酵。具體結(jié)果見表I。
表I菌株LR的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株反硝化細(xì)菌LR，分類命名為假單胞菌LR(Pseudomonas sp. LR)，于2011年5月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011159。
2.權(quán)利要求I所述的保藏號(hào)為CCTCCNO M2011159的反硝化細(xì)菌LR在氮素富營養(yǎng)化水體污染治理中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的保藏號(hào)為CCTCCN0:M2011159的反硝化細(xì)菌LR聯(lián)合傘草(Cyperus alternifolius L.)在氮素富營養(yǎng)化水體污染治理中的應(yīng)用。
4.一種對(duì)氮素富營養(yǎng)化水體進(jìn)行植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的方法，其特征在于在氮素富營養(yǎng)化的水體中種植傘草，接種所述的保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159的反硝化細(xì)菌LR ；其中每升水體種植傘草7 15株，每升水體接種濃度為106cFu/ml的保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159的反硝化細(xì)菌LR菌液10ml。
5.一種治理氮素富營養(yǎng)化水體污染的方法，其特征在于在氮素富營養(yǎng)化的水體中添加傘草根系分泌物，并接種保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159反硝化細(xì)菌LR，每升水體添加50ml傘草根系分泌物，每升水體接種濃度為106cFu/ml的保藏號(hào)為CCTCC NO M2011159的反硝化細(xì)菌LR菌液10ml，接種后每兩天添加一次傘草根系分泌物，每次每升水體添加40 60ml ;其中，所述的傘草根系分泌物通過如下方法收集制備傘草根系經(jīng)去離子水淋洗后，在相対濕度為75%-80%，溫度為25V，光照強(qiáng)度為3000Lx 5000Lx的氣候室內(nèi)使用去離子水浸泡植物根系4 7h，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/10/體積；所述的傘草根系與用于浸泡根系的去離子水的質(zhì)量體積比為Ig 10 30ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的對(duì)氮素富營養(yǎng)化水體進(jìn)行植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的方法，其特征在于所述的傘草根系與用于浸泡根系的去離子水的質(zhì)量體積比為Ig :20ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種反硝化細(xì)菌及其用于水體植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法。反硝化細(xì)菌LR，于2011年5月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO:M2011159。一種對(duì)氮素富營養(yǎng)化水體進(jìn)行植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的方法，在氮素富營養(yǎng)化的水體中種植傘草，接種反硝化細(xì)菌LR。本發(fā)明將反硝化細(xì)菌LR與傘草或傘草根系分泌物聯(lián)合用于修復(fù)氮素富營養(yǎng)化水體，菌株LR對(duì)傘草修復(fù)氮素污染水體具有促進(jìn)作用。本發(fā)明提供的反硝化細(xì)菌LR與傘草或傘草根系分泌物聯(lián)合用于修復(fù)氮素富營養(yǎng)化水體的方法特別適用于自然界的氮素富營養(yǎng)化水體治理。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102676431SQ20121014816
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者馮志航, 夏妍, 李星惠, 毛穎, 沈振國, 王桂萍, 陸辰晨, 陳亞華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)