專利名稱：一種大分子色素蛋白的吸附基質(zhì)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及吸附劑的制備，具體地說是殼聚糖一氨基酸共聚孔球作為大分子色素蛋白的吸附基質(zhì)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
殼聚糖是自然界中極為豐富的天然資源，它具有良好的生物親和性，可以生物降解，又具有良好的生物相容性及抗凝血性，因而在高分子藥物緩釋方面具有很大的應(yīng)用潛力，但由于其降解速度過快，在酸性條件下不穩(wěn)定，易于溶解，所以其應(yīng)用受到一定的限制。分子鏈上有豐富的胺基和羥基，易于進(jìn)行化學(xué)修飾。
高分子微球是性能優(yōu)異的功能高分子材料，在醫(yī)學(xué)免疫、生物工程、化學(xué)工業(yè)、分析化學(xué)及微電子等領(lǐng)域有著極其廣闊的應(yīng)用前景。
殼聚糖微球的制備有交聯(lián)法和反相電荷沉淀法。目前對(duì)殼聚糖微球的改性多是在殼聚糖分子引入相應(yīng)基團(tuán)，而后進(jìn)行交聯(lián)制球。而這種方法往往因活性胺基減少或空間位阻等原因，成球效果不好。
藻藍(lán)蛋白與藻紅蛋白是一種大分子色素蛋白，在適宜的波長(zhǎng)光的激發(fā)下，能產(chǎn)生單線態(tài)氧和其它的氧自由基，具有光敏性，用藻藍(lán)蛋白與藻紅蛋白介導(dǎo)光動(dòng)力反應(yīng)可以治療腫瘤。藻藍(lán)蛋白與藻紅蛋白有望成為新一代的抗腫瘤藥物，但由于其為多肽類化合物，易于被胃腸道的消化酶所降解，生物半衰期短。因此尚需尋找一種合適的劑型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)藻膽蛋白具有高吸附容量的大分子色素蛋白吸附基質(zhì)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種大分子色素蛋白的吸附基質(zhì)殼聚糖—氨基酸共聚孔球。
所述殼聚糖—氨基酸共聚孔球的制備過程如下，按比例將殼聚糖和氨基酸配制成水相溶液，向該溶液中加入致孔劑，分散在油相分散相(如甲苯)中，攪拌下滴加交聯(lián)劑(以SP80作乳化劑)，升溫至40-70℃固化，制成殼聚糖—氨基酸共聚孔球。
所述將殼聚糖和氨基酸配制成水相溶液是指將殼聚糖和氨基酸溶解于一價(jià)的酸溶液(如體積濃度5％的醋酸溶液)中。殼聚糖只能溶于酸性介質(zhì)中，實(shí)驗(yàn)表明無論是在無機(jī)酸，還是在有機(jī)酸中，它只溶于一價(jià)的稀酸溶液中，不溶于二價(jià)的稀硫酸和草酸以及三價(jià)的稀磷酸等酸性介質(zhì)中.用HA代表溶劑酸，Chitosan-NH2代表殼聚糖，則殼聚糖溶于酸性介質(zhì)時(shí)可用下式表示
殼聚糖不溶于稀硫酸，草酸和磷酸中，可能是因?yàn)檫@些陰離子與分子鏈間有較強(qiáng)的靜電作用，形成了膠束狀結(jié)構(gòu)，因而使殼聚糖不能進(jìn)入水溶液中得以溶解。
所述殼聚糖與氨基酸的氨基摩爾比通常為1∶1-1∶0.5(Ncs∶Ngly＝1∶1-1∶0.5cs-殼聚糖，gly-甘氨酸)；水相溶液中的殼聚糖重量體積(W/V)濃度通常為3-8％；水相溶液與油相的水油比(W/O)為1∶1.5-1∶3；滴加交聯(lián)劑后通?？刂苙NH2∶nCHO＝1∶1-1∶4。
交聯(lián)劑可采用戊二醛或環(huán)氧氯丙烷。前者對(duì)殼聚糖的交聯(lián)發(fā)生在胺基上，后者則既可發(fā)生在胺基上，又可發(fā)生在羥基上。
分散相可采用苯、液臘、四氯化碳、甲苯等。依據(jù)微粒的密度和粒徑大小的需要進(jìn)行選擇。選擇的標(biāo)準(zhǔn)是1微?；蛞旱螒腋≡诜稚⑾嘀?要求微粒的粒徑大，選用粘度小的分散相；反之，則選用粘度大的分散相。必要時(shí)，加入乳化劑和高分子表面活性劑幫助分散。本發(fā)明采用甲苯作分散相。
乳化劑乳化劑可分為親油性和親水性兩類，以HLB值表示—100％親油性的乳化劑HLB為0，100％親水性，HLB為20，其間20等分。值高親水性大，值低親油性高。加入乳化劑目的一是可降低兩相間的界面張力，使殼聚糖溶液更易于分散成小液滴，二是吸附在液珠的表面，保護(hù)液珠在彼此碰撞時(shí)不至于合并、粘結(jié)。常用的乳化劑有SPAN系列(包括SP20，SP40，SP60，SP80等)，TWEEN系列(包括TW20，TW40，TW60，TW80)，SPAN系列屬于親油的，而TWEEN系列是親水的，一般地說，隨著數(shù)值的增大，其親油性基本是增大的。在本發(fā)明中，采用親油性的SP系列要比親水性的TWEEN系列效果好。(HLBSP20 8.6，SP40 6.7，SP60 4.7，SP80 4.3；TW20 16.7，TW40 15.6，TW60 14.9，TW80 15.6)致孔劑在聚合過程中加入致孔劑，在網(wǎng)絡(luò)骨架固定化和鏈結(jié)構(gòu)單元形成的過程中，致孔劑為填充其中的惰性分子，可起到預(yù)先留下孔道的作用。在骨架固定后，將致孔劑抽提出去，留下永久性孔道。
根據(jù)不同的孔徑要求，可以采用溶劑致孔和線形高分子致孔。在本發(fā)明中，溶劑致孔可采用乙酸乙酯，線形高分子致孔可采用聚乙二醇等。本發(fā)明采用乙酸乙酯作為致孔劑，在致孔劑與殼聚糖溶液的體積比為0.25∶1-1∶1之間孔度隨致孔劑的用量的增多而增大。
制備好的微球加入硼氫化鈉的堿性溶液還原；實(shí)驗(yàn)中所用氨基酸可以根據(jù)被吸附大分子色素蛋白所需適宜的PH值選擇合適等電點(diǎn)的氨基酸。
所述吸附基質(zhì)作為大分子色素蛋白的吸附載體，大分子色素蛋白可為藻藍(lán)蛋白或藻紅蛋白；其中，藻藍(lán)蛋白分子量為138KD，藻紅蛋白分子量為240KD，等電點(diǎn)均介于4和5之間。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.開創(chuàng)了一種新的對(duì)殼聚糖改性的方法。以往對(duì)殼聚糖的改性多是利用與其活潑胺基或羥基反應(yīng)直接引入，本發(fā)明提供的方法可通過共聚的方式將氨基酸中的羧基巧妙引入殼聚糖(在殼聚糖微球中引入—COOH)。
2.蛋白吸附容量高。藻膽蛋白是一種分子量高達(dá)十萬道兒頓以上的高分子蛋白質(zhì)，一般的凝膠球?qū)ζ湮饺萘亢苡邢?。本發(fā)明所提供的共聚孔球?qū)υ寮t蛋白的吸附容量可達(dá)18.074mg/g，對(duì)藻藍(lán)蛋白的吸附高達(dá)39.013mg/g。
3.吸附范圍廣?？筛鶕?jù)不同蛋白的特性，選用不同的氨基酸共聚(已合成出殼聚糖-賴氨酸、殼聚糖-苯丙氨酸、殼聚糖-天冬氨酸等幾種微球)。


圖1為殼聚糖—氨基酸共聚孔球整體照片；圖2為殼聚糖—氨基酸共聚孔球表面照片；圖3為殼聚糖—氨基酸共聚孔球?qū)υ寮t蛋白的吸附平衡曲線；圖4為殼聚糖—氨基酸共聚孔球?qū)υ逅{(lán)蛋白的吸附平衡曲線。
圖中，系列1交聯(lián)劑為戊二醛，系列2為環(huán)氧氯丙烷；由圖中可以看出，共聚孔球?qū)υ迥懙鞍椎奈皆趦尚r(shí)內(nèi)就基本達(dá)到平衡。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1殼聚糖—甘氨酸共聚孔球的制備稱取2g殼聚糖和0.93g的甘氨酸，溶于40ml 5％的醋酸中，制得殼聚糖—甘氨酸混合液，在該混合溶液中加入10ml乙酸乙酯。將此混合液分散于120ml甲苯(含1％(v/v)SP80)中，待分散均勻后，加入25％的戊二醛(保持n-NH2∶n-CHO＝1∶4)，待凝膠化完成后，加入5％的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH在10左右，升溫至40℃反應(yīng)1h，再升溫至70℃反應(yīng)2h，使球固化，然后過濾，甲苯、乙醇洗滌后，再用蒸餾水淋洗樹脂，洗掉多余的戊二醛與小分子化合物，最后以乙醇洗滌，干燥，得共聚孔球(參見圖1、2)。
共聚孔球?qū)υ寮t蛋白的吸附靜態(tài)吸附稱取殼聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克，在錐形瓶，加入一定濃度的藻紅蛋白(藻膽蛋白具有光敏性，試液及取樣都需避光保存)溶液20ml；將小球加入錐形瓶中，放入搖床上搖動(dòng)，設(shè)定溫度37℃；以緩沖液為空白對(duì)照，每隔一定時(shí)間取樣，如分別在開始和0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取樣，取完后用分光光度計(jì)測(cè)其OD值，根據(jù)OD值與濃度的關(guān)系確定吸附量，以吸附量對(duì)時(shí)間作圖，得吸附平衡曲線。(參見圖3系列1)。
動(dòng)態(tài)吸附稱取一定量的共聚孔球，作為吸附載體裝入玻璃層析管，加入一定濃度(可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和所用儀器的靈敏度目測(cè)蛋白濃度，只要在儀器相對(duì)準(zhǔn)確的濃度范圍內(nèi)就應(yīng)該可以，并不需要特別指定蛋白濃度)的藻紅蛋白溶液，控制柱子流速，使得每15分鐘(通常5分鐘以上即可，目的是使球內(nèi)部空隙也有蛋白溶液經(jīng)過，充分利用所有可吸附表面積)色素蛋白恰好全部流出層析管；收集流出的色素蛋白溶液，再次加入層析管，進(jìn)行吸附操作。如此反復(fù)進(jìn)行10次(不一定就是10次，可為多次，目的是讓小球充分吸附蛋白)，使孔球吸附的色素蛋白達(dá)到飽和，之后，取出少量樣品，測(cè)定其OD值。根據(jù)吸附前后光吸收的變化可以得到被吸附藻紅蛋白的量，測(cè)的最大吸附容量為18.074mg/g(被吸附的蛋白量/球的干重)。
實(shí)施例2稱取2g殼聚糖和0.93g的甘氨酸(Ncs∶Ngly(殼聚糖—甘氨酸的氨基摩爾比)＝1∶1)，溶于40ml體積濃度5％的醋酸中，制得殼聚糖—甘氨酸混合液，在該混合溶液中加入20ml乙酸乙酯。將此混合液分散于120ml甲苯(含1％(v/v)SP80)中，待分散均勻后，加入10ml預(yù)交聯(lián)劑甲醛，15min后，加入10ml 25％的戊二醛(保持n-NH2∶n-CHO＝1∶4)，待凝膠化完成后，加入5％的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH在10左右，分兩次加入3.5ml環(huán)氧氯丙烷，升溫至40℃反應(yīng)1h，再升溫至70℃反應(yīng)2h，使球固化，然后過濾，甲苯、乙醇洗滌后，再用蒸餾水淋洗樹脂，最后以乙醇洗滌，干燥，得共聚孔球。
靜態(tài)吸附稱取殼聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克，置于錐形瓶，加入藻紅蛋白溶液1.5ml，用蒸餾水稀釋至20ml。將小球加入錐形瓶中，放入搖床上搖動(dòng)，設(shè)定溫度37℃。以蒸餾水為空白液，分別在開始和0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取樣，取完后用分光光度計(jì)測(cè)其OD值，根據(jù)OD值與濃度的關(guān)系確定吸附量，以吸附量對(duì)時(shí)間作圖，得吸附平衡曲線(參見圖3系列2)。
動(dòng)態(tài)吸附稱取一定量的共聚孔球，作為吸附載體裝入玻璃層析管，加入一定濃度的藻紅蛋白溶液，控制柱子流速，使得每15分鐘色素蛋白恰好全部流出層析管；收集流出的色素蛋白溶液，再次加入層析管，進(jìn)行吸附操作。如此反復(fù)進(jìn)行10次，使孔球吸附色素蛋白達(dá)到飽和，之后，取出少量樣品，測(cè)定其OD值。根據(jù)吸附前后光吸收的變化可以得到被吸附藻紅蛋白的量，測(cè)得最大吸附容量為11.214mg/g。
實(shí)施例3靜態(tài)吸附稱取實(shí)施例1所制得的殼聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克，置于錐形瓶錐形瓶，加入藻藍(lán)蛋白溶液1.5ml，用蒸餾水稀釋至20ml。將小球加入錐形瓶中，放入搖床上搖動(dòng)，設(shè)定溫度37℃。以蒸餾水為空白液，分別在開始和10min，30min，1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取樣，取完后用分光光度計(jì)測(cè)其OD值，根據(jù)OD值與濃度的關(guān)系確定吸附量，以吸附量對(duì)時(shí)間作圖，得吸附平衡曲線(參見圖4系列1)。
動(dòng)態(tài)吸附稱取一定量的實(shí)施例1中所制得的殼聚糖—甘氨酸共聚孔球，作為吸附載體裝入玻璃層析管，加入一定濃度的藻藍(lán)蛋白溶液，控制柱子流速，使得每15分鐘色素蛋白恰好全部流出層析管；收集流出的色素蛋白溶液，再次加入層析管，進(jìn)行吸附操作。如此反復(fù)進(jìn)行10次，使孔球吸附色素蛋白達(dá)到飽和，之后，取出少量樣品，測(cè)定其OD值。根據(jù)吸附前后光吸收的變化可以得到被吸附藻藍(lán)蛋白的量，測(cè)得最大吸附容量為39.013mg/g。
實(shí)施例4靜態(tài)吸附稱取實(shí)施例2中所制得的殼聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克，置于錐形瓶，加入藻藍(lán)蛋白溶液1.5ml，用蒸餾水稀釋至20ml。將小球加入錐形瓶中，放入搖床上搖動(dòng)，設(shè)定溫度37℃。以蒸餾水為空白液，分別在開始和10min，30min，1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取樣，取完后用分光光度計(jì)測(cè)其OD值，根據(jù)OD值與濃度的關(guān)系確定吸附量，以吸附量對(duì)時(shí)間作圖，得吸附平衡曲線(參見圖4系列2)。
動(dòng)態(tài)吸附稱取一定量的實(shí)施例2中所制得的殼聚糖—甘氨酸共聚孔球，作為吸附載體裝入玻璃層析管，加入一定濃度的藻藍(lán)蛋白溶液，控制柱子流速，使得每15分鐘色素蛋白恰好全部流出層析管；收集流出的色素蛋白溶液，再次加入層析管，進(jìn)行吸附操作。如此反復(fù)進(jìn)行10次，使孔球吸附色素蛋白達(dá)到飽和，之后，取出少量樣品，測(cè)定其OD值。根據(jù)吸附前后光吸收的變化可以得到被吸附藻藍(lán)蛋白的量，測(cè)得最大吸附容量為31.472mg/g。
權(quán)利要求
1.一種大分子色素蛋白的吸附基質(zhì)，其特征在于所述吸附基質(zhì)為殼聚糖—氨基酸共聚孔球。
2.按照權(quán)利要求1所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述殼聚糖-氨基酸共聚孔球的制備過程如下，將殼聚糖和氨基酸配制成水相溶液，加入致孔劑，分散在油相分散相中，攪拌下滴加交聯(lián)劑，制成殼聚糖-氨基酸共聚孔球。
3.按照權(quán)利要求2所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述將殼聚糖和氨基酸配制成水相溶液是指將殼聚糖和氨基酸溶解于一價(jià)的酸溶液中。
4.按照權(quán)利要求2所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述殼聚糖與氨基酸的氨基摩爾比為1∶1-1∶0.5。
5.按照權(quán)利要求2所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述水相溶液的殼聚糖重量體積濃度為3-8％。
6.按照權(quán)利要求2所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述水相溶液與油相的水/油比為1∶1.5-1∶3。
7.按照權(quán)利要求2所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述滴加交聯(lián)劑后控制nNH2∶nCHO＝1∶1-1∶4。
8.按照權(quán)利要求2所述吸附基質(zhì)，其特征在于所述氨基酸為甘氨酸。
9.一種權(quán)利要求1所述大分子色素蛋白吸附基質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于所述吸附基質(zhì)作為大分子色素蛋白的吸附載體，大分子色素蛋白為藻藍(lán)蛋白或藻紅蛋白；其中，藻藍(lán)蛋白分子量為138KD，藻紅蛋白分子量為240KD，等電點(diǎn)均介于4和5之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及吸附劑的制備，具體地說是殼聚糖－氨基酸共聚孔球作為大分子色素蛋白的吸附基質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為開創(chuàng)了一種在殼聚糖微球中引入－COOH的新方法；合成了一種對(duì)大分子色素蛋白具有較高吸附容量的共聚孔球。
文檔編號(hào)B01J20/26GK1739850SQ20041005032
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者王廣策, 薛志欣, 牛建峰, 夏好學(xué), 曾呈奎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所