專利名稱：核酸分析方法、分析裝置及分析用盤片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種核酸分析方法、分析裝置及分析用盤片，該分析方法為使含核酸的分析用樣品流過以重復模式改變溫度的流路，并以光學方法檢測樣品中經(jīng)PCR擴增的核酸濃度等。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(PCR)法為選擇性擴增樣品中微量存在的特定DNA的方法，通過此方法擴增的DNA可作為單一的化學物質(zhì)進行分析或利用。分析和利用由此分離的DNA的技術不僅被應用于科學研究和醫(yī)療領域，也被廣泛應用于全體工業(yè)界。
作為應用PCR方法的分析方法，已知的實時(real time)PCR方法為通過PCR選擇性擴增作為定量目標的DNA、并基于得到的擴增曲線間接測定樣品中所含DNA的最初含量的方法。該方法伴有利用逆轉(zhuǎn)錄酶由具有特定序列的RNA定量合成互補DNA的反應，因而也作為測定樣品中RNA量的方法進行利用。
實時PCR方法被廣泛用作具有可重復性、提高了定量性的測定方法，并且也用作無需繁瑣操作的簡便的DNA或RNA定量方法。其應用領域并非局限于核酸濃度測定法，也被用作有效檢測及鑒定基因多態(tài)性的方法，所謂基因多態(tài)性已知為人類基因的單核苷多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphism；SNP)，使與疾病相關的基因功能產(chǎn)生個體差異。
不局限于PCR，比較慢的反應也可利用簡單的方法對其發(fā)展過程進行經(jīng)時追蹤。即，在反應過程中從反應容器內(nèi)取出部分樣品，通過對取出的樣品進行逐一分析以追蹤該反應的發(fā)展過程的方法；或在多個容器中分別注入同一反應液，使這些容器分別處于同一反應條件下，并在特定時刻逐一停止不同容器中的反應，以此獲得同一反應的時間系列樣品，并對該時間系列的樣品進行逐個分析以追蹤該反應進行過程的方法。但前一種方法需要進行取樣，后一種方法不能在同一容器中進行分析，兩者都不能在封閉的體系中檢測最初至最后的反應過程。另外，被取樣、測定的樣品也無法用于其后的反應。
為得到實時PCR方法中定量所需的DNA擴增曲線，必須對反應進行過程進行經(jīng)時追蹤以獲得反應樣品溶液中與DNA含量相關的信息，此時，為提高定量性、反應體系的穩(wěn)定性、測定裝置的簡易性等，優(yōu)選在整個反應過程中保持反應體系的同一性和同質(zhì)性，另外，還優(yōu)選盡量減少必需的反應樣品溶液量。
因此，期望不采用上述的簡單方法，而是使最初至最后的反應全過程在密閉的體系中進行，關于此問題，例如在專利文獻1及2中作為用于由熒光監(jiān)測DNA擴增的系統(tǒng)和方法，公開了可在監(jiān)測反應進程的同時迅速控制PCR樣品的裝置。
根據(jù)PCR方法的原理，可將PCR的1個全反應過程分為3個階段進行說明。即，作為目標的模板DNA解離為單鏈DNA的過程；此單鏈DNA與寡聚核苷酸(引物DNA)形成雙鏈結構的過程，該寡聚核苷酸具有可與從模板DNA中選擇的特定序列形成雙鏈的能力；以及以形成了雙鏈的引物DNA的末端部分作為起始點的DNA延長反應過程。通過使反應樣品溶液處于最適合各反應過程的溫度下來依次進行上述三階段的反應，也可將此溫度循環(huán)定義為PCR溫度循環(huán)。通過重復PCR溫度循環(huán)進行DNA的復制合成，使目標DNA以指數(shù)函數(shù)擴增。由此，由于PCR產(chǎn)物的擴增傾向特性與樣品中含有的DNA的最初量密切相關，因此優(yōu)選在每個PCR溫度循環(huán)中，反應達到平臺期(plateau)后進行測定。
關于此問題，例如，除了專利文獻1及2，還在專利文獻3中公開了一種裝置，該裝置可在使用空氣作為導熱介質(zhì)的快速熱循環(huán)中添加生物學樣品。
另外，在專利文獻4中公開了一種采用流式PCR的方法及裝置。
在采用通常方法的PCR中，反應樣品溶液被固定在1個反應容器內(nèi)，并處于經(jīng)時PCR溫度循環(huán)中。與此相反，在流式PCR方法中，反應樣品溶液在毛細管內(nèi)沿流路移動，并且，該毛細管被配置成沿流路與反復改變溫度的導熱作用體物理性接觸。即，通過使此毛細管沿流路與反復改變溫度的導熱作用體進行物理性接觸，使以限定流速在毛細管內(nèi)的空間中移動的反應樣品溶液基于移動所需的經(jīng)過時間被賦予PCR必須的溫度循環(huán)。
因此，在流式PCR中對反應樣品溶液賦予PCR溫度循環(huán)的方法與通常的方法不同，因此不能使用現(xiàn)有的PCR裝置來構造該裝置的基本結構。因此，期待提供一種可在產(chǎn)業(yè)中廉價使用、并且可信性高的流式PCR裝置。
為了使上述流式PCR之類將毛細管作為反應管的反應測定裝置具有緊湊結構，期望將反應管固定于任一種基板上，并且，希望將該類毛細管內(nèi)的反應體系與可通過光學檢測裝置直接觀察反應樣品溶液中含有物質(zhì)量的變化的檢測體系一同構成。
作為此類結構，在專利文獻5中公開了一種結構，該結構在盤狀基板上從該盤片中心呈放射狀地形成多條流路，通過旋轉(zhuǎn)該盤片使形成放射狀的多條流路依次在一個檢測系統(tǒng)中進行測定。
另外，專利文獻6中還公開了一種裝置及方法，該裝置用于在機器內(nèi)搭載的具有信息科學的超微量液體元件工學系統(tǒng)中，利用向心加速推進液體移動。
專利文獻1特表2000-512138號公報專利文獻2特表2000-509608號公報專利文獻3特表2000-511435號公報專利文獻4特開平6-30776號公報專利文獻5特表2003-149253號公報專利文獻6特表2002-503331號公報

發(fā)明內(nèi)容
如上述說明所述，在目前的PCR方法中，反應樣品溶液固定于1個反應容器中，處于經(jīng)時重復的PCR溫度循環(huán)內(nèi)。此時，在逐次經(jīng)時進行的反應過程中，反應初期階段觀察到的信息不能通過觀察進行至反應后期階段的同一反應體系來獲得。因此在目前的實時PCR方法中，關于反應進行過程中的反應樣品溶液中的DNA量的信息，是通過與該反應體系的進程同步發(fā)揮功能的檢測系統(tǒng)進行測定的。
通常，該類檢測系統(tǒng)中，預先在反應試樣溶液中混合可通過與雙鏈DNA結合而增大熒光強度的熒光色素，將其作為在PCR進行過程中直接或迅速地進行應答的檢測用試劑使用，相反，難以利用間接或緩慢應答的該類檢測用試劑。
另外，在PCR方法中，DNA在上述說明的每個PCR溫度循環(huán)中進行復制，為進行可忠實反映其擴增效率的測定，以適當?shù)臅r機檢測在PCR溫度循環(huán)中動態(tài)形成的雙鏈DNA-熒光色素復合物是很重要的。最佳時機根據(jù)樣品、模板DNA量、引物、溫度循環(huán)等PCR條件不同而各異，并且也根據(jù)每個PCR溫度循環(huán)不同而不同，但目前的PCR中，如上所述，由于采用逐次經(jīng)時進行的反應體系，因此無法將獲得的信息反饋至反應體系或檢測系統(tǒng)而加以利用。并且，也無法在反應進行后測定幾種不同的性質(zhì)。
上述專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3中公開的實時PCR的方法及裝置利用現(xiàn)有的PCR方法，不是從本質(zhì)上解決上述問題的技術。
與此相反，流式PCR的方法中，如上所述，反應樣品溶液在流路的空間中移動，基于移動所需的經(jīng)過時間賦予PCR溫度循環(huán)。此時，存在于從流路的起點至終點的各不同距離的反應樣品溶液，對應于其距離，成為PCR整個反應過程中從初期到后期的各個不同反應階段的反應樣品溶液。因此，通過在多個部位觀察穩(wěn)態(tài)移動的PCR反應樣品溶液，可以在同一時間觀察到在流路中進行的PCR反應過程。
通過利用在實時PCR中組合具有此類特征的流式PCR方法得到的流式實時PCR，不必利用能夠與該反應的進程同步發(fā)揮功能的檢測系統(tǒng)測定有關反應進行過程中反應樣品溶液中的DNA量的信息，可以消除如上述說明的缺點。
另外，在作為測定裝置使用時，當反應體系和檢測系統(tǒng)及連接它們的控制系統(tǒng)的任一功能在反應中出現(xiàn)故障時，不得不中斷操作，或在檢測系統(tǒng)出現(xiàn)故障的情況下進行溫度循環(huán)時，關于此期間反應的信息可能丟失而無法取回。另外，通常檢測系統(tǒng)的輸出和靈敏度會隨時間發(fā)生變化，因此當裝置開始工作時輸出和靈敏度的變化顯著，而裝置穩(wěn)定后其輸出和靈敏度也不能說完全沒有變化，輸出和靈敏度的漂移現(xiàn)象時常發(fā)生。
而通過流式實時PCR方法，可以同時連續(xù)進行需要比較的測定，可以省去由如上所述的裝置系統(tǒng)的故障引起的測定時間的浪費。
雖然在實時PCR中利用流式PCR方法的原理有很大優(yōu)點，但與此技術相關的報告較少，尤其是期望得到一種在流路中多個部位的正確位置上有效地測定關于沿流路移動的反應樣品溶液中DNA量的信息的技術，但目前仍然缺少用于該目的的現(xiàn)有技術。
上述專利文獻4中記述了可通過紫外線照射等檢測毛細管中反應的進行情況的方法，但是在毛細管的哪個部位進行測定、測定一個部位還是測定多個部位等等都沒有明確記載，也未公開需要測定反應的何種參數(shù)而如何解決。另外，專利文獻5中公開了一種利用一個檢測體系檢測多條流路的方法，但是，并未公開在多個部位測定同一流路的技術。另外，未形成適用于流式PCR方法的裝置。
另外，用于流式反應的裝置中，不能缺少用于產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)反應樣品液流的輸液系統(tǒng)，但為了實現(xiàn)測定裝置的緊湊化，不采用輸液泵等的裝置比較有利。
在上述專利文獻6中公開了在旋轉(zhuǎn)的盤狀基板上配置毛細管、為推動液體移動而使用向心加速的超微量液體元件工學系統(tǒng)的相關技術。但是，向心加速主要用于推進液體移動至反應液儲存處，未公開為了產(chǎn)生反應樣品溶液的穩(wěn)態(tài)液流而利用向心加速的技術。另外，也沒有記載沿流式反應的通路進行光學測定的方法，也未公開適用于利用向心加速的流式PCR的結構。另外，熱源配置于基板上。
因此，本發(fā)明的目的為提供一種方法或結構體，可在隨移動所需的經(jīng)過時間進行反應的流式反應中，在流路的多個測定點對反應樣品溶液狀態(tài)的變化進行同時連續(xù)、而且不間斷的光學測定；還提供一種可以更簡便并且更快速地進行追蹤反應進行過程的分析操作的核酸分析方法、分析裝置及分析用盤片。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的核酸分析方法的特征為，將含有核酸的分析樣品流過以重復模式改變溫度的流路，在上述流路的多個位置進行光學檢測。
通過本發(fā)明的核酸分析方法，可隨移動所需的經(jīng)過時間，改變以限定流速在流路內(nèi)移動的含有核酸的分析用樣品的溫度，并賦予反應樣品溶液必需的溫度循環(huán)。
另外，通過本發(fā)明的核酸分析方法，在上述流路中對含有核酸的分析用樣品進行PCR反應時，通過在上述流路的多個部位進行光學檢測，例如在流路的開始部分顯示PCR循環(huán)數(shù)較少的狀態(tài)的擴增狀態(tài)，在流路的結束部分顯示PCR循環(huán)數(shù)較多的狀態(tài)的擴增狀態(tài)，因此通過一次性在各個部位進行檢測，將該檢測結果作為利用一個樣品在PCR的經(jīng)時過程中的檢測結果，可以用一個樣品大致同時地檢測出DNA的擴增過程。
結果，即使在實時PCR之類需要正確獲得擴增傾向時，也不必沿反應過程進行經(jīng)時測定，也不需多個樣品。另外，因為同時進行檢測，所以使測定條件一定，可提高測定精度。另外，通過固定各循環(huán)的測定點，即使在未達到平臺期的狀態(tài)下，也可以固定各循環(huán)的條件，可正確地獲得擴增傾向。當然，通過預先求得到達各循環(huán)平臺期的位置，可以在各循環(huán)的測定點到達平臺期的狀態(tài)下進行測定，從而可以更正確地獲得擴增傾向。另外，也可以使用應答緩慢的試劑作為上述檢測用試劑，此時，在PCR結束時，可通過在該檢測用試劑的應答時間經(jīng)過后進行光學測定來獲得平臺期狀態(tài)的結果。
在本發(fā)明的分析方法中，上述含核酸的分析用樣品優(yōu)選包含DNA多聚酶、引物DNA、以及dNTP，可根據(jù)需要添加模板DNA、檢測物質(zhì)。由此，通過使在上述流路內(nèi)移動的該樣品通過以規(guī)定的重復模式進行溫度變化的流路，可順次賦予用于解離過程的高溫狀態(tài)、雙鏈形成過程及DNA延長反應過程適宜的低溫狀態(tài)、及PCR的溫度循環(huán)。另外，通過將微小的毛細管作為PCR的反應管，使導熱作用體和反應液的熱容量比充分增大，可以使反應液溫度迅速改變。
另外，在本發(fā)明的分析方法中，通過對在上述流路的多個部位生成的PCR產(chǎn)物進行光學檢測，可以獲得隨移動的經(jīng)過距離順次賦予的每個溫度循環(huán)的DNA量的相關信息。由此，可得到利用PCR合成的DNA的擴增曲線，另外，基于使用已知量的模板DNA繪制的對照標準曲線，可求得樣品中的DNA初始濃度。
另外，上述光學檢測優(yōu)選如下進行用光照射上述流路應檢測的部位，并檢測由照射光引發(fā)的透射光、反射光、或發(fā)射光。由此，可以采用比較簡單的裝置進行迅速的檢測。
另外，在上述多個部位的檢測優(yōu)選在上述分析用樣品通過上述溫度為非高溫部分的部位進行。由此，也可以使用例如嵌合劑(intercalator)等進行最適溫度為非高溫的檢測。
而且，上述流路至少部分具有鋸齒形(zigzag)圖案，優(yōu)選將該流路形成為能夠使從鋸齒形圖案的折返部至下一個折返部的流路通過不同的溫度區(qū)域。由此，容易形成通過區(qū)域，以便按規(guī)定的重復模式改變上述含有核酸的分析用樣品的溫度。
而且，優(yōu)選將上述流路形成在被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上，在盤片上形成同心狀的高溫區(qū)域和低溫區(qū)域，并形成上述鋸齒形圖案，使從折返部至下一個折返部的流路通過形成同心狀的上述高溫區(qū)域和上述低溫區(qū)域。由此，利用盤片旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力可使樣品流入流路，并且容易使該樣品沿流路反復通過低溫區(qū)域和高溫區(qū)域。
另外，優(yōu)選在上述盤片上設置信息記錄區(qū)域和樣品分析區(qū)域，利用上述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭?，在上述樣品分析區(qū)域中，設置上述流路以進行光學檢測。由此，可讀取記錄在信息記錄區(qū)域的信息，進行分析條件等的控制，另外，分析結果等也可記錄在信息記錄區(qū)域。
另外，優(yōu)選在隔著上述盤片而相對的方向分別對上述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭?、和對上述樣品分析區(qū)域進行光學檢測。由此，可以將對信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭氲难b置和對分析區(qū)域進行光學檢測的裝置設置在夾著盤片的正反兩側(cè)，容易構成裝置，而且作為對信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭氲难b置，可以采用已有的光信息記錄介質(zhì)的驅(qū)動器結構，可降低制造成本。
另一方面，本發(fā)明的核酸分析用裝置的特征為，該裝置具有以下部分使上述含有核酸的分析用樣品流過流路時，控制通過區(qū)域的溫度來以重復模式改變溫度的溫度控制裝置，及對在上述流路中流動的上述含有核酸的分析用樣品進行光學檢測的光學檢測裝置，并將該裝置構成為在上述流路的多個部位利用上述光學檢測裝置進行檢測。
通過本發(fā)明的核酸分析裝置，可如下所述地進行分析使含有核酸的分析用樣品流入流路，使之通過由上述溫度控制裝置形成的溫度控制區(qū)域，在上述流路的多個部位對在該流路中流動的含核酸的分析用樣品進行分析。
在本發(fā)明的核酸分析裝置中，上述光學檢測裝置優(yōu)選具有對上述流路的應檢測部位進行光照射的照射裝置、及檢測由照射的光產(chǎn)生的透射光、反射光、或發(fā)射光的受光裝置。由此，可以利用比較簡易的裝置進行迅速的檢測。
另外，優(yōu)選將該裝置構成為在上述含有核酸的分析用樣品通過上述非高溫部分的部位進行上述多個部位的檢測。由此，也可以使用例如嵌合劑(intercalator)等進行最適溫度并非高溫的檢測。
另外，上述裝置優(yōu)選構成為上述流路至少部分具有鋸齒形圖案，利用上述溫度控制裝置，使該鋸齒形圖案的折返部分至下一個折返部分的流路可通過由上述溫度控制裝置形成的溫度控制區(qū)域。由此，可以容易地形成通過區(qū)域，以規(guī)定的重復模式改變溫度。
另外，優(yōu)選將上述流路形成在被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上，且此盤片上高溫區(qū)域與低溫區(qū)域形成同心狀，上述鋸齒形圖案形成為使折返部分至下一個折返部分的流路通過形成同心狀的上述高溫區(qū)域與上述低溫區(qū)域。由此，可利用盤片旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力使樣品流入流路，并且容易沿流路反復形成低溫區(qū)域和高溫區(qū)域。
另外，優(yōu)選在上述盤片上設置信息記錄區(qū)域和樣品分析區(qū)域，在上述信息記錄區(qū)域，對向設置進行信息的讀取或?qū)懭氲墓庑畔⒂涗浗橘|(zhì)的讀取或?qū)懭胙b置，在上述樣品分析區(qū)域，對向設置對上述流路的規(guī)定部位進行光照射、及檢測該透射光、反射光、或發(fā)射光的上述光學檢測裝置。由此，可讀取信息記錄區(qū)域中記錄的信息，及控制分析條件等，還可將分析結果記錄在信息記錄區(qū)域。
另外，優(yōu)選將該裝置構成為使對上述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭搿⒓皩ι鲜鰳悠贩治鰠^(qū)域進行的光學檢測隔著上述盤片對向地進行。由此容易構成裝置，并可采用現(xiàn)有的光信息記錄介質(zhì)的驅(qū)動器結構作為對信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭氲难b置，以降低制造成本。
另外，本發(fā)明的核酸分析用盤片為，在被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上設置有進行信息讀取或?qū)懭氲男畔⒂涗泤^(qū)域、及形成了含核酸的分析用樣品流入的流路的樣品分析區(qū)域的核酸分析用盤片，其特征為，對上述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭氲姆较?，與對上述樣品分析區(qū)域進行光學檢測的方向形成為包夾上述盤片相對置的結構。
利用本發(fā)明的核酸分析用盤片，可以讀取記錄在信息記錄區(qū)域的信息，控制分析條件等，另外，可以將分析結果記錄在信息記錄區(qū)域。另外，對上述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭氲姆较颍c對上述樣品分析區(qū)域進行光學檢測的方向形成為包夾上述盤片相對向的結構，從而容易構成分析裝置。
在本發(fā)明的核酸分析用盤片中，優(yōu)選如下構成上述流路至少部分含有沿上述盤片的圓周方向行進的鋸齒形圖案，并通過配置于盤片外部的溫度控制裝置，沿位于上述鋸齒形圖案的圓周內(nèi)側(cè)的折返部的列或位于圓周外側(cè)的折返部的列的任意一方形成高溫區(qū)域，沿其它任意方向形成低溫區(qū)域。由此，可以利用盤片旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力使樣品流入流路，并可容易地沿流路反復形成低溫區(qū)域和高溫區(qū)域。
另外，在上述流路的一部分分別形成有供給用液體儲存部、及收容用液體儲存部，上述供給液體儲存部優(yōu)選設置在比上述收容用液體儲存部及具有上述鋸齒形圖案的流路更靠近圓周內(nèi)側(cè)的位置。由此，通過旋轉(zhuǎn)盤片時產(chǎn)生的離心力，可將從注入口注入上述供給用液體儲存部的樣品沿流路流動，并通過上述具有鋸齒形圖案的流路，流入上述收容用液體儲存部。
另外，上述信息記錄區(qū)域優(yōu)選具有光信息記錄介質(zhì)的記錄結構。由此，可采用現(xiàn)有的光信息記錄介質(zhì)的驅(qū)動器結構作為對信息記錄區(qū)域的信息進行讀取或?qū)懭氲难b置，以降低制造成本。
另外，上述信息記錄區(qū)域具有記錄層、及位于其背面?zhèn)鹊姆瓷鋵?，上述樣品分析區(qū)域具有上述流路、及位于其背面?zhèn)鹊姆瓷鋵?，相對于對應的反射層，?yōu)選使上述記錄層和上述流路位于相反一側(cè)。由此，讀取或?qū)懭胙b置和上述光學檢測裝置發(fā)出的光被對應的反射層反射，并可通過各自的裝置接收光，因此容易構成裝置。
另外，優(yōu)選將上述信息記錄區(qū)域設置于圓周內(nèi)側(cè)，將上述樣品分析區(qū)域設置于圓周外側(cè)。由此，可直接使用現(xiàn)有的光信息記錄介質(zhì)的驅(qū)動器。
另外，優(yōu)選在與上述信息記錄區(qū)域的預制溝(pre-groove)形成面相同的平面上形成上述流路的凹部，并且將該凹部的開口部分由密封部件進行密封以形成上述流路。由此，在盤片上形成預制溝時，可同時形成流路的凹部，從而簡化制造工序。
或者，上述盤片優(yōu)選具有基板及密封部件，該基板的一側(cè)表面上形成了上述信息記錄區(qū)域的預制溝、及記錄層、反射層，該密封部件直接或隔著保護層形成在此基板的上述反射層形成面上，并在此密封部件的內(nèi)面形成上述流路的凹部。由此，即使盤片基板的形狀相同，僅改變密封部件的形狀，即可改變流路的形狀，從而可以根據(jù)用途容易地制作多種分析用盤片。
或者，在上述樣品分析區(qū)域中，優(yōu)選設置通過上述光學檢測裝置記載了可讀取的信息的預制槽(pre-pit)或預制溝。由此，通過光學檢測裝置等對預制槽或預制溝進行讀取，例如可以對位樣品投入口或分析部位、可確認設置了多條流路時的流路編號、及檢測盤片旋轉(zhuǎn)速度等。
通過本發(fā)明，可取得流式反應流路保存反應過程的功能，并可以利用光學檢測系統(tǒng)對保存于流路內(nèi)的反應過程同時連續(xù)且持續(xù)地進行掃描，進行一次性測定。因此，不必采用通過在反應體系進行的同時發(fā)揮功能的檢測系統(tǒng)進行測定的方法，使多次光學測定成為可能，并可進行提高了精度或變更了光學條件的測定。
通過在核酸分析中利用本發(fā)明，可簡化PCR的動力學分析或反應開始時的模板DNA濃度的定量。即，通過縮短從光學測定開始至結束的時間，緩和對光學檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求。并且，可以利用一個光學檢測系統(tǒng)實現(xiàn)多個條件下的光學測定。而且，可使對PCR進程應答緩慢的檢測用試劑的使用成為可能，使檢測用試劑、光學測定的選擇更為靈活。
另外，在利用本發(fā)明的核酸分析用盤片時，由于在與基板的旋轉(zhuǎn)中心同中心的圓的圓周上存在一個連續(xù)流路上的多個測定點，因此可通過基板的旋轉(zhuǎn)，在該光學系統(tǒng)固定的情況下直接連續(xù)地測定在一個連續(xù)流路上的多個測定點。另外，通過基板的旋轉(zhuǎn)使光學檢測系統(tǒng)固定的定點觀察成為可能。
因此通過本發(fā)明，可直接利用現(xiàn)有光信息記錄介質(zhì)的驅(qū)動或檢測系統(tǒng)的部分結構，以構成用于實施上述方法的核酸分析裝置或核酸分析用盤片。


圖1為示出本發(fā)明的核酸分析方法中流路的例子的說明圖。
圖2為示出本發(fā)明的核酸分析方法中樣品檢測部位的例子的說明圖。
圖3為示出本發(fā)明核酸分析裝置的一個實施方案的簡要結構的說明圖。
圖4為示出本發(fā)明的核酸分析用盤片的一個實施方案的平面圖。
圖5為同一核酸分析用盤片的流路的放大說明圖。
圖6為示出同一核酸分析用盤片的截面結構的模式圖。
圖7為示出本發(fā)明的核酸分析裝置中使用的光學檢測裝置的例子的說明圖。
圖8為示出本發(fā)明的核酸分析裝置中使用的流路檢測裝置之一例的說明圖(a)和光學檢測元件97的正面觀察圖(b)。
圖9為示出本發(fā)明的核酸分析用盤片的其它例子的截面模式圖。
圖10為示出本發(fā)明的核酸分析用盤片其它例子的截面模式圖。
圖11為示出本發(fā)明的核酸分析用盤片其它例子的截面模式圖。
圖12為按制造工序示出本發(fā)明的核酸分析用盤片其它例子的說明圖。
圖13為按制造工序示出本發(fā)明的核酸分析用盤片其它例子的說明圖。
圖14為按制造工序示出本發(fā)明的核酸分析用盤片其它例子的說明圖。
圖15為示出在本發(fā)明的核酸分析用盤片中，設置預制槽信息的其它例子的說明圖。
圖16為示出在本發(fā)明的核酸分析用盤片中，設置伺服信號的其它例子的說明圖。
圖17為示出本發(fā)明的實施例中通過流式實時PCR擴增質(zhì)粒DNA的特定序列、測定得到的熒光強度結果的圖表。
附圖標記10流路10a、10b折返部分11注入口12供給用液體儲存部
13鋸齒形部分14收容用液體儲存部15空氣出口16測定點20、20a、20b、20c光學檢測裝置21光源22、23分光裝置24檢測器25分束器30分析裝置40旋轉(zhuǎn)裝置50、50a、50b、50c盤片51插通孔52信息記錄區(qū)域53樣品分析區(qū)域54基板55預制溝56凹部56a溝槽部57光吸收層58、58a反射層59頂涂層60密封部件61聚乙烯層疊層膜61a孔62預制槽63定位用伺服信號70溫度控制裝置71高溫加熱部
72低溫加熱部90流路的檢測裝置91激光光源92多重透鏡93半反射鏡95物鏡96聚光鏡97光學檢測元件101衍射光柵102主光束103衍射光束104消除濾鏡(cut-off filter)110讀取或?qū)懭胙b置120信息信號·視覺顯示文字A高溫區(qū)域B低溫區(qū)域C線L1、L2線具體實施方式
本發(fā)明中含核酸的分析用樣品中可混合通常的核酸分析用試劑。因此，為了通過上述PCR進行核酸分析，只要含有通常使用的PCR用試劑即可，具體為將下列成分在水溶液中混合用于擴增目的的模板DNA，特征為最適溫度為高溫的、作為合成與模板互補的DNA的酶的耐熱性DNA多聚酶，可與從上述模板DNA上選擇的2處特定序列分別形成雙鏈的2種引物DNA，以及作為DNA多聚酶底物的核苷酸。
另外，采用本發(fā)明中的核酸分析方法進行實時PCR時，作為含核酸的分析用樣品可進一步含有如下物質(zhì)通過與雙鏈DNA相結合增大熒光強度的色素(熒光色素)；或設計成在附近配置有色素·淬滅基團、利用DNA的延長反應引發(fā)色素·淬滅基團的離解的核酸探針；或為了通過供體色素與受體色素被分別加成而得到的兩種核酸探針在相鄰的區(qū)域發(fā)生雜交，以產(chǎn)生色素間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象而設計的核酸探針。與含核酸的分析用樣品相混合的熒光色素或核酸探針并無特別限制，可根據(jù)用途進行選擇。例如，作為熒光色素，可以舉出優(yōu)選使用的SYBR Green I(Molecular Probes)。另外，作為上述核酸探針，可以舉出優(yōu)選使用的具有隨機序列的TaqMan探針(Roche)、Hybridization Probes(Roche)等。利用本發(fā)明中的核酸分析方法進行定量的模板DNA的來源或堿基序列沒有特別限制，可采用從人類的血液、尿、唾液、精液、乳汁等中提取的物質(zhì)，并且也可為來源于人以外的生物的物質(zhì)。
混合于本發(fā)明中的含核酸的分析用樣品中的耐熱性DNA多聚酶并無特別限制，根據(jù)用途可使用各種耐熱性DNA多聚酶。例如當擴增的DNA不足3k堿基時，優(yōu)選使用作為標準的pol I型Taq DNA多聚酶的TaKaRa Taq(TaKaRa)、Gene Taq(NIPPONGENE)等。另外，進行正確的PCR時可以舉出優(yōu)選使用的α型DNA多聚酶的KODplus、Pfu DNA多聚酶、Pfu Turbo DNA多聚酶(TOYOBO)、PLATINUM Pfx DNA多聚酶(Invitrogen)、Pyrobest DNA多聚酶(TaKaRa)、ProofStart DNA多聚酶(Qiagen)、Pwo DNA多聚酶(Roche)、Advantage HF2(Clontech)等。另外，當擴增超過20k堿基的長鏈DNA時，可以使用通過一同使用Taq DNA多聚酶和具有3’→5’外切酶活性的耐熱性DNA聚合酶或使用緩沖液使富含GC的序列的擴增達到最佳化，使長鏈DNA的擴增成為可能的產(chǎn)品，可以舉出優(yōu)選使用的KOD Dash、EXL DNA多聚酶(TOYOBO)、Expand 20kbPCR System(Roche)、PLATINUM Taq DNA多聚酶High Fidelity、Elongase Enzyme Mix、ThermalAce DNA多聚酶(Invitrogen)、Advantage Genomic and-GC Genomic(Clontech)、TaKaRa LA Taqwith GC bufier(TaKaRa)等。
DNA的光學檢測方法可以使用下述的方法。
例1使用通過與雙鏈結合增強熒光的色素的方法PCR試劑可使用例如Roche Diagnostic社的PCR試劑盒(商品名“LC DNA Master SYBR Green I試劑盒”)。該試劑盒包含TaqDNA多聚酶、反應緩沖液、dNTP，并含有SYBRGreenI作為檢測試劑。該試劑盒為10倍濃縮，例如PCR溶液總量為20μl時加2μl即可。對于模板DNA，例如當PCR溶液的總量為20μl時其含量只要為10～100ng即可，將引物DNA調(diào)整至終濃度為0.1～1μM即可。另外，只要將引物DNA設計成能夠使PCR中的模板DNA內(nèi)的擴增區(qū)域在50～1000堿基之間即可。另外使用該試劑盒中附帶的MgCl2原液(stock)，調(diào)整MgCl2的濃度為1～5mM，最后溶液的總量以純水進行調(diào)節(jié)。
使用輸液裝置將上述配置的反應溶液輸送至流路中。流路和溫度設定優(yōu)選參照Kopp等的文獻(Science 280，1046-1048(1998))中所述的方法。輸液的最佳流速有時根據(jù)流路的內(nèi)徑等不同而各異，優(yōu)選用10秒～1分鐘通過1個溫度循環(huán)。
上述高溫區(qū)域的設定溫度，根據(jù)模板DNA的長度或序列不同而不同，通常數(shù)百堿基的模板DNA時加熱至90～99℃，優(yōu)選至92～97℃。另一方面，上述的2個低溫區(qū)域內(nèi)，一個低溫區(qū)域B1的設定溫度根據(jù)與引物DNA的離解溫度不同而不同，使用15～30堿基的引物DNA時為55～70℃。另一個低溫區(qū)域B2的設定溫度優(yōu)選設定在作為多聚酶的最適溫度的70℃～75℃。本發(fā)明中，上述高溫區(qū)域優(yōu)選如下形成通過在該流路的外部設置加熱裝置，使在流路內(nèi)移動的反應液能夠加熱至上述DNA的解離溫度或該溫度以上；上述低溫區(qū)域B1、B2優(yōu)選如下形成通過在該流路的外部設置溫度控制裝置，可以將在流路內(nèi)移動的反應液控制在上述DNA的解離溫度或該溫度以下。因此，通過各設定溫度的區(qū)域的時間之比優(yōu)選使高溫區(qū)域低溫區(qū)域的比值為1∶2～1∶3，低溫區(qū)域內(nèi)的2個溫度設定區(qū)域B1、B2的比值B1∶B2優(yōu)選為1∶2～1∶3。
以上述條件進行PCR后，可通過熒光測定進行檢測。激發(fā)波長優(yōu)選為SYBRGreenI具有吸收的波長，可使用LED(470nm)，也可使用棱鏡等從白色光源中分離，而檢測波長優(yōu)選為510～550nm。通過選擇熒光色素不僅可采用LED作為光源、還可采用青紫色LD(405nm)、紅色LD(635nm)等。
邊利用上述基板旋轉(zhuǎn)裝置旋轉(zhuǎn)基板，邊在流路上的測定點處照射激發(fā)光，通過使用檢測裝置檢測發(fā)出的熒光，可測定流路上PCR反應的過程。流路上的測定點只要為1個循環(huán)中的低溫區(qū)域即可，可以是任意位置。但測定優(yōu)選在全部循環(huán)結束后、從停止輸液開始將反應溶液培養(yǎng)至少與通過高溫區(qū)域-低溫區(qū)域的1個循環(huán)相同的時間。
例2TaqMan法試劑使用PCR用試劑盒(商品名“TaqMan Universal PCR MasterMixHybridization Probes試劑盒”；Roche Diagnostic社制)，使用TaqMan Probe作為檢測試劑，試劑的調(diào)制可通過試劑盒附帶的方法進行。反應條件與例1相同。檢測可通過熒光測定進行，具體可使用與例1同樣的方法進行檢測。另外，本例中可通過使用幾種序列和色素不同的TaqMan Probes同時進行多個反應，并進行檢測。結合于TaqMan Probes的色素可從公知的例如FAM、Cy3、Texas Red、Cy5中選擇，激發(fā)波長分別為450～495、500～550、565～590、630～650nm，檢測波長為510～527、565～590、606～650、670～750nm。激發(fā)光可使用對應各波長的LED，也可使用棱鏡等從白色光源中分離。在進行激發(fā)、檢測波長不同的多個測定時，可邊改變檢測系統(tǒng)的設定，邊多次進行下述檢測方法，即邊利用上述基板旋轉(zhuǎn)裝置旋轉(zhuǎn)基板，邊在流路上的測定點照射激發(fā)光，通過檢測裝置檢測發(fā)出的熒光。
在本發(fā)明的核酸分析方法中，使上述含有核酸的分析用樣品流入交替反復通過高溫區(qū)域和低溫區(qū)域的流路。作為此流路，可以例如圖1(a)所示采用以下結構沿鋸齒形形狀折返的流路10、及沿該流路10的一側(cè)折返部分10a的列設置的高溫區(qū)域A，和沿另一側(cè)折返部分10b的列設置的低溫區(qū)域B。但是，也可以如圖1(b)所示，在例如直線狀延伸的流路10處交替形成高溫區(qū)域A和低溫區(qū)域B。
此時，流路的高溫區(qū)域A優(yōu)選被設定為90～99℃。低溫區(qū)域B優(yōu)選設定為50～80℃，兩個溫度更加優(yōu)選設定為55～60℃、65℃～75℃。
流路也可進一步劃分為3個、4個或4個以上的溫度領域。
另外，流路也可通過溫度隨時間升降的區(qū)域以進行溫度循環(huán)。
通過使上述含有核酸的分析用樣品通過上述流路，在高溫區(qū)域發(fā)生雙鏈DNA的離解，在低溫區(qū)域中發(fā)生單鏈模板DNA和引物的結合及模板DNA和從引物的復合體的引物3’末端開始的由DNA多聚酶引發(fā)的延長反應。
因此，在上述流路的多個部位，例如圖2中沿著通過各循環(huán)的低溫區(qū)域B的線L1，利用光學檢測裝置20進行檢測，從而對上述流路內(nèi)的上述含有核酸的分析用樣品的反應進行過程進行連續(xù)檢測。
另外，圖2中沿著從上述流路的高溫區(qū)域A至低溫區(qū)域B、或從低溫區(qū)域B至高溫區(qū)域A移動的線L2，以規(guī)定間隔在多個部位利用光學檢測裝置20進行檢測，此時，流路內(nèi)的上述含有核酸的分析用樣品升至高溫的同時，可檢測到DNA離解的狀態(tài)，可以研究由PCR擴增的DNA的溫度曲線(profile)。
光學檢測系統(tǒng)優(yōu)選利用與普通的分光光度計、熒光光度計同樣的光學系統(tǒng)進行檢測，也可進一步舉出使用激光頭進行檢測的例子。作為光學系統(tǒng)的光源，可舉出例如氙燈或鹵素燈、及半導體激光等。而作為光學系統(tǒng)的受光器可舉出例如光電倍增管或CCD、光電二極管等。作為分光裝置可由棱鏡或濾鏡、光柵、狹縫、分束器、透鏡、反射鏡等構成。吸光度的測定可在測定點使光通過，也可使光反射。熒光的檢測只要在效率較好的任意位置配置受光器即可。渾濁度的測定基本上與吸光度的測定相同。
另外，優(yōu)選將樣品通過1個循環(huán)的高溫區(qū)域和低溫區(qū)域的時間調(diào)整至使各循環(huán)的反應均到達平臺期。此調(diào)整可通過改變樣品的流速、或流路的長度來進行。另外，也可監(jiān)測各循環(huán)中的反應狀態(tài)以控制上述樣品的流速。
通過使流路通過光學檢測系統(tǒng)的下方可對多個點進行檢測，因此可舉出移動形成該流路的毛細管或基板的方法和移動光學檢測系統(tǒng)的方法，可使用任一種或兩種方法。
該流路的移動裝置例如可舉出使用電動機與螺桿、或電動機與傳送帶的普通運送裝置。更加優(yōu)選通過旋轉(zhuǎn)流路使該多個點的測定成為可能，作為旋轉(zhuǎn)裝置例如可舉出在步進電動機、或光碟驅(qū)動器中采用的主軸馬達伺服(Spindle Servo)裝置。使用光碟驅(qū)動器的主軸馬達伺服裝置時，需要使用形成了用于進行伺服的導軌的基板。形成了該導軌的基板可與形成了流路的基板相同，也可不同。光學檢測系統(tǒng)通常難以移動，但是在極少的情況下也可利用普通的運送裝置進行移動，作為小型的光學檢測系統(tǒng)，可舉出優(yōu)選使用的光碟驅(qū)動器的激光頭。
本發(fā)明的核酸分析方法可利用于例如環(huán)境監(jiān)測、食品檢測、農(nóng)業(yè)檢測、法醫(yī)學、個人識別檢測、動物識別檢測等用途。
圖3為示出用于實施本發(fā)明的核酸分析方法的分析裝置之一例的簡略結構圖。如同圖(a)所示，此分析裝置30由下述部分構成旋轉(zhuǎn)裝置40，通過此旋轉(zhuǎn)裝置40被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片50，及配置于此盤片50上方、用于形成高溫區(qū)域和低溫區(qū)域的溫度控制裝置70，配置于上述盤片50下方的偏向內(nèi)周部分的光信息記錄介質(zhì)的讀取或?qū)懭胙b置110，及配置于上述盤片50上方的偏向外周部分的光學檢測裝置20。
如同圖(b)所示，溫度控制裝置70具有高溫加熱部71、及低溫加熱部72。高溫加熱部71和低溫加熱部72被配置成同心狀，使高溫加熱部71處于內(nèi)周、低溫加熱部72處于外周。作為溫度控制裝置70，優(yōu)選使用例如電熱絲、半導體式制冷元件(Peltier device)、燈管加熱器(lamp heater)等。
圖4中示出盤片50之一例。該盤片50的中心處具有旋轉(zhuǎn)軸的插通孔51，在圓周內(nèi)側(cè)設置有信息記錄區(qū)域52、在圓周外側(cè)設置有樣品分析區(qū)域53。在樣品分析區(qū)域53中形成多條流路10。在此實施方案中，將總計15條流路10配置成放射狀，各流路被賦予1～15的ID編號，確認此ID編號1～15，可對應各自的流路注入各樣品。另外，為了使光學檢測裝置20能夠識別上述多條流路的ID編號，使ID編號15的流路10和ID編號1的流路10的間隔大于其他的流路間隔。另外，盤片50被賦予了盤片識別編號120。
如圖5所示，各流路10具有以下部分設置在其一端的樣品注入口11，供給用液體儲存部12，沿盤片50的半徑方向、多次往返內(nèi)側(cè)和外側(cè)的鋸齒形部13，收容用液體儲存部14，及設置在另一端的空氣出口15。注入口11及供給用液體儲存部12與收容用液體儲存部14相比更靠近圓周內(nèi)側(cè)。另外，圖5中上述空氣出口15與樣品的注入口11被設置于同一圓周上，也可比注入口11更靠近內(nèi)側(cè)。
因此，當盤片50旋轉(zhuǎn)時，從注入口11注入到供給用液體儲存部12的樣品，在離心力的作用下流入流路10的鋸齒形部13，并流入收容用液體儲存部14。該流速可通過控制盤片50的旋轉(zhuǎn)速度或改變流路10的形狀進行調(diào)整。例如通過將流路10的鋸齒形部13的折返部分的截面積設定為比其他部分大，可以實現(xiàn)平穩(wěn)的流動，或者也可以將一部分設定為比其他部分窄，設定流動開始時的臨界值。因此上述高溫區(qū)域A、低溫區(qū)域B形成橫切上述鋸齒形部13的流路，相對于基板旋轉(zhuǎn)中心形成同心圓狀。
如圖6所示，盤片50具有聚碳酸酯等透明的基板54。該基板54上的信息記錄區(qū)域52中形成有預制溝55，在樣品分析區(qū)域53中形成有流路10的凹部56。并且，在形成了預制溝55及凹部56的基板54的表面上，形成了由含有機色素的感光色素膜構成的光吸收層57。并且，在此光吸收層57上形成了由Au等金屬構成的反射層58。并且，在信息記錄區(qū)域52的整個面、與樣品分析區(qū)域53的凹部56以外的部分形成由紫外線固化性樹脂等構成的頂涂層59。最后，使用由聚乙烯膜等構成的密封部件60進行被覆，封閉凹部56，形成流路10。
在上述盤片50中，信息記錄區(qū)域52具有光信息記錄介質(zhì)的記錄結構，通過配置于盤片50下方的讀取或?qū)懭胙b置110進行信息的讀取或?qū)懭?。另外，在樣品分析區(qū)域53的流路10內(nèi)流動的樣品由光學檢測裝置20進行檢測。因此，信息記錄區(qū)域52的讀取、寫入方向，與樣品分析區(qū)域53的光學檢測方向位于隔著反射層58的相對側(cè)，從而使讀取或?qū)懭胙b置110及光學檢測裝置20的配置變得容易，作為讀取或?qū)懭胙b置110，可使用公知的光信息記錄介質(zhì)的驅(qū)動器結構，可降低制造成本。
如圖7示出光學檢測裝置20的各種例子。同圖(a)的光學檢測裝置20a中形成了如下結構光源21發(fā)出的光經(jīng)由分光裝置22從盤片50的一側(cè)對流路10的測定點16進行照射，透過至盤片50的相反面的透射光經(jīng)由分光裝置23于檢測器24處被接收。
同圖(b)的光學檢測裝置20b形成了如下結構從配置于盤片50的一側(cè)的光源21，通過分光裝置22、分束器25，對流路10的測定點16進行光照射，被形成在流路10的背面?zhèn)鹊姆瓷鋵?8反射的光，經(jīng)分束器25以直角方向射出，通過分光裝置23于檢測器24處被接收。
同圖(c)的光學檢測裝置20c形成了如下結構從配置于盤片50的一側(cè)的光源21，通過分光裝置22，對流路10的測定點16進行光照射，樣品中的特定成分接受光照而發(fā)光，此發(fā)射光通過分光裝置23于檢測器24處被接收。
圖8(a)示出流路的檢測裝置90之一例。該流路的檢測裝置90中，通過激光驅(qū)動電路(圖中未顯示)從635nm波長的激光光源91發(fā)射激光，該激光通過多重透鏡92、半反射鏡93、準直儀(圖中未顯示)，進一步通過物鏡95，對流路(圖中未顯示)的測定點16處進行照射。流路中的分析用樣品溶液中添加有經(jīng)熒光色素Cy5修飾的TaqMan探針，因此當模板DNA存在時，利用635nm的激光可產(chǎn)生670～750nm的熒光。因此，被設置于流路的背面?zhèn)鹊姆瓷鋵?圖中未顯示)反射的635nm的原始激光和由流路產(chǎn)生的670～750nm的熒光，通過物鏡95、準直儀(圖中未顯示)導入半反射鏡93中，在半反射鏡93處90度反射后，在衍射光柵101處使相位一致的635nm的原始激光分成多束，通過聚光透鏡96在光學檢測元件97處聚光。
圖8(b)中示出在光學檢測元件97上成像的主光束102及經(jīng)衍射光柵101衍射得到的衍射光束103的像。主光束的像由原始的635nm的激光和670～750nm的熒光的混合光成像而成。而衍射光束只由原始的635nm的激光本身成像而成。在主光束成像的位置，于光學檢測元件前面配置有不允許650nm或650nm以下波長的光通過的消除濾鏡104，因此可在主光束成像的點處檢測熒光本身的光量。
因此，將由光學檢測元件97得到的主光束·衍射光束的光量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，通過放大電路(圖中未顯示)放大后，以主光束發(fā)出的信號測定熒光量，并利用衍射光束發(fā)出的信號進行焦點跟蹤(focustracking)等伺服操作。
利用如上所述的核酸分析裝置30，在盤片50的各流路10的注入口11處注入含有核酸的分析用樣品，儲存在供給用液體儲存部12后，通過旋轉(zhuǎn)裝置40旋轉(zhuǎn)盤片50，使樣品從供給用液體儲存部12流入流路10，使樣品流過鋸齒形部13。此時，使樣品反復通過利用溫度控制裝置70形成的高溫區(qū)域A和低溫區(qū)域B，以實現(xiàn)PCR對DNA的擴增。
另外，最初流入流路10的樣品到達收容用液體儲存部14時，利用光學檢測裝置20，沿盤片50周圍的線C(參照圖4)進行DNA檢測。光學檢測裝置20在每個經(jīng)過高溫區(qū)域A和低溫區(qū)域B的循環(huán)中，在低溫區(qū)域B的特定部位進行DNA檢測，利用未圖示的計算機，基于該值求得各測定點的DNA濃度。
結果可求出經(jīng)過高溫區(qū)域A和低溫區(qū)域B的循環(huán)重疊時的DNA擴增曲線。此擴增曲線中，作為檢測對象的DNA樣品中的初期濃度越高曲線上升越快，因此通過分析上述擴增曲線，可求得樣品中目標DNA的初期濃度，能夠定量目標DNA。
另外，讀取或?qū)懭胙b置110讀取記載于信息記錄區(qū)域52內(nèi)的信息，正確地推算樣品的注入口11的位置，或結合用光學檢測裝置20得到的檢測值與對應的流路10的ID編號，有助于監(jiān)測流路10的各測定點的測定值，計算盤片50的最佳轉(zhuǎn)速，并將控制信號傳送至旋轉(zhuǎn)裝置40。另外，每個流路10的樣品結束DNA定量后，可將該結果寫入信息記錄區(qū)域52。
另外，利用此分析裝置，通過在樣品流入流路10、并流入收容用溶液儲存部14的時刻進行檢測，可一次性測定每循環(huán)中的DNA濃度，從而可有效地進行測定操作。
圖9示出本發(fā)明中使用的核酸分析用盤片的其它例子。
該盤片50a具有聚碳酸酯等構成的透明基板54。該基板54上的信息記錄區(qū)域52中形成有預制溝55，在樣品分析區(qū)域53中形成有流路10的凹部56。并且，在形成預制溝55及凹部56的基板54的表面上，形成了由含有機色素的感光色素膜構成的光吸收層57。并且，在信息記錄區(qū)域52中，在此光吸收層57上形成了由Au等金屬構成的反射層58，在此反射層58上形成頂涂層59。而在樣品分析區(qū)域53中，使用由聚乙烯膜等構成的密封部件60進行被覆，封閉凹部56，形成流路10。另外，在樣品分析區(qū)域53的基板54的反面?zhèn)刃纬煞瓷鋵?8a在上述盤片50a中，信息記錄區(qū)域52具有光信息記錄介質(zhì)的記錄結構，通過配置于盤片50a下方的讀取或?qū)懭胙b置110進行信息的讀取或?qū)懭搿Ａ硗?，流入樣品分析區(qū)域53的流路10的樣品由光學檢測裝置20進行檢測。因此，信息記錄區(qū)域52的讀取、寫入方向與樣品分析區(qū)域53的光學檢測方向在隔著反射層58的相對側(cè)，使讀取或?qū)懭胙b置110及光學檢測裝置20的配置變得容易。
圖10中示出本發(fā)明使用的核酸分析用盤片的其他例子。
該盤片50b，在透明基板54的幾乎整個表面上形成預制溝55，在形成該預制溝55的表面上形成由含有機色素的感光色素膜構成的光吸收層57。然后，在光吸收層57上形成反射層58。在該反射層58上通過絲網(wǎng)印刷形成具有溝槽部56a的頂涂層59。再在其上被覆由聚乙烯膜等構成的密封部件60，封閉溝槽部56a形成流路10。另外，在反射層58與頂涂層59之間以旋涂法使保護反射層58的保護膜(圖中未顯示)成膜。
通過該盤片50b，隔著反射層58，在下方形成信息記錄區(qū)域52，在上方形成樣品分析區(qū)域53，從而可擴大信息記錄區(qū)域52。另外，只改變形成絲網(wǎng)(screen)的流路圖案即可改變樣品分析區(qū)域53的流路10的形狀，可降低成本。
圖11中示出本發(fā)明使用的核酸分析用盤片的其他例子。
該盤片50c，在透明基板54的幾乎整個表面上形成預制溝55，在形成該預制溝55的表面上形成由含有機色素的感光色素膜構成的光吸收層57。然后，在此光吸收層57上形成反射層58，在反射層58上形成頂涂層59。另一方面，制備經(jīng)疊層轉(zhuǎn)印或壓紋(emboss)加工等形成了凹部56的由聚乙烯膜等構成的密封部件60。將此密封部件60熱封在頂涂層59上，形成流路10。
利用該盤片50c，隔著反射層58，在下方形成信息記錄區(qū)域52，在上方形成樣品分析區(qū)域53，因此可擴大信息記錄區(qū)域52。另外，只改變在密封部件60的下面形成的凹部56就可以改變樣品分析區(qū)域53的流路10的形狀。圖12中一并示出本發(fā)明中使用的核酸分析用盤片的其它例子及其制造步驟。圖中左側(cè)為制造步驟，右側(cè)為盤片的截面模式圖。
首先，與上述圖6所示的例子相同，在基板54的一側(cè)表面形成預制溝55及凹部56，在其上形成光吸收層57(步驟S1)。
然后，陰極真空噴鍍Au，形成反射層58(步驟S2)。
然后，在信息記錄區(qū)域52上進行絲網(wǎng)印刷形成頂涂層59(步驟S3)，并通過紫外線照射進行固化(步驟S4)。
然后，在PET膜的內(nèi)側(cè)面被覆聚乙烯層經(jīng)疊層而成的聚乙烯層疊層膜61，進行熱封(步驟S5)。結果封閉凹部56的開口，形成流路10。另外，在聚乙烯層疊層膜61上形成注入口等孔61a。作為上述疊層膜，也可使用聚碳酸酯膜等。
圖13中一并示出本發(fā)明中使用的核酸分析用盤片的其它例子及其制造步驟。圖中左側(cè)為制造步驟，右側(cè)為盤片的截面模式圖。
首先，與上述圖10及圖11所示的例子相同，在基板54的整個表面形成預制溝55，在其上形成光吸收層57(步驟S1)。
然后，陰極真空噴鍍Au，形成反射層58(步驟S2)。
然后，進行絲網(wǎng)印刷形成頂涂層59(步驟S3)，并通過紫外線照射進行固化(步驟S4)。此時利用未涂布頂涂層59的部分形成流路10的凹部56。
然后，在頂涂層59上被覆與上述相同的聚乙烯層疊層膜61，進行熱封(步驟S5)。結果封閉凹部56的開口形成流路10。另外，在聚乙烯層疊層膜61上形成注入口等孔61a。
圖14中一并示出本發(fā)明中使用的核酸分析用盤片的其它例子及其制造步驟。圖中左側(cè)為制造步驟，右側(cè)為盤片的截面模式圖。
首先，與上述圖10及圖11所示的例子相同，在基板54的整個表面形成預制溝55，在其上形成光吸收層57(步驟S1)。
然后，陰極真空噴鍍Au，形成反射層58(步驟S2)。
然后，在信息記錄區(qū)域52上進行絲網(wǎng)印刷形成頂涂層59(步驟S3)，并通過紫外線照射進行固化(步驟S4)。
然后，在樣品分析區(qū)域53上被覆與上述相同的聚乙烯層疊層膜61，進行熱封(步驟S5)。此時在聚乙烯層疊層膜61的內(nèi)側(cè)面形成凹部56，通過將聚乙烯層疊層膜61熱封，形成流路10。另外，在聚乙烯層疊層膜61上形成注入口等孔61a。
圖15示出作為在本發(fā)明中使用的核酸分析用盤片的其他例子，是在形成流路10的樣品分析區(qū)域53中，賦予預制槽信息的例子。該預制槽62可以和流路10重疊，也可以不重疊，預制槽62的列并非螺旋狀，而是以同心圓狀設置有多個相同信號的軌道。
通過設置該類預制槽信息，可將光學檢測裝置20發(fā)出的激光頭的焦點跟蹤等伺服、或流路信息(每個流路的截面構造·折返次數(shù)·注入體積等信息)、注意事項等傳送至驅(qū)動器。
另外，可在流路形成工序內(nèi)同時形成條形碼信息，通過與該流路信息整合，可以進行雙檢驗(double check)。
另外，也可以設置預制溝以代替預制槽62。
圖16中示出作為本發(fā)明使用的核酸分析用盤片的其它例子，是在每個流路10內(nèi)設置定位用伺服信號63的例子。該定位用伺服信號63可在形成流路10的工序內(nèi)同時形成。定位用伺服信號63可通過光耦合器等進行讀取。
下面舉出實施例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明的范圍并不局限于這些實施例。
上述圖4及圖16所示的盤片在下述條件下進行制造。
利用噴射成形法成形厚度為1.2mm、外徑120mmφ、內(nèi)徑15mmφ的聚碳酸酯形成的基板54，其中，盤片的直徑從46mm到76mm，在其表面形成有寬0.8μm、深0.08μm、間距1.6μm的螺旋狀數(shù)據(jù)記錄用預制溝55，在其外周部分形成了圖4、圖16所示的流路10及信息信號·視覺顯示文字120。該聚碳酸酯形成的基板54的洛氏硬度ASTM D785等同于M75鉛筆硬度HB，熱變形溫度ASTM D648為4.6kg/cm2、121℃。
作為用于形成光吸收層57的有機色素，將0.65g 1，1’-二丁基-3，3，3’，3’-四甲基-4，5，4’，5’-二苯并靚二羰菁高氯酸鹽(dibenzoindo dicarbocyanine perchlorate)(日本感光色素研究所制，產(chǎn)品編號NK3219)，溶解于10cc二丙酮醇溶劑中，采用旋涂法將其涂布在上述基板54的表面，形成由膜厚為130nm的感光色素膜構成的光吸收層57。由此光吸收層57的復數(shù)折射率的實數(shù)部nabs和該膜厚dabs與再生光的波長λ得到的ρ＝nabsdabs/λ為0.45，另外上述復數(shù)折射率的虛部kabs為0.05。
然后，在該盤片的直徑45～118mmφ的整個區(qū)域內(nèi)以陰極真空噴鍍法形成膜厚80nm的Au膜，形成反射層58。在此反射層58上，在盤片的直徑從40mm到80mm的區(qū)域內(nèi)對紫外線固化性樹脂進行絲網(wǎng)印刷，并使其經(jīng)紫外線照射而固化，形成膜厚為10μm的頂涂層59。該頂涂層59固化后的洛氏硬度ASTM D785為M90，熱變形溫度ASTM D648為4.6kg/cm2、135℃。而且，在該頂涂層59和反射層58上，在140℃下熱封聚乙烯層疊層膜61，該疊層膜61由50μm透明PET膜構成，該PET膜帶有切割成環(huán)狀的層厚為30μm的聚乙烯層，從而形成在內(nèi)周部具有采用激光的信息記錄區(qū)域(CD-R區(qū)域)52、在外周部具有流路10等的樣品分析區(qū)域53的混合型盤片。
下面，說明上述檢測用流路10的形狀。該檢測用流路在上述盤片的噴射成形時，利用在金屬模型中形成的高50μm的凸部而形成在該盤片的外周部。利用該凸部形成的該檢測用流路具有以下部分樣品的注入口11，供給用液體儲存部12，沿盤片50的半徑方向多次往返于內(nèi)側(cè)和外側(cè)的鋸齒形部(反應用鋸齒形流路)13，收容用液體儲存部14，在另一端設置的空氣出口15。該流路10的寬度及深度均為50μm。樣品的注入口11及空氣出口15形成在盤片的半徑為33mm的同一圓周上，形成直徑400μm的圓形形狀。供給用液體儲存部12及收容用液體儲存部14均形成直徑10mm的圓形形狀，供給用液體儲存部12的中心形成在上述基板的半徑40mm處，而收容用液體儲存部14的中心形成在上述基板的半徑53mm處。而鋸齒形部13的中心位于上述基板的半徑53mm處，形成在縱10mm(半徑方向)、橫6.5mm(圓周方向)的長方形范圍內(nèi)。鋸齒形部13的流路10也由與上述相同形狀的溝槽構成，在該長方形的范圍內(nèi)形成縱向往返30.5。在直徑120mm的上述盤片的同一圓周上，每旋轉(zhuǎn)22.5°形成一條流路，共計形成15條。其中，流路10之間的1個部位分離45°，由此可以利用光學檢測裝置20識別流路10的ID。
然后，說明上述檢測用流路的上述反應用鋸齒形流路的溫度分布。利用與上述基板成同心圓的內(nèi)徑98mm、外徑110mm的環(huán)狀紅外線加熱器，將該環(huán)狀紅外線加熱器正下方的區(qū)域加熱至65℃。另外，利用與上述基板成同心圓的內(nèi)徑110mm、外徑116mm的環(huán)狀紅外線加熱器，將該環(huán)狀紅外線加熱器正下方的區(qū)域加熱至95℃。存在與上述兩個環(huán)狀紅外線加熱器正下方的區(qū)域包含形成該反應用鋸齒形流路的上述長方形范圍。
本實施例中說明用于在上述檢測用流路中進行反應的試劑溶液。
反應試劑多聚酶(0.05unit/μl TaqDNA多聚酶(商品名“ExTaq多聚酶”，反應緩沖液(商品名“2×ExTaq緩沖液”(均為TaKaRa社制))，PCR基液(1μM正向引物(GENEST社制)，1μM反向引物(GENEST社制)、0.4mM dNTP)，模板DNA(10ng/μl質(zhì)粒pUC(Promega社制))，熒光色素溶液(0.05μg/ml SYBR Green I(Molecular Probes社制))。
引物序列正向引物序列編號1反向引物序列編號2使用吸液管將4μl上述反應試劑(40ng模板DNA)從上述樣品注入口11注入，將該反應試劑充填至上述供給用液體儲存部12中。然后，通過上述兩個環(huán)狀紅外線加熱器將上述兩個環(huán)狀紅外線加熱器正下方的區(qū)域加熱至65℃及95℃。另外，為將充填在供給用液體儲存部12的該反應樣品試劑輸液并通過上述鋸齒形部13，而使上述基板旋轉(zhuǎn)，施加離心力。使上述基板的轉(zhuǎn)速為2500rpm，由此使該反應試劑用20秒通過鋸齒形部13的1個往返部分(流速約1mm每秒)。
以2500rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)20分鐘后，停止該基板30秒。此后，以500rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)該基板，利用上述光學檢測系統(tǒng)測定鋸齒形部13的流路10在每一個往返中的熒光強度。
另外，為進行比較，也對從上述反應試劑中除去模板DNA、或?qū)⒛０錎NA濃度稀釋100倍時進行同樣的測定。
圖17為熒光強度和鋸齒形部的往返次數(shù)之間的關系曲線。此結果由與作為定量目標物質(zhì)的模板DNA的量(0、0.4、40ng)密切相關的DNA擴增曲線獲得。
另外，一般的流體流速和上述基板的轉(zhuǎn)速之間的關系用下述公式1表示。
u＝dH2ρω2rΔr/32ηL上述公式1中的符號含義如下。
u流速dH液壓直徑ρ密度ω角速度r平均半徑Δr流路的起點和終點的半徑差η粘度L流路總長如上所述，液壓直徑為適應矩形流路的流體參數(shù)，可用下述公式2求得。
dH＝2wd/(w+d)上述公式2中的符號含義如下。
w流路寬度d流路深度由此測定的結果在圖17中示出。
序列編號1用于擴增質(zhì)粒pUC上的特定序列的PCR用DNA正向引物。
序列編號2用于擴增質(zhì)粒pUC上的特定序列的PCR用DNA反向引物。
產(chǎn)業(yè)可利用性根據(jù)本發(fā)明，可提供一種核酸分析方法，該方法利用流式反應的分析測定原理，使追蹤反應進行過程的分析操作更為簡單和快捷，另外，還提供一種核酸分析裝置及分析用盤片，其緊湊地具有檢測系統(tǒng)、反應系統(tǒng)、輸出系統(tǒng)、驅(qū)動系統(tǒng)，并可以廉價地進行制造。
序列表<110>太陽誘電株式會社<120>核酸分析方法、分析裝置及分析用盤片<130>JP03-0148<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>質(zhì)粒pUC<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>PCR引物<400>1cgccagggtt ttcccagtca cgac<210>2<211>24<212>DNA<213>質(zhì)粒pUC<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>PCR引物<400>2cagtgggagg tccttgaagg caat
權利要求
1.一種核酸分析方法，其特征為，使含有核酸的分析用樣品流入溫度以重復模式改變的流路，在所述流路的多個部位進行光學檢測。
2.如權利要求1所述的核酸分析方法，其特征為，所述含有核酸的分析用樣品是含有DNA多聚酶、引物DNA、及dNTP的樣品，或含有作為任選成分的模板DNA或檢測物質(zhì)的樣品。
3.如權利要求1或2所述的核酸分析方法，其特征為，所述光學檢測如下進行對所述流路的應檢測部位進行光照射，并檢測由照射光產(chǎn)生的透射光、反射光、或發(fā)射光。
4.如權利要求1～3任一項所述的核酸分析方法，其特征為，所述多個部位的檢測在所述含有核酸的分析用樣品通過非高溫部分的位置進行。
5.如權利要求1～4任一項所述的核酸分析方法，其特征為，所述流路如下形成至少部分具有鋸齒形圖案，從該鋸齒形圖案的折返部分至下一個折返部分的流路通過溫度不同的區(qū)域。
6.如權利要求5所述的核酸分析方法，其特征為，所述流路在被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上形成，在該盤片上形成同心狀的高溫區(qū)域和低溫區(qū)域，所述鋸齒形圖案形成為從折返部分至下一個折返部分的流路通過了形成同心狀的所述高溫區(qū)域和所述低溫區(qū)域，利用所述盤片旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，將流入上述流路中的含有核酸的分析用樣品進行輸送。
7.如權利要求6所述的核酸分析方法，其特征為，所述盤片上設置有信息記錄區(qū)域和樣品分析區(qū)域，利用所述信息記錄區(qū)域，進行信息的讀取或?qū)懭?，并在所述樣品分析區(qū)域內(nèi)設置所述流路，進行光學檢測。
8.如權利要求7所述的核酸分析方法，其特征為，對所述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭爰皩λ鰳悠贩治鰠^(qū)域進行的光學檢測，分別在隔著所述盤片的相對方向上進行。
9.一種核酸分析裝置，其特征為具有以下部分流入含有核酸的分析用樣品的流路、控制裝置、及檢測裝置，所述控制裝置用于在所述含有核酸的分析用樣品流入所述流路時，控制通過區(qū)域的溫度使所述含有核酸的分析用樣品的溫度以重復模式改變，所述檢測裝置對流入所述流路的所述含有核酸的分析用樣品進行光學檢測，該裝置構成為可使利用所述光學檢測裝置進行的檢測在所述流路的多個部位進行。
10.如權利要求9所述的核酸分析裝置，其特征為，所述光學檢測裝置具有以下部分對所述流路的應檢測部位進行光照射的發(fā)射裝置，及對照射光產(chǎn)生的透射光、反射光、或發(fā)射光進行檢測的受光裝置。
11.如權利要求9或10所述的核酸分析裝置，其特征為，該裝置構成為可使所述多個部位的檢測在所述含有核酸的分析用樣品通過所述非高溫部分的位置進行。
12.如權利要求9～11的任一項所述的核酸分析裝置，其特征為該裝置構成為所述流路至少部分具有鋸齒形圖案，從該鋸齒形圖案的折返部分至下一個折返部分的流路，通過由所述溫度控制裝置形成的溫度控制區(qū)域。
13.如權利要求12所述的核酸分析裝置，其特征為將該裝置構成為所述流路形成在旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上，在此盤片上形成同心狀的高溫區(qū)域和低溫區(qū)域，所述鋸齒形圖案形成為從折返部分至下一個折返部分的流路通過形成同心狀的所述高溫區(qū)域和所述低溫區(qū)域，并利用所述盤片旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，對流入上述流路中的含有核酸的分析用樣品進行輸送。
14.如權利要求13所述的核酸分析裝置，其特征為，在所述盤片上設置有信息記錄區(qū)域、及樣品分析區(qū)域，在所述信息記錄區(qū)域設置有進行信息的讀取或?qū)懭氲墓庑畔⒂涗浗橘|(zhì)用讀取或?qū)懭胙b置，在所述樣品分析區(qū)域設置有對所述流路的規(guī)定部位進行光照射、并對其透射光、反射光、或發(fā)射光進行檢測的所述光學檢測裝置。
15.如權利要求14所述的核酸分析裝置，其特征為，將所述裝置構成為對所述信息記錄區(qū)域進行信息的讀取或?qū)懭?、與對所述樣品分析區(qū)域進行的光學檢測隔著所述盤片在相對的方向上進行。
16.一種核酸分析用盤片，是在被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上設置有進行信息讀取或?qū)懭氲男畔⒂涗泤^(qū)域、及形成了流過含有核酸的分析用樣品的流路的樣品分析區(qū)域的核酸分析用盤片，其特征為，該盤片被構成為使對所述信息記錄區(qū)域進行信息讀取或?qū)懭氲姆较?、與對所述樣品分析區(qū)域進行光學檢測的方向隔著所述盤片相對向。
17.如權利要求16所述的核酸分析用盤片，其特征為，所述流路至少部分具有鋸齒形圖案，該鋸齒形圖案邊鋸齒狀彎曲前進，邊沿所述盤片的圓周方向行進。
18.如權利要求16或17所述的核酸分析用盤片，其特征為，所述流路的一部分上分別形成有供給用液體儲存部、及收容用液體儲存部，所述供給用液體儲存部比所述收容用液體儲存部及具有所述鋸齒形圖案的流路更靠近圓周內(nèi)側(cè)。
19.如權利要求16～18任一項所述的核酸分析用盤片，其特征為，所述信息記錄區(qū)域具有光信息記錄介質(zhì)的記錄結構。
20.如權利要求16～19任一項所述的核酸分析用盤片，其特征為，所述信息記錄區(qū)域具有記錄層、及位于其背面?zhèn)鹊姆瓷鋵?，所述樣品分析區(qū)域具有所述流路、及位于其背面?zhèn)鹊姆瓷鋵?，相對于對應的反射層，所述記錄層和所述流路分別位于反向側(cè)。
21.如權利要求16～20任一項所述的核酸分析用盤片，其特征為，所述信息記錄區(qū)域設置在圓周內(nèi)側(cè)，所述樣品分析區(qū)域設置在圓周外側(cè)。
22.如權利要求16～21任一項所述的核酸分析用盤片，其特征為，在與所述信息記錄區(qū)域的預制溝形成面相同的平面上形成所述流路的凹部，以密封部件封閉該凹部的開口部，形成所述流路。
23.如權利要求16～21任一項所述的核酸分析用盤片，其特征為所述盤片具有下述結構在一側(cè)表面形成了所述信息記錄區(qū)域的預制溝、記錄層、反射層的基板，及在該基板的反射層形成面上直接或通過保護層形成的密封部件，該密封部件的內(nèi)側(cè)面形成有所述流路的凹部。
24.如權利要求16～23任一項所述的核酸分析用盤片，其特征為，在所述樣品分析區(qū)域中，設置有記錄了可通過所述光學檢測裝置讀取的信息的預制槽或預制溝。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可在隨移動所需的經(jīng)過時間進行反應的流式反應中，在流路的多個測定點同時連續(xù)、且不間斷地對反應樣品的狀態(tài)變化進行光學測定的方法或結構體。使含有核酸的分析用樣品流入流路，利用控制通過區(qū)域溫度的溫度控制裝置使該流路的溫度以重復模式改變，在流路中流動的含有核酸的分析用樣品的狀態(tài)變化，在流路的多個部位利用光學檢測裝置進行檢測。該流路可設置于被旋轉(zhuǎn)驅(qū)動的盤片上的樣品分析區(qū)域，并可利用相對地設置在該核酸分析用盤片上的光信息檢測裝置對流路內(nèi)反應樣品溶液的信息進行同時連續(xù)且不間斷地檢測。還可提供一種緊湊型核酸分析用裝置，在該結構體的結構中具有含核酸的分析用樣品的流式反應管與光學檢測裝置。
文檔編號B01L7/00GK1680814SQ20051006451
公開日2005年10月12日 申請日期2005年4月11日 優(yōu)先權日2004年4月9日
發(fā)明者楸原直人, 石黑隆 申請人:太陽誘電株式會社