專利名稱：納米膠囊包封系統(tǒng)與方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請對Gretchen M.Unger于2000年2月28日申請的題目為“納米顆粒包封系統(tǒng)與方法”的申請系列號60/185,282要求優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明主要涉及大分子的控釋輸送系統(tǒng)領(lǐng)域，特別是用于核酸和基因治療。更具體而言，本發(fā)明涉及直徑小于約50納米的納米膠囊，其中生物活性成分位于納米膠囊的核心，并涉及形成這些納米膠囊的方法。
在過去幾十年里，對納米顆粒在生物活性劑輸送中的應(yīng)用的積極與大量的研究已經(jīng)形成了大量制備納米顆粒的方法。這些方法一般包括利用熱、高壓勻漿或高強(qiáng)度超聲處理制備直徑大于100納米的納米顆粒，或利用高含量的溶劑或油、細(xì)胞毒性化學(xué)試劑(如交聯(lián)劑)、佐劑、催化劑或其任何組合制備直徑小于100納米的納米顆粒。而且，由于許多變化因素，這些方法是有希望的。
例如，當(dāng)在納米顆粒的生產(chǎn)過程中使用有機(jī)溶劑時，有機(jī)溶劑可以變性生物活性劑，這可降低該生物活性劑的大部分(如果不是全部的話)效能。事實(shí)上，例如在對病人施用納米顆粒后，生物活性劑的變性可以加強(qiáng)毒性反應(yīng)。
另外，當(dāng)利用有機(jī)溶劑制備納米顆粒時，有機(jī)溶劑可以被降解，形成低pH環(huán)境，這可破壞生物活性劑的效能。因此，在制備納米顆粒期間或之后有機(jī)溶劑一般可以變性生物活性劑。
因此，在納米顆粒的生產(chǎn)過程中一般除去有機(jī)溶劑。然而，包括一種或多種有機(jī)溶劑去除技術(shù)通常增加形成納米顆粒的成本和復(fù)雜性。
利用高壓勻漿或高強(qiáng)度超聲處理制備納米顆粒一般導(dǎo)致生物活性劑混合(entangle)或包埋于納米顆粒的聚合基質(zhì)中。生物活性劑混合或包埋于聚合基質(zhì)中也可以變性生物活性劑，從而降低生物活性劑的效能。
生物活性劑混合或包埋于納米顆粒的聚合基質(zhì)中也可通過使生物活性劑在到達(dá)靶細(xì)胞之前未成熟釋放，降低生物活性劑的效能。在施用納米顆粒過程中，生物活性劑的未成熟釋放一般促進(jìn)細(xì)胞毒性或細(xì)胞死亡。
此外，到達(dá)靶細(xì)胞的納米顆粒一般經(jīng)過內(nèi)體調(diào)節(jié)途徑運(yùn)送到靶細(xì)胞中，導(dǎo)致生物活性劑和納米顆粒的溶酶體降解。因此，生物活性劑在靶細(xì)胞內(nèi)也許沒有功能活性，因?yàn)樯锘钚詣┖图{米顆粒被降解。在此使用時，術(shù)語“功能活性”是指為了提供對靶細(xì)胞的治療作用，生物活性劑在靶細(xì)胞內(nèi)起作用的能力。
另外，高壓勻漿或高強(qiáng)度超聲處理技術(shù)一般需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，這通常增加了制備納米顆粒的成本。因此，迫切需要不用細(xì)胞毒性化學(xué)試劑(如有機(jī)溶劑)或不用復(fù)雜和昂貴的設(shè)備制備納米顆粒。此外，也迫切需要制備生物活性劑未混合或包埋于納米顆粒中的納米顆粒，使細(xì)胞毒性反應(yīng)降至最低。另外，也迫切需要研制可以輸送到靶細(xì)胞內(nèi)的納米顆粒，在其中釋放生物活性劑，實(shí)現(xiàn)生物活性劑的治療輸送。
發(fā)明概述本發(fā)明主要涉及納米膠囊及制備這些納米膠囊的方法。本發(fā)明包括形成表面活性劑微團(tuán)和將表面活性劑微團(tuán)分散到含有親水性聚合物的水性組合物中使表面活性劑微團(tuán)穩(wěn)定分散的方法。該方法進(jìn)一步包括機(jī)械形成穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)分散體的小滴，沉淀親水性聚合物形成沉淀納米膠囊，溫育納米膠囊以縮小納米膠囊的直徑，過濾或離心該納米膠囊。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明制備納米膠囊的方法的圖示。
圖1A顯示對不同分散條件下制備的納米膠囊制劑的原子力顯微鏡檢查。
圖1B顯示證明從釋放溶液中定量回收小量DNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖1C顯示在不同分散條件下制備的納米膠囊在72小時內(nèi)的累積釋放。
圖2顯示用DNA復(fù)合物、含DNA納米膠囊處理或不處理的HacaT角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的相對胞飲活性。
圖3顯示來自大鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的總蛋白的Wstern blotting結(jié)果。
圖4A顯示圖4B顯示對來自圖4實(shí)驗(yàn)的豬皮膚組織切片的免疫熒光顯微鏡檢查。
圖5顯示納米膠囊向固體劑型中的摻入。
圖6A顯示聚乙烯吡咯烷酮納米膠囊攝取和綠色熒光蛋白(GFP)在35mm人皮膚成纖維細(xì)胞和無限增殖角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)。
圖6B顯示GFP質(zhì)粒DNA通過鍵生蛋白納米膠囊的腫瘤靶向。
圖6C顯示鍵生蛋白包被的納米膠囊和未用鍵生蛋白包被的納米膠囊對鱗狀細(xì)胞癌和人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)培養(yǎng)物的生長抑制作用。
圖7顯示用含有20mer Fitc-標(biāo)記O-甲基RNA寡核苷酸的納米膠囊處理的HDF培養(yǎng)物的攝取。
發(fā)明詳述本發(fā)明主要涉及直徑小于約50納米的納米膠囊。本發(fā)明也涉及制備這些納米膠囊的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過將生物活性成分分配到表面活性劑分子核心內(nèi)，并在表面活性劑分子周圍圍繞生物相容聚合物外殼，形成納米膠囊。
圖1的10中概述了一種生產(chǎn)納米膠囊的方法。在方法10中，生物活性成分12均勻分散到第一種水性組合物14中，形成親水性組合物(未顯示)。然后，表面活性劑組合物16，其包含一種含有大量表面活性劑分子的表面活性劑成分(未顯示)，和任選的生物相容油成分18，與親水性組合物一起加入第一種分散裝置20中。表面活性劑組合物16經(jīng)歷第一種分散裝置20中的條件，引發(fā)了表面活性劑分子向生物活性成分12表面上的至少部分吸附。
表面活性劑分子部分吸附于生物活性成分12的表面上起始了生物活性成分12向由第一種水性組合物14中的表面活性劑分子形成的外殼核心內(nèi)的分配。表面活性劑分子向生物活性成分12表面上的吸附可以繼續(xù)，直到生物活性成分12的全部表面都被表面活性劑分子覆蓋，完成生物活性成分12向表面活性劑分子核心內(nèi)的分配，形成表面活性劑微團(tuán)22。
然后，向表面活性劑微團(tuán)22中加入生物相容聚合物成分24，穩(wěn)定位于第一種水性組合物14中的表面活性劑微團(tuán)22。優(yōu)選地，在穩(wěn)定裝置26中，生物相容聚合物成分24圍繞著表面活性劑微團(tuán)22，形成穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28。
待穩(wěn)定后，將穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28從穩(wěn)定裝置26中轉(zhuǎn)移到位于第二種分散裝置32中的第二種水性組合物30中。優(yōu)選地，第二種水性組合物30包含一種溶質(zhì)(未顯示)，該溶劑能沉淀包被穩(wěn)定的生物活性劑微團(tuán)28的生物相容聚合物成分24。沉淀穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的生物相容聚合物成分24后，形成分散的、任選地粉化的沉淀納米膠囊36，下面稱為納米膠囊36。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將表面活性劑組合物(其含有一種表面活性劑成分，親水-親脂-平衡(HLB)值小于約6.0單位)分散于含有生物活性成分的水性組合物中，形成圍繞生物活性成分的表面活性劑微團(tuán)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過加入生物相容聚合物穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)包被表面活性劑微團(tuán)，形成直徑小于約50nm的納米膠囊。
在此使用時，術(shù)語“納米顆粒”是指一種具有矩陣型結(jié)構(gòu)，大小小于約1000納米的顆粒。當(dāng)納米顆粒包含生物活性成分時，該生物活性成分混合或包埋于納米顆粒的矩陣型結(jié)構(gòu)中。
術(shù)語“納米球體”在此使用時是指一種具有固體球形結(jié)構(gòu)，大小小于約1000納米的顆粒。當(dāng)納米球體含有生物活性成分時，該生物活性成分吸附于納米球體表面或包埋于納米球體中。
類似地，術(shù)語“納米核心”在此使用時是指一種含有小于1000納米的固體核心的顆粒。當(dāng)納米核心中含有生物活性成分時，該生物活性成分混合于納米核心中。
在此使用時，術(shù)語“納米膠囊”是指一種含有由外殼包圍的空心，顆粒大小小于約1000納米的顆粒。當(dāng)納米膠囊含有生物活性成分時，該生物活性成分位于由納米膠囊的外殼圍繞的核心中。術(shù)語“納米膠囊”不是包括，一般不包括大小小于約1000納米的顆粒，其中生物活性成分混合或包埋在納米膠囊的基質(zhì)中，或吸附于納米膠囊的環(huán)繞的外殼上。
生物活性成分12可以以液體、蒸汽或顆粒形式包含于第一種水性組合物14中。選擇的生物活性成分12的形式優(yōu)選地使生物活性成分12(1)在溶解或分散于第一種水性組合物14之前保持穩(wěn)定，(2)均勻分散到第一種水性組合物14中，(3)任選地濃縮，縮小生物活性成分12的大小，(4)分配到表面活性劑微團(tuán)22的核心中，(5)在納米膠囊36的生物相容聚合物外殼24降解后釋放，(6)在從納米膠囊36釋放后有功能活性。
生物活性成分12可以表征為“親水的”或“疏水的”。在此使用時，術(shù)語“親水的”或“親水性”是指一種分子吸收水或與水形成一個或多個氫鍵的能力。也認(rèn)為“親水的”包括該分子能吸收水或與水形成一個或多個氫鍵的任何部分。在此使用時，術(shù)語“疏水的”和“疏水性”是指一種分子不能吸收水或不能與水形成一個或多個氫鍵的能力。也認(rèn)為“疏水的”包括該分子不能吸收水或不能與水形成一個或多個氫鍵的任何部分。
當(dāng)生物活性成分12是一種親水性生物活性成分時，該親水性生物活性成分可以直接加到第一種水性組合物14中。備選地，親水性生物活性成分12也可以任選地溶解或分散于一種或多種溶劑(如水、非極性溶劑、極性溶劑或其任何組合)中。
在此使用時，術(shù)語“非極性溶劑”是指一種溶劑，它沒有永久電偶極矩，因此不能與極性溶劑在分子內(nèi)結(jié)合。另外，非極性溶劑可以表征為一種含有介電常數(shù)小于約20單位的分子的溶劑。類似地，術(shù)語“不混溶的”在此使用時是指兩種或多種物質(zhì)(如兩種或多種液體、固體、蒸汽或其任何組合)不能與另一種物質(zhì)形成分子內(nèi)結(jié)合。在《Perry化學(xué)工程師手冊》(第六版)中可以見到非極性溶劑的一些不完全的例子，在此引用作為參考。
在此使用時，術(shù)語“極性溶劑”是指一種溶劑，它具有永久電偶極矩，因此能與另一種極性物質(zhì)(如液體、固體、蒸汽或其任何組合)形成分子內(nèi)結(jié)合。另外，非極性溶劑可以表征為一種含有介電常數(shù)大于約20單位的分子的溶劑。類似地，術(shù)語“可混溶的”在此使用時是指兩種或多種物質(zhì)彼此形成分子內(nèi)結(jié)合的能力。在《Perry化學(xué)工程師手冊》(第六版)中可以見到極性溶劑的一些不完全的例子，在此引用作為參考。
當(dāng)生物活性成分12是一種疏水性生物活性成分時，該疏水性生物活性成分可以分散或溶解到一種能分散或溶解疏水分子的溶劑中，如上述水、非極性溶劑、極性溶劑或其任何組合。優(yōu)選地，當(dāng)生物活性成分12是一種疏水性生物活性成分12時，該疏水性生物活性成分12溶解或分散于水溶性溶劑中，如丙酮、乙腈、乙醇、二甲基乙酰胺(DMA)、四氫呋喃(THF)、二氧己環(huán)、二甲亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。在《Perry化學(xué)工程師手冊》(第六版)中可以見到水溶性溶劑的其它合適的不完全例子，在此引用作為參考。
如上所述，在形成表面活性劑微團(tuán)16之前生物活性成分12可任選地濃縮于第一種水性組合物14中。例如，當(dāng)生物活性成分是一種多核苷酸時，可以利用DNA縮合劑濃縮該多核苷酸。在此使用時，“DNA縮合劑”是利于DNA濃縮或縮小的分子。
生物活性成分12的濃縮對于本發(fā)明并不重要，可以進(jìn)行生物活性成分12的濃縮，以縮小生物活性成分12的大小。在分配到表面活性劑微團(tuán)16的核心中之前，生物活性成分12的濃縮一般縮小生物活性成分12的大小。縮小生物活性成分12的大小可以使表面活性劑微團(tuán)22中最大程度地?fù)饺肷锘钚猿煞?2，或者可以有助于納米膠囊36總大小的縮小。提高可作為納米膠囊36一部分的生物活性成分12的含量允許摻入含有大量單體(如大量堿基對或氨基酸)的大分子。Rolland，A.P.(1998)Crit.Rev.Therapeutic Drug.Carr.Syst.15143-198綜述了縮合劑的一些不完全實(shí)例，在此引用作為參考。
生物活性成分12可進(jìn)一步含有適合并且不干擾生物活性成分12的溶解或分散的其它成分?？梢约尤肷锘钚猿煞?2中的其它成分的不完全實(shí)例包括DNA結(jié)合部分，是指以非共價方式與核酸相互作用的分子或其部分。DNA結(jié)合部分可以包括但不限于大溝和小溝結(jié)合劑、DNA嵌入劑、聚陽離子、DNA遮蔽成分、膜通透成分、亞細(xì)胞定位成分等。大溝和小溝結(jié)合劑在此使用時是指通過與雙鏈DNA的大溝或小溝結(jié)合與DNA相互作用的分子。
類似地，術(shù)語“DNA嵌入劑”在此使用時是指一種平面分子或分子的平面部分，它們通過插入核苷酸堿基對之間并與之平行嵌入DNA中。在此使用時，“聚陽離子”與DNA主鏈上的負(fù)電荷結(jié)合。DNA結(jié)合部分可以通過“反應(yīng)基團(tuán)”與本發(fā)明的功能成分共價連接。該反應(yīng)基團(tuán)容易與功能成分上的親核物質(zhì)反應(yīng)。反應(yīng)基團(tuán)(與其相應(yīng)的反應(yīng)性親核物質(zhì))的不完全實(shí)例包括但不限于N-羥基琥珀酰亞胺(例如胺)、馬來酰亞胺和馬來酰亞胺苯(例如巰基)、二硫吡啶(例如巰基)、酰肼(例如碳水化合物)和苯甲酰甲醛(例如精氨酸)。
術(shù)語“DNA遮蔽成分”在此使用時是指一種分子，它在從納米膠囊釋放后能遮蔽全部或部分多核苷酸，通過抑制循環(huán)中存在的降解劑(如核酸酶)的攻擊和/或干擾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，提高其循環(huán)半衰期。類似地，術(shù)語“膜通透成分”在此使用時是指幫助多核苷酸或包封的多核苷酸穿過膜的任何成分。因此“膜通透成分”部分包括電荷中和成分，通常是一種聚陽離子，它能中和多核苷酸上的大的負(fù)電荷，使多核苷酸能橫穿過膜的疏水性內(nèi)部。
許多電荷中和成分能作為膜通透劑。膜通透也可由兩親性分子引起?！澳ねㄍ竸痹诖耸褂脮r是一種能幫助通常不通透的分子橫穿過細(xì)胞膜并且進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的分子。膜通透劑可以是肽、膽汁鹽、糖脂、磷脂或去污劑分子。膜滲透劑通常具有兩親性，使得一個部分是疏水性的，而另一部分是親水性的，使它們能與膜相互作用。
術(shù)語“亞細(xì)胞定位成分”在此使用時是指一種能識別靶細(xì)胞中亞細(xì)胞成分的分子。識別的亞細(xì)胞成分包括核、核糖體、線粒體和葉綠體。特別的亞細(xì)胞定位成分包括能幫助攜帶分子進(jìn)入核中的“核定位成分”，已知包括核定位肽和氨基酸序列。
可包含治療有效量的生物活性成分12，用于轉(zhuǎn)化多種細(xì)胞，如體外、體內(nèi)或離體的細(xì)胞。在此使用時，“轉(zhuǎn)化”是指在納米膠囊暴露于大量細(xì)胞后大量細(xì)胞中生物活性成分的存在和/或功能活性。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，生物活性成分12的含量可根據(jù)下列因素而不同生物活性成分12，溫度、pH、摩爾滲透壓濃度、任何溶質(zhì)，第二種水性成分30中存在的任何其它成分或任選的溶劑，表面活性劑組合物16，一種類型或一定含量的表面活性劑微團(tuán)22，生物相容性聚合物成分24，穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的任何希望的特性，納米膠囊36的任何希望的特性，或其任何組合。
納米膠囊36的生物活性成分12可以是單獨(dú)的大分子，或在制備的兩種或多種大分子的不同混合物中，隨后結(jié)合形成生物活性成分12。適于作為生物活性成分12一部分的親水性大分子的不完全實(shí)例包括但不限于多核苷酸、多肽、遺傳物質(zhì)、肽核酸、aptamer、碳水化合物、小染色體、分子聚合物、無機(jī)或有機(jī)性質(zhì)的聚集物或結(jié)合物、基因、其它任何親水性大分子或其組合。
可以作為生物活性成分12一部分的疏水性大分子的不完全實(shí)例包括但不限于腎上腺素能劑、腎上腺皮質(zhì)類固醇、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、醛甾酮拮抗劑和合成代謝劑；興奮劑、麻醉劑、減食欲劑和抗痤瘡劑；抗腎上腺素能劑、抗過敏劑、抗阿米巴劑、抗貧血劑和抗心絞痛劑；抗關(guān)節(jié)炎劑、抗哮喘劑、抗動脈粥樣硬化劑、抗菌劑和抗膽堿能劑；抗凝劑、抗驚闕劑、抗抑郁劑、抗糖尿病劑和抗腹瀉劑；抗利尿劑、抗嘔劑、抗癲癇劑、抗纖溶劑和抗真菌劑；抗出血劑、消炎劑、抗微生物劑、偏頭痛劑和抗縮瞳劑；抗霉菌劑、止惡心劑、抗腫瘤劑、antineutropenic和抗寄生蟲劑；抗增生劑、精神抑制劑、抗風(fēng)濕劑、抗皮脂溢藥和抗分泌劑；解痙劑、抗凝血劑、抗?jié)儎?、抗病毒劑和食欲抑制劑；血糖調(diào)節(jié)劑、骨吸收抑制劑、支氣管擴(kuò)張劑、心血管劑和膽堿能劑；熒光劑、氧自由基清除劑、胃腸動力作用劑、糖皮質(zhì)激素和毛發(fā)生長刺激劑；止血劑、組胺H2受體拮抗劑；激素；降膽固醇藥和降血糖藥；降脂藥、降血壓劑和顯像劑、免疫和激動劑；情緒調(diào)節(jié)劑、粘液溶解劑、散瞳劑或鼻減充血劑；神經(jīng)肌肉阻斷劑；神經(jīng)保護(hù)劑、NMDA拮抗劑、非激素固醇衍生物纖溶酶原激活物和血小板活化因子拮抗劑；血小板凝集抑制劑、psychotropic、放射活性劑、殺疥螨劑和致硬化劑；鎮(zhèn)靜劑、鎮(zhèn)靜-催眠劑、選擇性腺苷A1拮抗劑、血清素拮抗劑和血清素抑制劑；血清素受體拮抗劑、類固醇、甲狀腺激素和甲狀腺抑制劑；thyromimetic、安定劑、肌萎縮側(cè)索硬化、腦缺血、佩吉特病藥；不穩(wěn)定型心絞痛、血管收縮劑、血管擴(kuò)張劑、創(chuàng)傷愈合劑和黃嘌呤氧化酶抑制劑；免疫劑、來自病原體(如病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲)的抗原，任選地為滅活完整生物的形式，肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、碳水化合物或其組合，可在公開文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的、屬于上述種類并且批準(zhǔn)用于人體的藥理學(xué)或免疫學(xué)制劑的任何例子，其它任何疏水生物活性成分，或其任何組合。
在此使用時，術(shù)語“多肽”是指不受氨基酸數(shù)量限制的氨基酸的聚合物。也可以認(rèn)為，術(shù)語“多肽”包括例如寡肽、肽或蛋白質(zhì)。
在此使用時，術(shù)語“多核苷酸”是指多于1個核苷酸的單鏈、雙鏈或多鏈形式的RNA或DNA序列。術(shù)語“多核苷酸”也包括含有2’-脫氧D-核糖或其修飾形式的聚脫氧核糖核苷酸，RNA和其它任何類型的多核苷酸——是嘌呤或嘧啶堿的N-糖苷、C-糖苷，或修飾的嘌呤或嘧啶堿或堿性核苷酸。多核苷酸可以編碼啟動區(qū)、操作子區(qū)、結(jié)構(gòu)區(qū)、終止區(qū)、其組合或其它任何遺傳相關(guān)物質(zhì)。類似地，術(shù)語“遺傳的”在此使用時是指能改變基因表達(dá)的任何物質(zhì)。
本發(fā)明的方法中可以包括膠體、液體或蒸汽形式的第一種水性組合物14。選擇的第一種水性組合物14的形式優(yōu)選地使第一種水性組合物14(1)在溶解或分散生物活性成分、表面活性劑組合物16、表面活性劑微團(tuán)22或任選地穩(wěn)定劑表面活性劑微團(tuán)28之前保持穩(wěn)定，(2)均勻分散生物活性成分12、表面活性劑組合物16、表面活性劑微團(tuán)22或任選地穩(wěn)定劑表面活性劑28，(3)作為水包油乳劑中的連續(xù)相，(4)不干擾或隱蔽生物活性成分12的功能活性，(5)不修飾或降解生物活性成分12、表面活性劑組合物16、表面活性劑微團(tuán)22或任選地穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28。
第一種水性組合物14可以只含水，或者可以任選地含有既不干擾形成納米膠囊36的方法又不掩蓋生物活性成分12的功能活性的其它溶質(zhì)或溶劑。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，用于制備納米膠囊36的一定量的第一種水性組合物14可能根據(jù)下列因素而不同生物活性成分12、表面活性劑組合物16、溫度、pH、摩爾滲透壓濃度、任選的溶質(zhì)或任選的溶劑、表面活性劑微團(tuán)22、生物相容的聚合物成分24，和穩(wěn)定的表面活性劑28或納米膠囊36的希望的特性。
可以向第一種水性組合物14中加入生物活性成分12，或者可以向生物活性成分12中加入第一種水性組合物14。生物活性成分12和第一種水性組合物14的加入順序?qū)τ诒景l(fā)明并不重要，當(dāng)生物活性成分12溶解或分散于第一種水性組合物14中時形成的親水性組合物(未顯示)優(yōu)選地在親水性組合物中能保持均勻的溶液或分散體。
第一種水性組合物14可以是單獨(dú)的成分，或在制備的兩種或多種成分的不同混合物中，隨后結(jié)合形成第一種水性組合物14。第一種水性組合物14的不完全例子包括但不限于上述水、非極性溶劑、極性溶劑或其任何組合。優(yōu)選地，水是第一種水性組合物14。
可以向生物活性成分12、第一種水性組合物14、親水性組合物中加入液體、蒸汽或顆粒形式的表面活性劑組合物16。選擇的表面活性劑組合物16的形式優(yōu)選地使表面活性劑組合物16(1)在加入生物活性成分12、第一種水性組合物14或親水性組合物之前保持穩(wěn)定，(2)均勻分散于生物活性成分12、第一種水性組合物14或親水性組合物中，(3)形成微團(tuán)結(jié)構(gòu)，(4)吸附到生物活性成分12、第一種水性組合物14、親水性組合物表面，(5)替換位于生物活性成分12表面的第一種水性組合物，(6)將生物活性成分12或親水性組合物分配到微團(tuán)結(jié)構(gòu)核心中形成表面活性劑微團(tuán)22，(7)產(chǎn)生熱力學(xué)驅(qū)動力，可有效地縮小生物活性成分12、表面活性劑微團(tuán)22、穩(wěn)定的表面活性劑28或納米膠囊36的大小。
在此使用時，“表面活性劑”是指含有在熱力學(xué)上傾向于被極性溶劑溶解的極性部分，和在熱力學(xué)上傾向于被非極性溶劑溶解的烴部分的任何分子。術(shù)語“表面活性劑”也包括陰離子、陽離子或非離子型表面活性劑。在此使用時，術(shù)語“陰離子型表面活性劑”是指含有在水溶液中可電離形成陰離子的極性部分的表面活性劑。類似地，術(shù)語“陽離子型表面活性劑”是指含有在水溶液中可電離形成陽離子的陽離子極性部分的表面活性劑。同樣，“非離子”表面活性劑是指含有在水溶液中不電離的極性部分的表面活性劑。
不希望被理論所束縛，通常認(rèn)為表面活性劑是指一種分子，它能有效地縮小分散于第二種物質(zhì)中的第一種物質(zhì)之間的表面或界面張力，使得第一種物質(zhì)溶解，第一種物質(zhì)的任何分子基團(tuán)分散。一般而言，在加入表面活性劑后第一種物質(zhì)的流變動力學(xué)直徑增加。但是，據(jù)認(rèn)為表面活性劑組合物16能有效地縮小第一種水性組合物14中表面活性劑微團(tuán)22的大小或直徑，從而在實(shí)施本發(fā)明時縮小納米膠囊36的大小。
表面活性劑組合物16可以只含有表面活性劑成分(未顯示)，或者可以任選地含有生物相容性油成分18。表面活性劑成分可以用從小于約1單位到大于約13單位的HLB等級表征。
HLB值小于約6.0單位的表面活性劑成分可能被描述為在水性組合物或基于水的組合物中分散較差或不分散。另外，HLB值低于約6.0單位的表面活性劑成分可以表征為疏水或非離子型表面活性劑。HLB值大于約7.0單位的表面活性劑成分可描述為，當(dāng)分散于水性或基于水的組合物中時，該表面活性劑成分能形成乳狀到半透明到澄清的分散體。
優(yōu)選地，在實(shí)施本發(fā)明的方法時，表面活性劑組合物16的表面活性劑成分的HLB值小于約6.0單位。更加優(yōu)選地，表面活性劑組合物16的表面活性劑成分的HLB值小于約5.0單位，以利于制備直徑小于約50mm的納米膠囊。
也可以按照臨界微團(tuán)濃度(CMC)值表征表面活性劑成分。優(yōu)選地，表面活性劑組合物16的表面活性劑成分的CMC值小于約300微摩爾(μm)。更加優(yōu)選地，表面活性劑成分的CMC值小于約200μm。
不希望被理論所束縛，可以認(rèn)為，在加入第一種水性組合物14中時，表面活性劑組合物16的表面活性劑成分吸附于生物活性成分12的表面，以將疏水表面活性劑成分表面與第一種水性組合物14產(chǎn)生的熱力學(xué)不宜環(huán)境的暴露減到最小。因此，表面活性劑成分吸附于生物活性成分表面，縮小表面活性劑成分可暴露于第一種水性組合物14的表面積。表面活性劑成分向生物活性成分12上的吸附被認(rèn)為有利于生物活性成分12和/或表面活性劑微團(tuán)22的縮小。
表面活性劑組合物16的表面活性劑成分可以是單獨(dú)的表面活性劑，或者在制備的兩種或多種表面活性劑的不同混合物中，隨后結(jié)合形成表面活性劑組合物16。HLB值小于約6.0單位或者CMC值小于約200μm的合適的表面活性劑的不完全例子可見《皮膚學(xué)制劑》(Barry，B.MarcelDekker(1983))或《經(jīng)皮吸收藥物、化妝品、機(jī)制、方法》第三版，Bronough，R.編寫，1999或《工業(yè)表面活性劑手冊》(Ash，M.編寫，GowerPub.(1993))，在此引用作為參考。一個例子是，表面活性劑成分可以是2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TM-二醇)，2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TM-二醇)的混合物，含有一個或多個炔二醇基的分子，鯨蠟醇或其任何組合。
表面活性劑組合物16的任選的生物相容性油成分18可以以液體、蒸汽或顆粒的形式與表面活性劑成分結(jié)合。任選的生物相容性油成分18的形式優(yōu)選地使任選的生物相容性油成分18(1)在加入表面活性劑組合物16中之前保持穩(wěn)定，(2)均勻混合于表面活性劑組合物16中，(3)溶解或分散表面活性劑成分，(4)提高表面活性劑組合物16的疏水性，因此，在實(shí)施本發(fā)明時可以縮小生物活性成分12、表面活性劑微團(tuán)22、穩(wěn)定劑表面活性劑微團(tuán)28或納米膠囊36的大小。
優(yōu)選地，表面活性劑組合物16中任選的生物相容性油成分18的濃度為約10-7％(重量)-約10％(重量)，這根據(jù)第一種水性組合物14中穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的總體積。根據(jù)表面活性劑組合物18的總體積，任選的生物相容性油成分18的濃度高于約10個％(重量)可能是不希望的，因?yàn)檫@種較高的濃度提高了生物相容性油的相體積，因此可能在制備、分散和/或處理表面活性劑微團(tuán)22、穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28或納米膠囊36時造成困難。表面活性劑組合物16中任選的生物相容性油成分的濃度低于約10-7％(重量)可能不是優(yōu)選的，因?yàn)檫@樣低的濃度不能有效地溶解表面活性劑成分，或者提高表面活性劑組合物16的疏水性，并且最終可能增加納米膠囊36的直徑。
表面活性劑組合物16的任選的生物相容性油成分18可以為單獨(dú)的生物相容性油，或者可在制備的兩種或多種生物相容性油的不同混合物中，然后結(jié)合形成任選的生物相容性油成分18?？梢宰鳛樯锵嗳菪杂统煞?8一部分的合適的生物相容性油的不完全例子可見《皮膚學(xué)制劑》(Barry，B.Marcel Dekker(1983))或《經(jīng)皮吸收藥物、化妝品、機(jī)制、方法》第三版，Bronough，R.編寫，1999或《工業(yè)表面活性劑手冊》(Ash，M.編寫，Gower Pub.(1993))，在此引用作為參考。優(yōu)選地，食用或USP級油，如DMSO、DMF、蓖麻油或其任意組合，用來實(shí)施本方法。
可含有一定量的表面活性劑組合物16，使得在形成表面活性劑微團(tuán)22時，能有效地形成微團(tuán)結(jié)構(gòu)，將生物活性成分12、第一種水性組合物14或親水性組合物分配到微團(tuán)結(jié)構(gòu)的核心中。更加優(yōu)選地，可含有一定量的表面活性劑組合物16，使得在實(shí)施本發(fā)明時，能有效地提供最大熱力學(xué)驅(qū)動力，使生物活性成分12、表面活性劑微團(tuán)22的大小并最終使納米膠囊36的大小降到最小。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，表面活性劑組合物16的量可根據(jù)下列因素而不同生物活性成分12、第一種水性組合物14、表面活性劑成分與任選的生物相容性油18之比、表面活性劑微團(tuán)22、穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28或納米膠囊36的希望的特性。例如，一種表面活性劑組合物，其含有與非極性生物相容性油(如蓖麻油)混合的HLB值約為6.0單位的表面活性劑成分，可以提供與含有與DMSO混合的約4.0單位表面活性劑成分的第二種表面活性劑組合物程度相同的熱力學(xué)驅(qū)動力。
根據(jù)分散于第一種水性組合物14中的穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)的總體積，表面活性劑組合物16的量可以高達(dá)約0.5％(重量)。更加優(yōu)選地，根據(jù)分散于第一種水性組合物14中的穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的總體積，表面活性劑組合物16的量低于約0.25％(重量)。最優(yōu)選地，根據(jù)分散于第一種水性組合物14中的穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的總體積，表面活性劑組合物16的含量低于約0.05％(重量)。一個不完全實(shí)例是，根據(jù)分散于第一種水性組合物14中的穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)的總體積，可以向親水性組合物總體積中加入濃度約為500ppm的表面活性劑組合物16。
第一個分散裝置20啟動并促進(jìn)形成基于生物活性成分12、第一種水性組合物14和表面活性劑組合物16的微團(tuán)結(jié)構(gòu)。表面活性劑成分不斷吸附于生物活性成分12或親水性組合物表面上，直到所有表面活性劑分子覆蓋、因而包圍了微團(tuán)結(jié)構(gòu)核心中的生物活性成分12或親水性組合物，形成表面活性劑微團(tuán)22。第一種水性組合物14中大量表面活性劑微團(tuán)22的形成產(chǎn)生了表面活性劑微團(tuán)22的分散體。
能夠均勻混合或分散的任何常規(guī)分散裝置20通常適用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑微團(tuán)的分散體。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，第一個分散裝置20可根據(jù)納米膠囊36的希望的特性而不同。例如，第一個分散裝置20可包括任何裝置，如超聲或振蕩裝置(未顯示)等，用于在親水性組合物中分散生物活性成分12，并且在加入表面活性劑組合物16后形成表面活性劑微團(tuán)22。但是，盡管第一個分散裝置20可包括超聲或振蕩裝置，但在實(shí)施本發(fā)明的方法時超聲或振蕩裝置不是必需的。
在此使用時，“表面活性劑微團(tuán)”可以表述為在生物活性成分12與表面活性劑組合物16間的界面處密集的表面活性劑分子的單分子屏障，使該屏障包封生物活性成分12、第一種水性組合物14或親水性組合物。也可以認(rèn)為，術(shù)語“表面活性劑微團(tuán)”包括部分或半表面活性劑微團(tuán)，它們部分包封生物活性成分12、第一種水性組合物14或親水性組合物。
當(dāng)生物活性成分12是一種親水性生物活性成分時，表面活性劑分子的極性部分與親水性生物活性成分的表面結(jié)合。當(dāng)生物活性成分12是一種疏水性生物活性成分時，表面活性劑微團(tuán)的烴部分與疏水性生物活性成分的表面結(jié)合。
表面活性劑微團(tuán)的形成一般在確定的濃度(稱為臨界微團(tuán)濃度)時發(fā)生。如上所述，在實(shí)施本發(fā)明時，CMC值小于約200微摩爾的表面活性劑成分是優(yōu)選的。
在形成表面活性劑微團(tuán)22的分散體后，將表面活性劑微團(tuán)22的分散體轉(zhuǎn)移到穩(wěn)定裝置26中，在其中加入生物相容性聚合物成分24，來穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)22的分散體。此外，在不需要穩(wěn)定裝置26的第一個分散裝置20中，也可以向表面活性劑微團(tuán)22的分散體中加入生物相容性聚合物成分24。
生物相容性聚合物成分24穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)22的分散體，在第一種水性組合物14中形成穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28。因此，在加入生物相容性聚合物成分24后，在第一種水性組合物14中存在穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的分散體。
在此使用時，術(shù)語“生物相容性的”是指一種物質(zhì)，它能與生物系統(tǒng)相互作用，而不引起細(xì)胞毒性、不希望的蛋白質(zhì)或核酸修飾或免疫應(yīng)答的激活。
生物相容性聚合物成分24可以以液體、蒸汽或顆粒的形式加入表面活性劑微團(tuán)22的分散體中。優(yōu)選的生物相容性聚合物成分24的形成使生物相容性聚合物成分24(1)在加入表面活性劑微團(tuán)22分散體前保持穩(wěn)定，(2)均勻分散于表面活性劑微團(tuán)22分散體中，(3)提高第一種水性組合物14的粘度，(4)在表面活性劑微團(tuán)22與第一種水性組合物14的界面處形成界面層，(5)吸附于表面活性劑微團(tuán)22的表面，(6)能夠離子滲透交換，(7)在加入溶質(zhì)后能夠沉淀，(8)能夠酶降解、表面和/或大量侵蝕，(9)不干擾或掩蓋生物活性成分12的功能活性，(10)防止表面活性劑微團(tuán)22分散體聚集和/或凝聚，(11)能夠獲得特殊的溶解型。
可含有一定量的生物相容性聚合物成分24，以有效包被、因而穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)22。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，根據(jù)生物活性成分12、第一種水性組合物14、表面活性劑組合物16、溫度、pH、摩爾滲透壓濃度、存在任選的溶質(zhì)或溶劑、表面活性劑微團(tuán)22、穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28任何希望的特性、納米膠囊36或希望的溶解型，用來穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)22的生物相容性聚合物成分24的含量可能不同。
盡管生物相容性聚合物成分24的濃度對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，但生物相容性聚合物成分24的濃度優(yōu)選地基于生物活性成分和希望的溶解型。當(dāng)生物相容性聚合物成分24的濃度太高時，納米膠囊36的外殼可能不溶解。如果生物相容性聚合物成分24的濃度太低，納米膠囊36的外殼可能快速溶解，從而提高細(xì)胞毒性。另外，生物相容性聚合物成分24的濃度太低也許不能產(chǎn)生有效的機(jī)械力來穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)28。
生物相容性聚合物成分24濃度太高也是不希望的，因?yàn)樘叩臐舛瓤商岣叩谝环N水性組合物14的粘度，因而在制備、混合和/或轉(zhuǎn)移穩(wěn)定劑表面活性劑微團(tuán)28時可造成困難。生物相容性聚合物成分24濃度太低不是優(yōu)選的，因?yàn)檩^低的濃度可能無法提供需要的粘度來穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)，也不能有效地包被表面活性劑微團(tuán)22，來防止第一種水性組合物14中表面活性劑微團(tuán)22的凝集。
生物相容性聚合物成分24可以作為單獨(dú)的生物相容性聚合物，或者在制備的兩種或多種生物相容性聚合物的不同混合物中，隨后結(jié)合形成生物相容性聚合物成分18。生物相容性聚合物的不完全例子包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷、聚亞烷基二醇、聚環(huán)氧烷、聚亞烷基對苯二酸、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物、烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、三乙酸纖維素、硫酸纖維素鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚透明質(zhì)酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸鹽、殼聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸酸異丙酯)、聚(丙烯酸酸異丁酯)、聚(丙烯酸酸異十八酯)及其組合。
另外，對于酶降解修飾，或適應(yīng)于在應(yīng)用光、超聲能、輻射后改變，溫度、pH、摩爾滲透壓濃度、溶質(zhì)或溶液濃度改變的生物相容性聚合物，也可以作為生物相容性聚合物成分24的一部分。優(yōu)選地，生物相容性聚合物成分24是一種親水性聚合物，它能基本上包被、優(yōu)選地連續(xù)包被表面活性劑微團(tuán)22。更加優(yōu)選地，親水性生物相容性聚合物成分24能夠離子滲透交換。
盡管本發(fā)明主要就親水性生物相容性聚合物成分24進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明，可以用其它任何生物相容性聚合物(如疏水性生物相容性聚合物)代替親水性生物相容性聚合物，而仍具有本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。同樣應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明可包含任何生物相容性聚合物的任意組合，而仍具有本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
適用于以生物相容性聚合物成分24穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)22的任何常規(guī)裝置和技術(shù)通?？梢杂米鞲鶕?jù)本發(fā)明的穩(wěn)定穩(wěn)定裝置26。而且，在穩(wěn)定過程中優(yōu)選地不包括其它任何裝置，如高壓勻漿或強(qiáng)超聲裝置。
在穩(wěn)定表面活性劑微團(tuán)22后，可以將穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28轉(zhuǎn)移到位于第二個分散裝置32的第二種水性組合物30中?？赏ㄟ^機(jī)械形成穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的小滴，轉(zhuǎn)移穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28，隨后加入第二種水性組合物30中。
第二種水性組合物30可能只含有水，或者任選地可含有一種溶質(zhì)，用于沉淀在穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28周圍的生物相容性聚合物成分24。可用來沉淀生物相容性聚合物24的溶質(zhì)的不完全例子包括元素周期表中所列元素的離子。
優(yōu)選地，第二種水性組合物30含有一種溶質(zhì)，其含量可有效沉淀生物相容性聚合物成分24，并形成分散的、任選地粉化的本發(fā)明的納米膠囊36。在此使用時，術(shù)語“沉淀”是指圍繞穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的生物相容性聚合物成分24的凝固或硬化。也應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“沉淀”也包括當(dāng)生物相容性聚合物成分24暴露于溶質(zhì)時可能發(fā)生的生物相容性聚合物24的任何結(jié)晶。
另外，能夠調(diào)節(jié)納米膠囊36效能的其它任何成分也可以作為第二種水性組合物的一部分，由此調(diào)節(jié)納米膠囊36的功能活性。例如，第二種水性組合物可含有其它包被賦形劑，如細(xì)胞識別成分或不同的離子，如Mn2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Be2+、Li+、Ba2+、Gd3+，或能夠與生物相容性聚合物成分24相互作用的其它任何離子。
術(shù)語“細(xì)胞識別成分”在此使用時是指一種能識別靶細(xì)胞表面上的成分的分子。細(xì)胞識別成分可包括細(xì)胞表面抗原的抗體、細(xì)胞表面受體(如參與受體介導(dǎo)的胞吞的細(xì)胞表面受體)的配體、肽激素等。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28在含有用于沉淀生物相容性聚合物成分24的溶質(zhì)的第二種水性組合物30中溫育時，納米膠囊36大小縮小。而且，在第二種水性組合物中溫育穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28后，也觀察到納米膠囊36絮凝懸液的形成。
在此使用時，“絮凝的懸液”是指在網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)中結(jié)合的離散顆粒形成松散的凝聚，這通過生物活性成分的物理吸附，在化學(xué)作用過程中橋接(沉淀)，或在較長距離的范德華引力強(qiáng)于較短距離的排斥力時發(fā)生。納米膠囊36的絮凝懸液可能在網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)中包含不同含量的第一種水性組合物14或第二種水性組合物30。另外，也可以輕輕拍打納米膠囊的絮凝懸液分散納米膠囊36。
可通過特定孔口大小的噴嘴(未顯示)或通過霧化裝置(未顯示)粉化，將穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28轉(zhuǎn)移到第二種水性組合物30中。粉化或霧化穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28一般包括施加剪切力，這能夠進(jìn)一步分散穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28。此外，在轉(zhuǎn)移過程中施加剪切力也能有效地(1)降低納米膠囊36的大小，或(2)破碎在穩(wěn)定裝置26中形成的穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28之間的聚集或結(jié)合。例如，可以利用低于約100psi的噴嘴壓力粉化穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28。
根據(jù)可用來向第二種水性組合物中轉(zhuǎn)移穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28的噴嘴孔口大小，納米膠囊36的直徑也可能不同。此外，也可以向含有沉淀生物相容性聚合物24的溶質(zhì)的第二種水性組合物30中加入穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)28，形成納米膠囊36的分散體，提供例如用于皮下施用納米膠囊的分散體。
在沉淀和/或任選地溫育第二種水性組合物30中的納米膠囊36后，可以過濾、離心或干燥納米膠囊36，獲得離散的納米膠囊36?？梢岳鋬龌蛑亟{米膠囊36以備以后使用，或者可以通過如下的施用途徑向靶細(xì)胞或組織輸送經(jīng)口、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鞘膜內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、局部、經(jīng)皮、栓劑(直腸)、陰道栓(陰道)、尿道內(nèi)、門脈內(nèi)、肝內(nèi)、動脈內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)鼓膜、intraumoral、鞘內(nèi)或其任一組合。
直徑小于約50nm的納米膠囊36在向靶細(xì)胞輸送生物活性成分中是有利的，這是由于以下幾個原因第一，直徑小于約50nm的納米膠囊36通過保護(hù)生物活性成分在向靶細(xì)胞運(yùn)送過程中不降解提高了生物活性成分的輸送。
第二，直徑小于約50nm的納米膠囊36促進(jìn)有效的細(xì)胞攝取。靶細(xì)胞的有效細(xì)胞攝取一般在顆粒直徑小于約50nm時發(fā)生，而在顆粒直徑大于約50nm時不發(fā)生。
第三，認(rèn)為靶細(xì)胞攝取納米膠囊36是通過運(yùn)輸系統(tǒng)，如非內(nèi)體途徑，這防止納米膠囊36的溶酶體降解。實(shí)際上可以認(rèn)為，本發(fā)明的納米膠囊36通過小窩蛋白(caveolin)調(diào)節(jié)途徑有效地輸出到細(xì)胞內(nèi)，這避免了大多數(shù)(如果不是全部的話)一般可降解納米膠囊36的內(nèi)體調(diào)節(jié)途徑。
第四，納米膠囊36具有與生物活性成分分離的生物相容性聚合物外殼。實(shí)際上，生物活性成分不是混合于、包埋于或吸附于納米膠囊36的生物相容性聚合物外殼上。當(dāng)生物活性成分不是混合于、包埋于或吸附于生物相容性聚合物外殼上時，含有納米膠囊36的細(xì)胞避免了凋亡或細(xì)胞死亡。
第五，在制備根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊36時，用生物相容性聚合物外殼包圍核心內(nèi)的生物活性成分，可有利地避免納米膠囊36的成熟前降解，或納米膠囊體內(nèi)運(yùn)輸過程中的細(xì)胞毒性反應(yīng)。包圍核心內(nèi)的生物活性成分導(dǎo)致生物活性成分的線性釋放速率，而在從納米膠囊36釋放過程中沒有任何零裂解(zero burst)現(xiàn)象。
在沒有任何零裂解現(xiàn)象的情況下，生物活性成分從納米膠囊的線性釋放率也是一個有利的特征，因?yàn)榫€性釋放率允許合理地設(shè)計包被溶解型，以將細(xì)胞毒性減到最小。在此使用時，術(shù)語“溶解型”是指生物相容性聚合物外殼溶解或降解，從納米膠囊核心釋放生物活性成分的速率。
利用本發(fā)明的方法制備的納米膠囊36的另一個優(yōu)點(diǎn)是，即使需要也只需要加入少量有機(jī)溶劑形成納米膠囊36。在本發(fā)明的方法中不使用大多數(shù)(如果不是全部的話)有機(jī)溶劑是有利的，因?yàn)樵谥苽浼{米膠囊36過程中有機(jī)溶劑可損傷生物活性成分12，破壞靶細(xì)胞，或者具有毒性。不使用大多數(shù)(如果不是全部的話)有機(jī)溶劑則不需要復(fù)雜的溶劑去除技術(shù)，如溶劑稀釋、真空蒸發(fā)等，并且避免了制備納米膠囊36過程中的任何相關(guān)成本或復(fù)雜方法策略。
本發(fā)明的納米膠囊36還允許穩(wěn)定地包封生物活性成分，特別是親水性生物活性成分，如多核苷酸和多肽。“穩(wěn)定包封”在此使用時是指保持包封的生物活性成分的結(jié)構(gòu)。對于核酸，低分子量核酸裂解產(chǎn)物的產(chǎn)生基本上可以避免，這可通過電泳測定。納米膠囊36也可用來包封任何生物活性成分，無論水溶性或電荷密度如何。
用途納米膠囊36可以與其它聚合結(jié)合劑、表面活性劑、填充劑和其它賦形劑結(jié)合，而使納米膠囊36加入固體劑型中，如顆粒、片劑、丸劑、薄膜或包衣，用于提高生物活性成分12的輸送。這樣，設(shè)計溶解型、控制顆粒大小和細(xì)胞攝取保持于納米膠囊水平上。這些用途包括但不限于產(chǎn)生用于肺部輸送的快速溶解的納米膠囊丸，或用于裝置介導(dǎo)的輸送的納米膠囊薄膜。
另一種用途是，通過聚合物選擇和/或在納米膠囊生物相容性聚合物外殼或包被內(nèi)含有細(xì)胞識別成分，可以為特殊細(xì)胞或組織攝取設(shè)計納米膠囊36。這些包被可用于向靶細(xì)胞特異地或增強(qiáng)地輸送生物活性劑。這些用途包括但不限于化療劑或反義DNA的腫瘤靶向，向抗原遞呈細(xì)胞輸送抗原，向視網(wǎng)膜細(xì)胞經(jīng)眼部施用核酶，經(jīng)皮輸送蛋白質(zhì)抗體或經(jīng)鼓膜施用肽核酸。
特性的確定和表征技術(shù)在此使用多種分析技術(shù)。這些技術(shù)的解釋如下圖1A在新切開的云母上制備樣品，分散、風(fēng)干，利用配有J型掃描儀和環(huán)境開放(tapping)模式固定器的Nanoscope II多模式AFM(數(shù)字儀器)成像。125μm長的IBMSC型硅懸臂來自IBM，共振頻率為250-450kHz。所有成像均為開放模式，圖像為512X512像素，掃描頻率為1kHz。采集高度、振幅和相位圖像。圖像用DI軟件處理，用NIH ImageSXM分析。A來自兩相系統(tǒng)的制劑Q，低HLB表面活性劑；B來自兩相系統(tǒng)的制劑S，高HLB表面活性劑；C來自一相系統(tǒng)的制劑T，高HLB表面活性劑；D來自兩相系統(tǒng)的制劑V，低CMC表面活性劑。
圖1B納米膠囊釋放到異丁醇在磷酸緩沖液(PBS)，pH7.2中的10％溶液中。樣品一式兩份。
圖1C從含有表面活性劑的母樣(Master batch)中等份采集標(biāo)稱300ng的DNA樣品，過商品miniprep柱處理。洗脫液循環(huán)通過Qiaquik柱，收集3次(4，5)或2次(6，7)，或者循環(huán)通過Zymoclean柱，收集兩次(8，9)。利用商品共沉淀劑乙醇沉淀樣品，在Synergel修飾的1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，用SybrGold染料染色，用Storm 860數(shù)字化處理，與未修飾的但從相同母樣中再沉淀的樣品(10，11)比較。道1-3100、50和5ng？_DNA。
圖2根據(jù)網(wǎng)格蛋白(clathrin)(Chemicon)的免疫信號水平估計內(nèi)吞活性。如文獻(xiàn)所述(Transduction Laboratories)，根據(jù)小窩蛋白-1的免疫信號估計胞飲活性。利用抗Lamp-1的單克隆抗體(TransductionLaboratories)檢測溶酶體活性。利用針對綿羊IgG的鏈霉親和素-生物素免疫復(fù)合物(Jackson Laboratories)檢測納米膠囊的定位。用綿羊IgG刺穿納米膠囊的包被，以便能實(shí)施該檢測策略。
圖370％鋪滿的無限增殖化Rt-1成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物用含量逐漸提高的納米膠囊制劑K處理4天，并用優(yōu)化的脂質(zhì)體制劑(劑量50ng)短時處理(3小時)。結(jié)果表示為細(xì)胞肌動蛋白綜合強(qiáng)度的百分比，并與脂質(zhì)體制劑比較。表達(dá)載體編號為448pEF/myc-his/GFP(Invitrogen)。
圖4A在用鹽水或6μg控釋納米膠囊處理7天后，驟凍照射的豬活檢標(biāo)本，然后在RIPA中勻漿。100μg裂解樣品在SDS-PAGE梯度凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，利用化學(xué)熒光檢測β-半乳糖苷酶(121kD)或involucrin(～100kD)。由于100kD處凝膠缺陷的干擾，將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化到轉(zhuǎn)移后用考馬斯藍(lán)染色的凝膠上。Involucrin是角質(zhì)膜的一種成分，由上基部細(xì)胞產(chǎn)生，在照射的豬皮膚中能檢測到，可用于未來的標(biāo)準(zhǔn)化目的。道AN，局部，活檢oc-2；BN，局部，活檢oc-3；CO，局部，活檢I-1；D只有PBS，活檢I-5；EN，皮下注射，活檢I-6。
圖4B利用針對一種加入的融合蛋白標(biāo)記的單克隆抗體檢測β-半乳糖苷酶報道蛋白。AN，局部，活檢oc-1，用抗-Xpressa檢測；B與A的匹配圖，檢測抗Von Willenbrand因子(Sigma)；C未處理的活檢標(biāo)本，用抗-Xpressa(Invitrogen)檢測。
圖5將納米膠囊加入水性縫線包被中，縫線用于器官培養(yǎng)中的豬皮活檢標(biāo)本。用Cy3結(jié)合的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物檢測納米膠囊，摻入綿羊IgG，利用兔抗GFP多克隆抗體(Abcom)以及Fitc-結(jié)合的兔抗IgG多克隆抗體和Alexa 488-結(jié)合的抗Fitc多克隆抗體(Molecular Probes)，檢測GFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)。包括不含一級抗體的對照，用于估計信號-背景水平。
圖6A如前所述檢測納米膠囊，利用兔抗GFP多克隆抗體以及Cy3結(jié)合的抗兔IgG多克隆抗體(Jackson Laboratories)檢測GFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
圖6B如圖5所述檢測GFP表達(dá)，細(xì)胞核用10μg/ml二苯甲酰胺復(fù)染。
圖6C癌細(xì)胞和HDF細(xì)胞分別以2000和6000細(xì)胞/孔接種到96孔平板上過夜。如圖所示向孔中加入順鉑制劑18小時，然后洗脫。72小時后，通過商品MTT測定法(WST測定，Boehringer Mannheim)估計細(xì)胞存活力?？滓皇絻煞?。
圖7溶酶體的共定位用抗Lamp-1的單克隆抗體(TransductionLaboratories)檢測。包括O-甲基RNA的AFM圖像，它是通過與27KD聚乙烯亞胺納米包封或復(fù)合配制而成的。
實(shí)施例在下列實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例只是旨在說明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員明白屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的許多修改和變化。
試劑A.核酸縮合劑聚(氮丙啶)(PEI)為27千道爾頓(kD)。PEI以最佳條件使用(90％電荷中和)。
聚賴氨酸(PLL)分子量為70-150000。利用可從Pierce Chemical(Rockford，IL)獲得的碳二亞胺(carboxiimide)化學(xué)劑將PLL縮合物質(zhì)與核信號定位肽(SV-40 T抗原或cys-gly-tyr-gly-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val-gly-gly)結(jié)合。
核基質(zhì)蛋白(NMP)的制備。利用Gerner等人，J.Cell.Biochem.71(1998)363-374所述的方法從大鼠成纖維細(xì)胞系和人角質(zhì)細(xì)胞系中收集NMP，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。蛋白質(zhì)制品與所述核信號定位肽結(jié)合。
B.表面活性劑2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TM-二醇)HLB＝4-5，CMC未測。
聚(氧-1，2-乙二醇)、a-(4-壬基酚)-w-羥基、Tergitol NP-40(NP40)HLB＝17.8，CMC 180μM，聚氧乙烯20山梨聚糖單油酸酯(Tween 80)HLB＝10，CMC920μM，鯨蠟醇HLB＝4，CMC未測。
C.聚合物透明質(zhì)酸，細(xì)菌衍生的，100萬千道爾頓(MM kD)，如美國專利5,846,561(在此引用作為參考)所述與核定位信號肽結(jié)合。
透明質(zhì)酸，來源于人臍帶，約4MMkD，未結(jié)合。
聚烯吡酮(Povidone)(聚乙烯吡咯烷酮，PVP)，分子量10000kD，未生物結(jié)合。
聚烯吡酮(聚乙烯吡咯烷酮，PVP)，分子量40000kD，未生物結(jié)合。
聚烯吡酮(聚乙烯吡咯烷酮，PVP)，分子量36000kD，未生物結(jié)合。
腱生蛋白，220kD，未生物結(jié)合。
D.表達(dá)載體334pcDNA/His/lacZ，產(chǎn)半乳糖苷酶，摻入CMV啟動子，基于pcDNA3.1(Invitrogen)，8.6kb。
425pEGFP-c/farn，為便于顯微鏡檢用法呢基部分修飾的增強(qiáng)GFP(綠色熒光蛋白)表達(dá)載體，CMV啟動子，4.6kb。
423pEGFP-c3/p57(Kpn/Sma)Clontech增強(qiáng)GFP(綠色熒光蛋白)表達(dá)載體，用來自細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶的核定位標(biāo)記修飾，以便于顯微鏡檢，4.6kb。
E.細(xì)胞CCRL1764無限增殖化大鼠新生成纖維細(xì)胞系HaCaT無限增殖化人角質(zhì)細(xì)胞系Ca9來自舌源鱗狀細(xì)胞癌的人腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例1A-改變分散條件對親水性納米膠囊的影響研究了適當(dāng)?shù)姆稚l件在下面一系列制劑中的重要性。這些制劑如下生產(chǎn)i)利用水浴超聲波儀在冰上預(yù)分散25μgDNA(425)，ii)通過振蕩，然后在冰上溫育20分鐘，縮合少量水中的DNA，iii)加入表面活性劑，隨后加入油，然后以10瓦探針超聲處理30秒，iv)首先加入鹽水，然后加入1MM kD透明質(zhì)酸聚合物(1％)作為保護(hù)膠體，擴(kuò)散稀釋為3毫升(mL)，v)通過250微米(μm)孔泵入22mL PBS、10毫摩爾(mM)Ca2+、200mMLi+中，將乳液機(jī)制剪切為小滴，vi)顛倒溫育過夜，vii)離心回收納米顆粒，用于重懸浮和過濾除菌。縮合劑與DNA的重量比根據(jù)90％電荷中和時的染料排除確定。在該實(shí)驗(yàn)中用TM-二醇作為水不溶性表面活性劑，而用Tergitol NP40和Tween 80作為水溶性甚至更高水溶性的乳化劑/分散助劑。
為了防止在水性基質(zhì)中形成微團(tuán)，通過下列方法系統(tǒng)改變分散條件i)選擇水溶性表面活性劑(制劑S、T、U和V)，ii)除去分散相(制劑T)，iii)將表面活性劑加載量降低至微團(tuán)形成所需的量以下。制劑U的特征在于使用水可混溶性油(硅油)。
物理表征這些制劑，測試其體外基因轉(zhuǎn)移的功能性。定量結(jié)果總結(jié)于表1A中。
表1A改變分散條件對親水性納米膠囊的影響
納米膠囊的大小由開放模式AFM決定，圖像示于圖1A中。數(shù)據(jù)表明平均小于50nm的納米膠囊大小僅用多相系統(tǒng)與低水溶性表面活性劑即可獲得(表1A制劑Q、R對S、T、U、V和W)。此外，只有小于50nm的納米膠囊導(dǎo)致在CRL-1764大鼠成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生可檢測的轉(zhuǎn)基因(表1A)。有效的分散也對應(yīng)于減少的凝集和提高的DNA穩(wěn)定性(如電泳分裂產(chǎn)物減少如證明的)。起始DNA部分松弛(根據(jù)電泳，76％為超螺旋)。以該值為基礎(chǔ)，在100小時釋放測試后仍然包封的DNA的超螺旋保持(rentention)在多相系統(tǒng)中是優(yōu)秀的。
分散、粉化的親水性納米膠囊的釋放圖是線性的，顯示沒有零裂解，在72小時后導(dǎo)致約60％釋放(見圖1B)。用該系列中(Tween 80)的大多數(shù)水溶性表面活性劑制備的制劑W不能完全釋放加載的DNA。圖1C說明，利用包括丁醇抽提10％丁醇/鹽水釋放液體、在miniprep柱上分離以及在260nm激發(fā)下測量吸光度的方法，能精確地回收少量DNA(在該情況下為300納克DNA)。通過在利用商品共沉淀助劑乙醇共沉淀后電泳回收的DNA，證實(shí)了由紫外光譜法獲得的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)1A證明，多相系統(tǒng)在由微團(tuán)溶液產(chǎn)生包被顆粒中的重要性確定了表面活性劑的要求，確認(rèn)了體外測量釋放分布圖的方法。
實(shí)施例1B-過程參數(shù)對顆粒功能性的影響為了研究調(diào)整過程參數(shù)對納米膠囊輸送DNA的功能性的影響，制備一系列制劑(設(shè)計在3天內(nèi)釋放)，測量這些制劑在5天后在大鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中輸送核綠色熒光蛋白(GFP)報道轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。調(diào)節(jié)DNA分子的電荷中和、表面活性劑/油系統(tǒng)、表面活性劑相總體積、應(yīng)用探針超聲處理、粉化的絕對需要和接受水浴摩爾滲透(osmolality)。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于表1B中表1B過程參數(shù)對顆粒功能性的影響
*納米膠囊直徑報告為利用數(shù)字圖像分析獲得的較小和較大顆粒軸的平均值，而納米膠囊形態(tài)報告為不規(guī)則、桿狀(r)、橢圓形(e)或球形(s)。
DNA的水分散體與本發(fā)明方法的不可溶表面活性劑濃縮，產(chǎn)生平均直徑小于50nm的納米膠囊。大量的成功操作方案可行，對包封產(chǎn)量有不同的影響。在鯨蠟醇/蓖麻油系統(tǒng)中，濃縮使顆粒的平均直徑從20nm變化為12nm(表1BF1對F2)。當(dāng)使用TM-二醇/DMSO表面活性劑系統(tǒng)起始微團(tuán)形成時(表1BF4對F5)，縮合劑重量比的同樣降低使顆粒大小從24nm增加到36nm，而仍保持納米膠囊輸送轉(zhuǎn)基因的功能性。這一發(fā)現(xiàn)說明表面活性劑的選擇影響納米膠囊的最終平均直徑。
在納米膠囊形式過程中去掉中等的能量輸入(減少探針超聲、粉化，但保留水浴超聲處理)，使功能性顆粒產(chǎn)量降低(表1BF3對F4)。這一發(fā)現(xiàn)說明，納米膠囊的最佳產(chǎn)量不依賴于任何自發(fā)的微滴乳化過程。助溶劑相體積從4％重量降到500ppm，而對顆粒功能性沒有任何負(fù)面影響(表1BF4對F6)。這一發(fā)現(xiàn)說明，利用本發(fā)明的方法能制備基本上不含溶劑的納米膠囊。最后，從接受水浴的粉化過程中去除鹽，而對納米膠囊功能性沒有任何負(fù)面影響(表1BF6對F7)。實(shí)施例2-納米膠囊大小對人角化細(xì)胞的納米膠囊攝取的影響在該實(shí)施例中研究了納米膠囊大小對無限增殖化HacaT人類角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(HacaT’s)中胞內(nèi)交通的影響。對于這一系列制劑，用不同孔口直徑的注射器剪切三種微團(tuán)分散體。包被重量也從1∶1 DNA聚合物(w/w)降為1∶40，以將溶解型從5天縮短為3天。在這些實(shí)驗(yàn)中，將納米膠囊制劑與DNA和PEI的標(biāo)準(zhǔn)polyplexes和lipoplexed質(zhì)粒DNA相比較。表2總結(jié)了實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果表2顆粒大小對納米膠囊的基因轉(zhuǎn)移功能性的影響
關(guān)鍵詞0＝與未刺激的條件沒有改變，+刺激的細(xì)胞數(shù)量增多大于25％，++增多大于50％，+++增多大于75％。ND＝未測。
我們發(fā)現(xiàn)，與未刺激狀態(tài)相比，納米膠囊具有比標(biāo)準(zhǔn)制劑更高的細(xì)胞胞飲活性，較小的納米膠囊使胞飲活性從網(wǎng)格蛋白包被的凹陷轉(zhuǎn)移到小窩(表2制劑O對pei-dna和lipoplex pDNA)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，納米膠囊在加入10小時后避免了溶酶體的共定位，較小的納米膠囊特別有效(見表2制劑對pei-dna和lipoplex pDNA)。這些結(jié)果在圖2中進(jìn)一步說明。通過與公開的對HacaT角質(zhì)細(xì)胞的攝取研究相比較，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了這種提高。與初級角質(zhì)細(xì)胞相比，在HacaT中裸DNA寡核苷酸的攝取(20μm)極少，顯示在2小時時寡核苷酸在點(diǎn)狀囊泡一致的溶酶體中積累。利用本發(fā)明方法的分散、粉化的親水性納米膠囊，證明在加入10小時后完全避開溶酶體。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法的產(chǎn)物將具有提高的和延長的效能。實(shí)施例3-納米顆粒輸送對DNA和試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響為了測試由脂質(zhì)體或dendrimer釋放的可溶性外源DNA是否誘導(dǎo)凋亡，用加載/未加載的脂質(zhì)體復(fù)合物、dendrimer復(fù)合物、納米顆粒和1μg/ml表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)處理Rt-1’s，DNA嵌入劑作為陽性對照。培養(yǎng)物用標(biāo)準(zhǔn)制劑處理3小時，在30小時后測定基因產(chǎn)物表達(dá)。培養(yǎng)物用納米膠囊處理4天，以確保實(shí)驗(yàn)過程中全部DNA釋放。對照中包括1μg/ml表鬼臼毒吡喃葡糖苷作為凋亡細(xì)胞死亡的陽性對照，在實(shí)驗(yàn)終止之前對培養(yǎng)物施用DNA嵌入劑過夜。其它對照包括標(biāo)準(zhǔn)PEI-DNA復(fù)合物，空納米膠囊和含有空載體質(zhì)粒DNA的納米膠囊。對于本實(shí)驗(yàn)，如前所述用35號注射器產(chǎn)生親水性納米顆粒。
凋亡中較后的步驟之一是凋亡程序中核酸內(nèi)切酶激活介導(dǎo)的DNA破碎。因此，通過用外源酶和取代核苷酸(TUNELtdt-介導(dǎo)的尿嘧啶核苷酸和標(biāo)記)末端標(biāo)記片段測定DNA破碎。結(jié)果表示為破碎指數(shù)，或顯示BRDU末端標(biāo)記的DNA的細(xì)胞占總培養(yǎng)物的百分?jǐn)?shù)。培養(yǎng)物一式兩份。實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果總結(jié)于表3中表3納米膠囊包被重量對非特異試劑和質(zhì)粒DNA相關(guān)細(xì)胞毒性的影響
表3B納米包封的pDNA的劑量反應(yīng)
我們發(fā)現(xiàn)，使用控釋納米膠囊使成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡細(xì)胞的比例減少了3-100倍。不含DNA的常規(guī)試劑顯示FI比空納米顆粒提高4倍，但在其它DNA存在下不含其它試劑又提高50-100％。將包被重量從1∶40降低到1∶400使納米膠囊平均直徑從20nm提高到57nm，并且導(dǎo)致在培養(yǎng)物中出現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)區(qū)(表3F omicron對F upsilon 35)。將包被重量從1∶40降低到中間的1∶100降低了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但不增加顆粒大小和細(xì)胞毒性的出現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)表明，納米膠囊設(shè)計在保持納米膠囊完整性中起作用，大小的影響和溶解型能有助于觀察到的細(xì)胞毒性和功能性。我們的結(jié)論是，應(yīng)用納米膠囊制劑使劑量提高到有用的效率水平，但不誘發(fā)凋亡程序。
表3B說明了在成纖維細(xì)胞裂解物中測量的制劑K.35劑量反應(yīng)的提高。在用劑量逐漸提高的納米膠囊處理4天后，測量成纖維細(xì)胞裂解物中GFP的產(chǎn)生。9.5μg劑量的納米膠囊相當(dāng)于脂質(zhì)體制劑的產(chǎn)生，而未證明有任何細(xì)胞毒性。實(shí)施例4-納米膠囊通過經(jīng)皮和皮下途徑通過角質(zhì)化屏障上皮向豬組織輸送大分子研究了納米膠囊向豬活檢器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的組織輸送非病毒核酸的應(yīng)用。在無菌條件下從服用鎮(zhèn)靜藥的實(shí)驗(yàn)動物中收集6mm和8mm的圓形活檢標(biāo)本，在部分接觸含20％胎牛血清的培養(yǎng)基的網(wǎng)上培養(yǎng)?；顧z標(biāo)本注射90μl(6.3μg)或用3×30μl等份局部處理。在7天后驟凍活檢標(biāo)本，切片/勻漿進(jìn)行β-半乳糖苷酶產(chǎn)生測定。制劑信息和實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表4中
表4分散、粉化的納米膠囊在穿過角質(zhì)化屏障膜輸送大分子中的功能性
*＝p＜0.05
照射的組織裂解物的Western blotting顯示，用制劑N局部處理的雙份活檢標(biāo)本中的β-半乳糖苷酶比用鹽水處理的同樣培養(yǎng)的6mm活檢標(biāo)本提高3倍。在用制劑O納米顆粒局部處理的8mm活檢標(biāo)本中測得只有2倍提高(見圖4B)。用較高分子量的N聚合物類似物產(chǎn)生制劑O，提示顆粒形態(tài)學(xué)、劑量效應(yīng)不同或與這種差異有關(guān)的兩種制劑的原位釋放圖不同。為了確定納米膠囊輸送效能最初的細(xì)胞型特異性差異，在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中利用細(xì)胞特異性表位的抗體分析組織切片的β-半乳糖苷酶表達(dá)(見圖4B)。對這些切片的數(shù)字圖像分析表明，照射的角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在用10天釋放制劑處理7天后容易在器官培養(yǎng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)。不含有細(xì)胞特異性標(biāo)記就不可能特異地定量成纖維細(xì)胞，然而，在N活檢真皮中測得表達(dá)區(qū)增加11倍(見圖4B)。有趣的是，對于制劑N和O局部處理的活檢標(biāo)本，轉(zhuǎn)導(dǎo)血管的面積百分?jǐn)?shù)在100-300μm深的附近區(qū)域減少約50％(表4乳突狀對網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞)。這些數(shù)據(jù)提示，納米膠囊滲透表皮進(jìn)入真皮。實(shí)施例5-本發(fā)明的納米膠囊摻入固體劑型中，用于物理靶向的其它用途通過在1000μl體積中振蕩混合下列成分，將含有核GFP轉(zhuǎn)基因或空載體的納米膠囊摻入縫線包被中i)50μg含有質(zhì)粒DNA的納米膠囊，ii)200μg牛粘蛋白，和iii)75μg蔗糖(60％w/w)。通過用縫線5次穿過穿孔的微量離心管，無菌包被縫線。通過在培養(yǎng)的豬皮膚活檢標(biāo)本中應(yīng)用縫線，檢測基因轉(zhuǎn)移的包被功能性?；顧z標(biāo)本在網(wǎng)上培養(yǎng)，使得活檢標(biāo)本底部接觸細(xì)胞培養(yǎng)基。處理活檢標(biāo)本7天，然后驟凍，切片，進(jìn)行免疫熒光顯微鏡檢查，估計納米膠囊的滲入和轉(zhuǎn)基因輸送。
利用抗綿羊IgG的鏈霉親和素-生物素免疫復(fù)合物檢測納米膠囊的滲入。用綿羊IgG刺穿納米膠囊包被，使這種檢測策略能夠進(jìn)行。圖5A顯示毛細(xì)血管積累的整個豬皮組織中綿羊IgG信號的分布。在圖5A’中，在玻片處理過程中不使用一級抗體，以測定背景熒光水平。在該圖中縫線可見?？p線可被確定為沒有陽性核復(fù)染的光滑物。利用多克隆GFP抗體證實(shí)GFP表達(dá)，消除了非特異性組織綠色熒光的影響。圖5B利用GFP多克隆抗體顯示整個縫線處理的真皮中GFP的表達(dá)。在750微米外可見縫線。圖5C顯示在用空載體包被處理的活檢標(biāo)本中沒有GFP表達(dá)。本實(shí)施例證明，納米膠囊可用于物理靶向的大分子輸送。實(shí)施例6-通過設(shè)計納米膠囊包被，納米膠囊在局部靶向中的用途成纖維細(xì)胞靶向如實(shí)施例1所述通過分散、粉化制備GFP納米膠囊。聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量10000)用作包被基質(zhì)。使用1∶40的包被重量比，產(chǎn)生23±2nm的桿狀納米膠囊。對人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)和HecaT角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物施用1μg PVP納米膠囊4小時，然后固定，利用抗綿羊IgG的鏈霉親和素-生物素免疫復(fù)合物檢測納米膠囊的攝入。用綿羊IgG刺穿納米膠囊包被，使該檢測策略能夠?qū)嵭?。圖6顯示PVP納米膠囊在HDF’s中的陽性核定位，和PVP納米膠囊在角質(zhì)細(xì)胞中的陰性共定位(圖66a對6b)。包括未處理的培養(yǎng)物的圖用作對比(6a’，6b’)。培養(yǎng)物也用5μg PVP納米膠囊處理5天，然后檢測GFP轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)生。與攝取研究結(jié)果一致，只有成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物顯示產(chǎn)生GFP轉(zhuǎn)基因(圖66a”對6b”)。
腫瘤靶向如實(shí)施例1所述通過分散、粉化制備GFP納米膠囊。腱生蛋白(TN，分子量200 000)用作包被基質(zhì)。使用1∶20的包被重量比，產(chǎn)生19±0.9nm的球形納米膠囊。對在器官培養(yǎng)中保存的豬活檢標(biāo)本以連續(xù)小份局部施用500ng TN納米膠囊。局部施用3分鐘后，用培養(yǎng)基中漂洗活檢標(biāo)本，改變培養(yǎng)基防止除局部施用外的任何施用。
為了模擬上皮來源的腫瘤的壞死，12小時前用50000個人鱗狀癌細(xì)胞接種活檢標(biāo)本。7天后驟凍活檢標(biāo)本，切片，免疫檢測GFP的產(chǎn)生。在圖6B中，圖“a”顯示在腫瘤中心有強(qiáng)烈的GFP熒光，圖b“b”用抗GFP的多克隆抗體證實(shí)了這種GFP表達(dá)，圖“c”利用細(xì)胞核的復(fù)染顯示切片中的細(xì)胞定位，圖“d”不用GFP抗體顯示背景熒光水平。利用抗角蛋白10/1的抗體(一種上皮標(biāo)記物)通過陽性檢測證實(shí)腫瘤的來源。圖“b”與圖“c”的對比表明，GFP表達(dá)只限于腫瘤內(nèi)的細(xì)胞。如實(shí)施例5已經(jīng)證明的，整個組織中的表達(dá)也是可行的，并且能通過包被設(shè)計調(diào)節(jié)。本實(shí)施例證明，納米膠囊輸送能有效地靶向。
用于提高藥物治療效果的細(xì)胞特異性輸送如實(shí)施例1所述制備納米膠囊包封順鉑——一種具有嚴(yán)重副作用的疏水性分子和常用的癌癥化療藥。使用1∶100的包被重量比，產(chǎn)生29±3nm的不規(guī)則納米膠囊。根據(jù)成纖維細(xì)胞相對于鱗狀細(xì)胞癌培養(yǎng)物的細(xì)胞生長抑制的劑量反應(yīng)改變，證明靶向效能。細(xì)胞接種于96孔平板上過夜，用含量逐漸提高的包封或未包封的藥物處理18小時，然后在總共72小時生長時間的48小時后，利用MTT測定法估計細(xì)胞生長抑制。結(jié)果示于圖6C中。數(shù)據(jù)表明，在應(yīng)用未包封藥物可殺死細(xì)胞的藥物水平時，腱生蛋白納米膠囊保護(hù)非靶細(xì)胞免于細(xì)胞死亡(零死亡)(圖6Aa實(shí)心圓對空心圓)。對于癌培養(yǎng)，TN納米膠囊將抑制濃度(IC50)有效地降低了估計300％，從525μg/ml到160μg/ml。實(shí)施例6證明納米膠囊可用于包被靶向的大分子輸送。實(shí)施例7-納米包封提高細(xì)胞攝取用作藥物、營養(yǎng)劑、研究試劑或化妝品的其它制劑的用途如實(shí)施例1所述制備含有500kD Fitc-標(biāo)記葡聚糖、20mer Fitc-標(biāo)記mer O-甲基化RNA寡核苷酸和16mer磷酸二酯DNA寡核苷酸的納米膠囊。使用1∶40的包被重量比，用1MM kD寡核苷酸作為包被基質(zhì)。利用PEI濃縮磷酸二酯DNA寡核苷酸，但在葡聚糖或RNA寡核苷酸制劑中不含PEI。通過評價35mm人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中相對胞飲活性和細(xì)胞攝取的改變，檢測納米膠囊輸送藥物的功能性。納米膠囊制劑與裸露制劑或復(fù)合制劑比較。定量結(jié)果總結(jié)于表7中。表6納米包封提高細(xì)胞攝取用作藥物、營養(yǎng)劑、研究試劑或化妝品的其它制劑。在加入后18小時，常規(guī)配制的制劑中只有溶酶體是明顯的。
*假定100％包封，估計包封的葡聚糖的劑量。
s＝球形r＝桿狀表7顯示，根據(jù)AFM，所有納米膠囊的平均直徑小于50nm。DNA寡核苷酸的PEI復(fù)合物在67nm處測量，不帶電荷的RNA O-甲基寡核苷酸的PEI復(fù)合物在236nm處測量。如實(shí)施例2所述，應(yīng)用角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物和質(zhì)粒DNA，納米膠囊刺激胞飲活性，網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白-1的信號水平升高證明了這一點(diǎn)。對于500kD葡聚糖，通過納米包封，胞飲活性向小窩有效轉(zhuǎn)移(表7，500kD葡聚糖)。在加入后4.5小時，核對包封葡聚糖和RNA的攝取高于裸露的葡聚糖和RNA。對于DNA寡核苷酸的納米膠囊，細(xì)胞攝取低于復(fù)合寡核苷酸，然而，到4.5小時時，大多數(shù)DNA寡核苷酸已經(jīng)在溶酶體中非有效地螯合(表7)。在加入后18小時，納米膠囊顯示從溶酶體中連續(xù)排除，而裸露的顯示高水平的螯合。這些結(jié)果示于圖7A和7B中。圖“a”和“b”顯示18小時培養(yǎng)物的Fitc檢測。RNA寡核苷酸的納米膠囊只分布于核中(圖7Ba對a’)。在用復(fù)合RNA寡核苷酸處理的培養(yǎng)物中可見點(diǎn)狀內(nèi)涵物，與溶酶體的免疫學(xué)標(biāo)記共定位(圖7Aa對a’)。包括來自AFM顯微鏡檢的顆粒大小結(jié)果，證明包封后大小顯著不同(圖7A，7Bb對b，b’)。也制備包封低分子量葡聚糖和不穩(wěn)定RNA的制劑，其具有類似的攝取、納米膠囊的大小和產(chǎn)量，證明包封不僅能提供靶向功能，而且有助于穩(wěn)定對化學(xué)或酶降解敏感的分子。這些實(shí)施例證明納米膠囊36可用于輸送大量大分子。
盡管已經(jīng)參照優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn)行改變。
權(quán)利要求
1.一種形成分散的微團(tuán)的方法，該方法包括形成一種表面活性劑微團(tuán)，其中該表面活性劑微團(tuán)含有包被生物活性成分表面形成表面活性劑微團(tuán)的一種表面活性劑，其中表面活性劑分子的HLB值小于約6.0單位；和將表面活性劑微團(tuán)分散到水性組合物中，其中該水性組合物含有親水性聚合物，其中該親水性聚合物包被生物活性成分表面，形成含有直徑小于約50納米的表面活性劑微團(tuán)的分散體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該表面活性劑分子是一種非離子型表面活性劑。
3.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括沉淀表面活性劑微團(tuán)的親水性聚合物，形成具有第一種直徑的第一種納米膠囊。
4.權(quán)利要求2的方法，其中該成分與納米膠囊的親水性聚合物分開。
5.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括溫育第一種納米膠囊，形成具有第二種直徑的第二種納米膠囊，其中第二種直徑小于第一種納米膠囊的第一種直徑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中溫育第一種納米膠囊包括將第一種納米膠囊浸入含有一種溶質(zhì)的水性組合物中。
7.權(quán)利要求1的方法，其中該生物活性成分是一種親水性成分。
8.權(quán)利要求1的方法，其中該生物活性成分是一種多核苷酸或多肽。
9.一種形成分散的表面活性劑微團(tuán)的方法，該方法包括將表面活性劑分子分散到第一種親水性組合物中，第一種親水性組合物含有一種親水性生物活性成分，其中表面活性劑分子的HLB值小于約5.0單位，該表面活性劑分子形成圍繞親水性生物活性成分的外殼，形成表面活性劑微團(tuán)的分散體；向表面活性劑微團(tuán)分散體中加入一種生物相容性親水性聚合物；其中該生物相容性親水性聚合物可有效地穩(wěn)定該分散體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中生物相容性親水性聚合物形成圍繞表面活性劑微團(tuán)的外殼。
11.一種形成納米膠囊的方法，該方法包括將表面活性劑分子分散到含有親水性生物活性成分的第一種水性組合物中，其中表面活性劑分子的HLB值小于約5.0單位，該表面活性劑分子吸附于親水性成分的表面上，形成表面活性劑微團(tuán)；向第一種水性組合物中加入生物相容性聚合物，形成含有多種穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)的穩(wěn)定的水性組合物；和凝固穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)，方法是將穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)分散到含有一種溶質(zhì)的第二種水性組合物中，持續(xù)可有效形成具有第一種直徑的第一種納米膠囊所需的時間。
12.權(quán)利要求11的方法，其中表面活性劑分子的臨界微團(tuán)濃度低于約200μm。
13.權(quán)利要求11的方法，其進(jìn)一步包括在將表面活性劑分子分散到第一種水性組合物中之前，將表面活性劑分子分散到生物相容性油中。
14.權(quán)利要求11的方法，其中生物相容性聚合物可有效地形成圍繞表面活性劑微團(tuán)的外殼。
15.權(quán)利要求11的方法，其中表面活性劑分子的濃度低于約500ppm。
16.權(quán)利要求11的方法，其中分散穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)包括將穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)的小滴分散到第二種水性組合物中。
17.權(quán)利要求11的方法，其中濃縮親水性生物活性成分。
18.一種生產(chǎn)納米膠囊的方法，該方法包括濃縮第一種水性組合物中的生物活性成分，形成濃縮的生物活性成分；將表面活性劑分子分散到第一種水性組合物中，其中表面活性劑分子的HLB值小于約5.0單位，表面活性劑分子吸附于濃縮的生物活性成分表面上，形成大量表面活性劑微團(tuán)；用生物相容性聚合物包被表面活性劑微團(tuán)，形成大量穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)；將穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)分散到含有一種溶質(zhì)的第二種水性組合物中，形成具有第一種直徑的納米膠囊；和其中生物活性成分不混合于納米膠囊的生物相容性聚合物中。
19.權(quán)利要求18的方法，其中生物相容性聚合物是一種離子滲透聚合物。
20.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括溫育納米膠囊，形成具有第二種直徑的第二種納米膠囊，其中第二種直徑小于第一種直徑。
21.一種制備納米膠囊的方法，該方法包括形成一種疏水性組合物，其中該疏水性組合物含有一種吸附于疏水性成分表面的表面活性劑分子，其中該表面活性劑分子的HLB值小于約5.0單位；向該疏水性組合物中加入生物相容性聚合物，形成穩(wěn)定的組合物，其中該生物相容性聚合物可有效地形成圍繞表面活性劑分子的外殼；和將穩(wěn)定的組合物分散到水性組合物中，形成納米膠囊。
22.權(quán)利要求21的方法，其中生物相容性聚合物是一種親水性組合物。
23.權(quán)利要求21的方法，其中生物相容性聚合物能夠離子滲透交換。
24.權(quán)利要求21的方法，其中疏水性組合物進(jìn)一步包含一種水溶性溶劑。
25.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包括通過溫育在含有一種溶質(zhì)的水性組合物中的納米膠囊，沉淀該納米膠囊。
26.權(quán)利要求25的方法，其中溫育納米膠囊可有效地縮小納米膠囊的直徑。
27.權(quán)利要求21的方法，其中分散穩(wěn)定的組合物包括機(jī)械形成穩(wěn)定的組合物的大量小滴；和將大量小滴分散到水性組合物中。
28.權(quán)利要求21的方法，其中表面活性劑選自2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇、含有乙炔二醇部分的分子和2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇的混合物。
29.權(quán)利要求21的方法，其中疏水性組合物不混合或包埋于生物相容性聚合物中。
30.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包括過濾納米膠囊。
31.權(quán)利要求22的方法，其進(jìn)一步包括離心納米膠囊。
32.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包括向固體劑型中加入納米膠囊。
33.權(quán)利要求32的方法，其中固體劑型選自顆粒、片劑、丸劑、薄膜和包衣。
34.一種轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳物質(zhì)的方法，該方法包括對大量細(xì)胞應(yīng)用通過權(quán)利要求1的方法制備的、含有一種多核苷酸的大量納米膠囊；和通過由細(xì)胞內(nèi)的納米膠囊核心釋放多核苷酸，轉(zhuǎn)導(dǎo)該細(xì)胞。
35.一種轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳物質(zhì)的方法，該方法包括對患者施用通過權(quán)利要求1的方法制備的、含有一種多核苷酸的大量納米膠囊。
36.權(quán)利要求35的方法，其中輸送包括經(jīng)口、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鞘膜內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、局部、經(jīng)皮、栓劑、陰道栓、尿道內(nèi)、門脈內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)鼓膜、肝內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)或其任一組合。
37.權(quán)利要求35的方法，其中多核苷酸從納米膠囊核心釋放。
38.利用權(quán)利要求11的方法制備的一種納米膠囊。
39.一種對細(xì)胞施用基因的方法，該方法包括對上皮細(xì)胞施用有效量的多個納米膠囊，其中該納米膠囊含有受一種啟動子控制的基因。
40.一種形成納米膠囊基質(zhì)的方法，該方法包括混合大量納米膠囊、結(jié)合劑和賦形劑，形成納米膠囊基質(zhì)，其中該納米膠囊基質(zhì)能夠釋放納米膠囊。
41.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括施用、成丸、壓片或顆?；{米膠囊基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及納米膠囊和制備這些納米膠囊的方法。本發(fā)明包括一種方法，包括形成表面活性劑微團(tuán)，并將該表面活性劑微團(tuán)分散于含有親水性聚合物的水性組合物中，形成穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)分散體。該方法還包括機(jī)械形成穩(wěn)定的表面活性劑微團(tuán)分散體的小滴，沉淀親水性聚合物，形成沉淀的納米膠囊，溫育該納米膠囊以縮小其直徑，過濾或離心該納米膠囊。
文檔編號B01J13/02GK1406140SQ01805792
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月28日
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