專利名稱：木霉菌厚垣孢子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于防治植物病害的生防真菌_木霉菌(Trichodermaharzianum)厚垣孢子的生產(chǎn)方法，確切的說是一種通過控制營養(yǎng)條件及發(fā)酵條件使木霉菌產(chǎn)生厚垣孢子的方法。
背景技術(shù)：
隨著越來越多的有毒化學(xué)農(nóng)藥逐漸被限制使用，世界各國都在加大生物農(nóng)藥的研究開發(fā)力度，大力提倡研制、開發(fā)對(duì)人、畜無毒、對(duì)環(huán)境無污染的微生物農(nóng)藥已成為熱點(diǎn)。木霉菌作為一類有重要生防價(jià)值的拮抗性真菌，早在三十年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)植物病原真菌有拮抗作用，其作用機(jī)制包括產(chǎn)生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競(jìng)爭(zhēng)作用等。木霉菌強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)及生存能力在抑制病原菌尤其是土傳病害的過程中起著重要作用，是一種很有開發(fā)利用價(jià)值的生防菌種。目前國際上已開發(fā)注冊(cè)的木霉菌產(chǎn)品已有10多個(gè)。但大多為分生孢子制劑，如我國山東省民豐實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的木霉菌(Trichoderma sp.)產(chǎn)品特立克，也是由其分生孢子制成的可濕性粉劑。由于各種技術(shù)原因，如產(chǎn)品性能不穩(wěn)定，有效含量低等原因影響了該類產(chǎn)品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)能力外，其主要原因還是目前現(xiàn)有產(chǎn)品大多為木霉菌的分生孢子制劑，在貯藏過程中易受環(huán)境因子的影響縮短孢子壽命，導(dǎo)致生物防治活性的下降，施入土壤后不能在作物根部定植形成有效群體，整體防病效果不佳。這在很大程度上制約了木霉菌生物農(nóng)藥的規(guī)?；a(chǎn)與推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于防治植物病害的木霉菌厚垣孢子的生產(chǎn)方法，以克服分生孢子制劑的孢子存活期短，商品貨價(jià)期短，以及由其所帶來的防治效果不穩(wěn)定等問題。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明采用的生防菌是取自于作物根際的木霉菌，將其純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌種，在三角瓶內(nèi)振蕩培養(yǎng)為二級(jí)液體菌種，再經(jīng)生產(chǎn)罐發(fā)酵制成厚垣孢子懸浮液。方法中采用控制營養(yǎng)條件、添加形成厚垣孢子促進(jìn)劑，調(diào)節(jié)溫度、pH值、接菌量、供氧量及攪拌速度等技術(shù)參數(shù)控制發(fā)酵條件使其產(chǎn)生厚垣孢子。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟1.斜面母菌種制備取作物根表土壤5-10克，加無菌水50-100毫升，經(jīng)振蕩后稀釋1000-10000倍成稀釋液。取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈霉素0.03-0.04克、瓊脂17-20克、水1000毫升，配制成母菌種培養(yǎng)液。將稀釋液與母菌種培養(yǎng)液按0.1-1∶10-15的比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，然后在25-28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種。
其中母菌種培養(yǎng)液的制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20-30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉紅并使之完全溶化后裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈霉素。
其中試管斜面采用常規(guī)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)。
2、二級(jí)菌種制備取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-25克、水1000毫升，調(diào)pH值為6-6.5，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液，然后分裝在250-1000毫升三角瓶中，裝液量為100-500毫升。在121℃下滅菌20-30分鐘，在無菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為150-170轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28-30℃，發(fā)酵時(shí)間為3-4天，得到二級(jí)菌種。
其中二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液的制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20-30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖或蔗糖并使之完全溶化后，調(diào)pH值為6-6.5，3、生產(chǎn)罐發(fā)酵所采用的厚垣孢子培養(yǎng)基配方為馬鈴薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1-2克，硫酸鎂0.5-1克，色氨酸2-4克，果糖2-4克，植物油2-4克，自來水1000毫升。將厚垣孢子培養(yǎng)基在121℃下滅菌30-40分鐘，二級(jí)菌種接菌量為1-5％，發(fā)酵溫度為25-28℃，調(diào)pH值為5-6.5，供氧量150-200kpa(千帕斯卡)，攪拌速度為120-150轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間5-7天，獲得木霉菌厚垣孢子懸浮液。
其中厚垣孢子培養(yǎng)基的制作方法是將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加2-4倍體積的水煮沸20-30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，倒入發(fā)酵灌中，裝液量根據(jù)發(fā)酵罐的大小確定，然后加入葡萄糖或蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、色氨酸、果糖等并使之完全溶化，加水補(bǔ)足至所需用量。
按照本發(fā)明所提供的厚垣孢子培養(yǎng)基配方，調(diào)節(jié)溫度、PH值、接菌量、供氧量等技術(shù)參數(shù)，通過液體發(fā)酵的方法可使95％以上的菌絲形成厚垣孢子。這種獲得的大量的木霉菌厚垣孢子是真菌菌絲細(xì)胞膨大，原生質(zhì)濃縮，細(xì)胞壁增厚而形成的圓形休眠孢子，內(nèi)部儲(chǔ)藏有較多的脂類物質(zhì)，用以抵抗不良環(huán)境，抗逆性、土壤中競(jìng)爭(zhēng)力和繁殖速度均很強(qiáng)，而且存活時(shí)間長，將其接種在滅菌的硅藻土中，在室溫下可保藏3年以上，孢子仍然能夠萌發(fā)。
將本發(fā)明所得的木霉菌厚垣孢子懸浮液以1∶4-5的比例與硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、草炭等載體充分吸附后制成生防制劑，比分生孢子制劑可提高商品貨價(jià)期一年以上，施入土壤后可存活數(shù)年。將此生防制劑拌土200倍用于防治植物土傳病害，相對(duì)防治效果達(dá)60-70％，與分生孢子制劑相比對(duì)植物土傳病害的防治效果可提高15％以上。
本發(fā)明適用于大多數(shù)木霉菌株的發(fā)酵，方法簡(jiǎn)單易行，適合于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，市場(chǎng)前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例11、斜面母菌種制備取作物根表土壤5克，加無菌水50毫升，經(jīng)振蕩后稀釋1000倍成稀釋液，取0.1毫升稀釋液與10毫升母菌種培養(yǎng)液一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，其中母菌種培養(yǎng)液取馬鈴薯150克、葡萄糖20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素0.03克、瓊脂17克、水1000毫升，制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉紅并使之完全溶化后裝入三角瓶滅菌，在121℃下滅菌30分鐘，倒平板前加入硫酸鏈霉素。在25℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至由PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)制成的試管斜面內(nèi)作母菌種。
2、二級(jí)菌種制備二級(jí)發(fā)酵所采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)液配方為馬鈴薯150克、蔗糖20克、水1000毫升，制作方法是將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補(bǔ)足1000毫升，調(diào)pH值為6.5，裝入500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121℃下滅菌30分鐘，在無菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速170轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26℃，發(fā)酵時(shí)間為4天，得到二級(jí)菌種。
3、生產(chǎn)罐發(fā)酵所采用的厚垣孢子培養(yǎng)基配方為馬鈴薯150克，葡萄糖15克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，色氨酸2克，果糖4克，植物油2克，自來水1000毫升。制作方法是根據(jù)發(fā)酵灌的大小確定裝液量，將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加3倍體積的水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，倒入發(fā)酵灌中，然后加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、色氨酸、果糖等并使之完全溶化，加水補(bǔ)足至所需用量，調(diào)pH值為6，在121℃下滅菌30分鐘，接菌量為3％，發(fā)酵溫度為25-26℃，供氧量150kpa，攪拌速度為120轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間6天?？墒?5％以上的菌絲形成厚垣孢子。
將所得木霉菌厚垣孢子懸浮液以1∶4的比例與硅藻土吸附后制成生防制劑，200倍拌土防治瓜類枯萎病，相對(duì)防治效果達(dá)70％以上。
實(shí)施例2
1、斜面母菌種制備取作物根表土壤10克，加無菌水100毫升，經(jīng)振蕩后稀釋10000倍成稀釋液，取1毫升稀釋液與15毫升母菌種培養(yǎng)液一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，其中母菌種培養(yǎng)液取馬鈴薯200克、葡萄糖20克、孟加拉紅0.06克、硫酸鏈霉素0.04克、瓊脂20克、水1000毫升，制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉紅并使之完全溶化后裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈霉素。在28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至由PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)制成的試管斜面內(nèi)作母菌種。
2、二級(jí)菌種制備二級(jí)發(fā)酵所采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克、葡萄糖15克、水1000毫升，制作方法同斜面母菌種制備。調(diào)pH值為6.5，裝入500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121℃下滅菌30分鐘，在無菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間為4天，得到二級(jí)菌種。
3、生產(chǎn)罐發(fā)酵所采用的厚垣孢子培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克，蔗糖20克，磷酸二氫鉀2克，硫酸鎂1克，色氨酸4克，果糖2克，植物油4克，自來水1000毫升。制作方法是根據(jù)發(fā)酵灌的大小確定裝液量，將馬鈴薯去皮后切成1厘米見方的小塊，加4倍體積的水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，倒入發(fā)酵灌中，然后加入蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、色氨酸、果糖等并使之完全溶化，加水補(bǔ)足至所需用量，調(diào)pH值為6.5，在121℃下滅菌40分鐘，接菌量為5％，發(fā)酵溫度為27-28℃，供氧量200kpa，攪拌速度為150轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間7天?？墒?5％以上的菌絲形成厚垣孢子。
將所得木霉菌厚垣孢子懸浮液以1∶5的比例與輕質(zhì)碳酸鈣充分吸附后制成生防制劑，200倍拌土防治茄子黃萎病等土傳病害，相對(duì)防治效果達(dá)65％以上。
權(quán)利要求
1.一種木霉菌厚垣孢子的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下具體步驟1)斜面母菌種制備取作物根表土壤5-10克，加無菌水50-100毫升，經(jīng)振蕩后稀釋1000-10000倍成稀釋液；取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈霉素0.03-0.04克、瓊脂17-20克、水1000毫升，配制成菌種培養(yǎng)液；將稀釋液與菌種培養(yǎng)液按0.1-1∶10-15的比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，然后在25-28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；2)二級(jí)菌種制備取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-25克、水1000毫升，調(diào)pH值為6-6.5，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液，分裝在250-1000毫升三角瓶中，裝液量為100-500毫升，在121℃下滅菌20-30分鐘，在無菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為150-170轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28-30℃，發(fā)酵時(shí)間為3-4天，得到二級(jí)菌種；3)生產(chǎn)罐發(fā)酵厚垣孢子培養(yǎng)基配方為馬鈴薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1-2克，硫酸鎂0.5-1克，色氨酸2-4克，果糖2-4克，植物油2-4克，自來水1000毫升；將厚垣孢子培養(yǎng)基在121℃下滅菌30-40分鐘，二級(jí)菌種接菌量為2-5％，發(fā)酵溫度為25-28℃，pH值為5-6.5，供氧量150-200kpa，攪拌速度為120-150轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間5-7天，獲得木霉菌厚垣孢子懸浮液。
2.按權(quán)利要求1方法得到的木霉菌厚垣孢子的應(yīng)用，其特征在于將木霉菌厚垣孢子懸浮液以1∶4-5的比例與載體硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、草炭充分吸附后制成生防制劑，再拌土200倍用于防治植物土傳病害。
全文摘要
一種木霉菌厚垣孢子的生產(chǎn)方法，利用從作物根表土壤分離獲得的木霉菌，采用控制營養(yǎng)條件、添加形成厚垣孢子促進(jìn)劑，調(diào)節(jié)溫度、pH值、接菌量、供氧量及攪拌速度等技術(shù)參數(shù)控制發(fā)酵條件使其產(chǎn)生厚垣孢子，首先將取自作物根際的木霉菌純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌種，然后在三角瓶內(nèi)振蕩培養(yǎng)為液體菌種，再經(jīng)生產(chǎn)罐發(fā)酵制成厚垣孢子懸浮液。本發(fā)明所得的厚垣孢子具有壽命長、防效高、耐儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，其制劑比分生孢子制劑可提高商品貨價(jià)期一年以上。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1594544SQ20041002568
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者陳捷, 莊敬華, 高增貴 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)