專利名稱：依普利酮原料或其制劑中雜質(zhì)和含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品的檢測(cè)方法，具體地說是采用高效液相色譜法對(duì)依普利酮原料或其制劑中的雜質(zhì)和含量的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明中所述依普利酮的藥品名稱為通用名依普利酮英文名Eplerenone漢語拼音Yipulitong化學(xué)名稱9α，11-環(huán)氧-7α-(甲氧酰基)-3-氧-17α-孕甾-4-烯-21，17-羰內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式 分子式C24H30O6分子量414.49近年來高血壓病的發(fā)病率逐年上升，歐美一些國家約為20％。高血壓是冠心病、腦猝、心力衰竭、腎衰竭最主要的發(fā)病因素，并且其與糖、脂代謝紊亂密切相關(guān)。依普利酮可降低高血壓人群的血壓水平，可有效地控制心、腦血管病的發(fā)生率。
高血壓病的治療藥物隨著對(duì)高血壓病認(rèn)識(shí)的深入而不斷發(fā)展，現(xiàn)在已形成6大類利尿藥、β-受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、α-受體阻滯劑和血管緊張素受體抑制劑。如何選擇和合理應(yīng)用降壓藥物，近幾年有較大進(jìn)展。
醛固酮可不依賴于A-T二和升高的血壓而獨(dú)立地在高血壓和其他心血管疾病中引起損害。作為一個(gè)非選擇性的醛固酮受體阻斷劑，螺內(nèi)酯可以有效地抑制醛固酮的這些不利作用，但同時(shí)也具有許多不良反應(yīng)，如男性乳腺發(fā)育、陽痿和女性月經(jīng)紊亂等。依普利酮對(duì)醛固酮受體具有選擇性，對(duì)雄激素和孕激素受體親和力低。
高血壓在大多數(shù)國家中是一個(gè)重要的健康問題，它牽涉到20％的成年人。1991年普查顯示，我國高血壓患病率已達(dá)11.26％，較1979-1980年10年間增高25％，即90年代初，我國已有高血壓患者9500萬。據(jù)1996年調(diào)查，這種升高的勢(shì)頭仍在持續(xù)。目前統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國現(xiàn)有的高血壓患者已達(dá)1.2億，每年新增300萬以上。1998年我國腦血管病居城市居民死亡原因第二位，在農(nóng)村居首位。按年死亡率每10萬人口分別為138和113，全國每年死亡超過100萬，存活的患者500-600萬，其中75％以上留有不同程度的殘廢，造成個(gè)人、家庭、社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)。國內(nèi)外大量研究已證明，高血壓是腦猝中的主要危險(xiǎn)因素。80年代以來，高血壓病及由其引起的一系列心血管疾病已引起人們的高度重視，開發(fā)、研制各種新型降壓藥已成為國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)的主要課題。目前全球市場(chǎng)上已有100多種降壓藥，新的藥物仍在不斷開發(fā)。當(dāng)前抗高血壓藥物仍主要需要解決下面三個(gè)問題一是效果，包括降壓、穩(wěn)定血壓和保護(hù)靶器官少受損傷；二是病人的依從性，包括使用方便、不良反應(yīng)少、病人的生活質(zhì)量不受影響；三是經(jīng)濟(jì)問題，要求抗高血壓的治療使病人和社會(huì)均能承受。
上世紀(jì)80年代問世的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和90年代出現(xiàn)的沙坦類藥物是目前使用較廣泛的兩類抗高血壓藥物。它們主要作用于腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)中的血管緊張素的生成和作用的發(fā)揮，發(fā)揮抗高血壓作用。但是，目前的研究發(fā)現(xiàn)血漿中醛固酮與高血壓后期的器官損傷有著密切的關(guān)系，即使在醛固酮的水平在正常范圍內(nèi)也是如此。因此，抑制醛固酮在體內(nèi)在生物學(xué)活性對(duì)于提高高血壓病人的生活質(zhì)量和生存期都有著重要意義。依普利酮的發(fā)明對(duì)于達(dá)到這一目的起到了很好的開端。
依普利酮是一種口服高選擇性醛固酮受體拮抗劑，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制醛固酮與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合，拮抗醛固酮與上皮(如腎臟)和非上皮(如心臟、血管和腦)組織中的鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合。醛固酮通過與鹽皮質(zhì)激素受體的結(jié)合誘導(dǎo)腎臟對(duì)鈉離子的重吸性以及還有其它可能的機(jī)制升高血壓。因此依普利酮的主要藥效表現(xiàn)為減少Na+及液體潴留而降低血壓。依普利酮在體外與受體(雄激素受體、黃體酮受體、糖皮質(zhì)激素受體)的結(jié)合活性較螺內(nèi)酯弱。該品對(duì)其它受體基本無影響。
依普利酮對(duì)輕到中度高血壓具有良好的療效，病人的耐受性好。在2003年，美國FDA又批準(zhǔn)了依普利酮治療急性心肌梗死后充血性心力衰竭的新適應(yīng)癥，臨床研究證實(shí)依普利酮對(duì)于改善急性心肌梗死后左心室收縮功能異常(心臟射血分?jǐn)?shù)≤40％)和有充血性心力衰竭臨床依據(jù)的穩(wěn)定病人的生存率有著很好作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，為了保證依普利酮原料或其制劑中的雜質(zhì)和含量測(cè)定的檢測(cè)水平，加強(qiáng)依普利酮原料或其制劑的質(zhì)量控制，提供一種靈敏度高、分析速度快、準(zhǔn)確度高的依普利酮原料或制劑中雜質(zhì)和有效成份的高效液相色譜法檢測(cè)方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的的具體測(cè)試方法如下依普利酮原料或其制劑的雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟如下A、取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.05～20mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含0.5～200ug的對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液；B、色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和乙腈為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈的混合比為65∶35，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm，理論板數(shù)按依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；C、取對(duì)照溶液5～100ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～20％；D、再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5～100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2～5倍；按自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)。
依普利酮原料或制劑的含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟如下A、取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.025～10mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和和乙腈按65∶35的混合溶液；B、按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和乙腈為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈的混合比為65∶35，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm，理論板數(shù)按依普利酮峰計(jì)算不低于3000；
C、取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5～100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以依普利酮峰面積計(jì)算本品的含量。
所述流動(dòng)相為甲醇和0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)的混合溶液，混合比為40∶60。
所述流動(dòng)相為甲醇和0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)的混合溶液，混合比為40∶60。
本發(fā)明測(cè)試方法的建立過程是這樣的。
1、儀器與試劑儀器島津SPD-10Avp檢測(cè)器，島津LC-10ATvp泵及浙江大學(xué)N2000色譜工作站。
FA1104型電子天平PHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)色譜柱Discovery C18柱，規(guī)格250×4.6mm，粒度5um試劑乙腈為MR、磷酸二氫銨為AR試劑；蒸餾水自制。
2、有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的建立(1)波長(zhǎng)的選擇取依普利酮樣品及各中間體適量，加流動(dòng)相使溶解，并稀釋成約10μg/ml，在200～400nm范圍內(nèi)對(duì)本品進(jìn)行掃描，由掃描結(jié)果可見，本品在244nm波長(zhǎng)處有最大吸收，結(jié)合中間體的掃描圖譜，我們選擇使用244nm波長(zhǎng)作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的波長(zhǎng)。
(2)流動(dòng)相的選擇以乙腈-水為基本配比，調(diào)節(jié)乙腈與水的比例使得主峰保留時(shí)間適中，再通過加入適當(dāng)?shù)木彌_鹽調(diào)節(jié)峰形，使得到理想狀態(tài)。
流動(dòng)相的選擇

由上表結(jié)果可見，以乙腈和各濃度的磷酸二氫銨溶液(35∶65)作為流動(dòng)相，保留時(shí)間和峰型均較好，因緩沖鹽濃度高對(duì)色譜柱損傷較大，故選擇乙腈-0.01mol/L磷酸二氫銨(35∶65)作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的流動(dòng)相。
(3)分離度試驗(yàn)取依普利酮合成過程中的中間體及依普利酮樣品，加流動(dòng)相溶解并稀釋，制成一定濃度的溶液，作為樣品溶液。分別取上述各溶液進(jìn)樣，考察各自的保留時(shí)間。再分別取上述溶液適量混合，搖勻后取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察其分離度。結(jié)果中間體及依普利酮的分離度符合要求(4)系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗(yàn)①破壞性試驗(yàn)分別取依普利酮樣品約10mg及其制劑適量(約含依普利酮10mg)，分別置100ml量瓶中，按下述各條件配制供試品。
未破壞加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，常溫避光放置4小時(shí)備用；酸破壞加0.1mol/L的鹽酸溶液2ml，混勻后常溫避光放置4小時(shí)，4小時(shí)后加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液2ml中和，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，備用；堿破壞加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液2ml，混勻后常溫避光放置4小時(shí)，4小時(shí)后加0.1mol/L的鹽酸溶液2ml中和，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，備用；光照破壞加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，置強(qiáng)光下(4500Lx)照射4小時(shí)，備用；高溫破壞加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，置沸水浴中加熱4小時(shí)，4小時(shí)后放冷，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，備用；氧化破壞加30％雙氧水2ml，混勻后常溫遮光放置4小時(shí)，4小時(shí)后加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。
分別取上述溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，與未破壞樣品比較，結(jié)果在破壞條件下依普利酮峰和各有關(guān)物質(zhì)峰能夠很好的分離，說明在選定色譜條件下可以檢測(cè)出可能存在的有關(guān)物質(zhì)。
②檢測(cè)限、定量限的測(cè)定取對(duì)照品適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測(cè)定，按10∶1信噪比作為定量限，結(jié)果為10ng；按3∶1信噪比為檢測(cè)限，結(jié)果為3ng。
3、含量測(cè)定方法的建立(1)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取對(duì)照品約25mg置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別取1、3、5、7、10ml置50ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別取20μl進(jìn)樣。記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度(C)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。
結(jié)果表明濃度在10.2～102.2μg/ml范圍內(nèi)，依普利酮色譜峰面積與其濃度成良好線性關(guān)系。
依普利酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)進(jìn)樣精密度取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下中間濃度(5ml)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，考察進(jìn)樣精密度。
依普利酮進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果

由結(jié)果可見，RSD小于2.0％，表明進(jìn)樣精密度良好。
(4)理論板數(shù)的測(cè)定取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下中間濃度(5ml)溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察其理論板數(shù)，經(jīng)測(cè)定，理論板數(shù)為n＝3168.620。
(5)重復(fù)性試驗(yàn)精密取依普利酮樣品約25mg及其制劑適量(約含依普利酮25mg)各六份，照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定上述樣品的含量，分別計(jì)算RSD值，考察重復(fù)性。
結(jié)果表明，原料和制劑重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0％，重復(fù)性符合規(guī)定。
(6)中間精密度試驗(yàn)按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，在不同日期內(nèi)，不同的試驗(yàn)人員，使用相同一批的依普利酮樣品及其制劑，在不同的儀器上測(cè)定其含量，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，考察其中間精密度情況。
結(jié)果表明，原料和制劑中間精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0％，中間精密度良好。
(7)制劑回收率試驗(yàn)稱取依普利酮原料，按處方量的80％、100％、120％投料，制備含主藥為80％、100％、120％的制劑，分別取各處方項(xiàng)下制劑，照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，測(cè)定主藥依普利酮的含量。
結(jié)果表明，回收率為98.7％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，制劑準(zhǔn)確性試驗(yàn)良好。
通過上述方法的建立過程，本品的有關(guān)物質(zhì)檢查采用HPLC法，通過中間體測(cè)定及破壞性試驗(yàn)，結(jié)果表明本品的中間體及破壞后的降解產(chǎn)物峰可被檢出，并與主峰有較好的分離度。根據(jù)本品檢查結(jié)果，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況，確定本品有關(guān)物質(zhì)總量應(yīng)小于1.0％，單個(gè)雜質(zhì)量應(yīng)小于0.5％。另外通過高效液相色譜法對(duì)本品含量測(cè)定結(jié)果表明，回收率為98.7％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，證明本法可作為本品含量測(cè)定方法。


圖1依普利酮雜質(zhì)檢測(cè)對(duì)照溶液HPLC圖譜，圖2依普利酮雜質(zhì)檢測(cè)樣品溶液HPLC圖譜，圖3依普利酮含量測(cè)定樣品溶液HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。
按以下檢測(cè)方法對(duì)依普利酮原料或其制劑各三批中雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定實(shí)施例1取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含0.5ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液100ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10～20％。
再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。見表1，圖1，圖2。
表1依普利酮原料或其制劑雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例2取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.1mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含1ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取對(duì)照液20ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10～20％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。見表2，圖1，圖2。
表2依普利酮原料或其制劑雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果


實(shí)施例3取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含20mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含200ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，依普利酮峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定取對(duì)照液5ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10～20％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的5倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一，見表3，圖1，圖2。
表3依普利酮原料或其制劑雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例4取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含0.5ug的對(duì)照溶液。流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液100ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10～20％。
再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。見表1，圖1，圖2。
實(shí)施例5取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.1mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含1ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取對(duì)照液20ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10～20％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。見表2，圖1，圖2。
實(shí)施例6取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含20mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含200ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，依普利酮峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定取對(duì)照液5ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10～20％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的5倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一，見表3，圖1，圖2。
按以下檢測(cè)方法對(duì)依普利酮原料或其制劑各三批中含量進(jìn)行測(cè)定實(shí)施例7取依普利酮原料或其制劑以及對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.025mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見表4。
表4依普利酮原料或其制劑含量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例8取依普利酮原料或其制劑以及對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見表5。
表5依普利酮原料或其制劑含量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例9取依普利酮原料或其制劑以及對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含10mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見表6。
表6依普利酮原料或其制劑含量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例10取依普利酮原料或其制劑以及對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.025mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照品溶液。流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-甲醇(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244mm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見表4。
實(shí)施例11取依普利酮原料或其制劑以及對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-甲醇(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見表5。
實(shí)施例12取依普利酮原料或其制劑以及對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含10mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄V D)試驗(yàn)，以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液-甲醇(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，理論板數(shù)以依普利酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，依普利酮峰與各有關(guān)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見表6。
上述方法方便快捷，能夠準(zhǔn)確測(cè)定依普利酮原料或其制劑的雜質(zhì)和含量。但本發(fā)明專利的保護(hù)內(nèi)容并不僅僅局限于上述具體實(shí)施實(shí)例中所闡述的方法，任何在本發(fā)明所述方法的基礎(chǔ)上所做的改進(jìn)及提高均屬于本發(fā)明專利的保護(hù)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.依普利酮原料或其制劑的雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于具體操作步驟如下A、取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.05～20mg依普利酮的供試品溶液和每1ml中含0.5～200ug的對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按65∶35的混合溶液；B、色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和乙腈為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈的混合比為65∶35，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為2.44nm，理論板數(shù)按依普利酮峰計(jì)算不低于3000，依普利酮峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；C、取對(duì)照溶液5～100ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～20％；D、再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5～100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2～5倍；按自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)。
2.依普利酮原料或制劑的含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于具體操作步驟如下A、取依普利酮原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.025～10mg依普利酮的供試品溶液和對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和和乙腈按65∶35的混合溶液；B、按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和乙腈為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈的混合比為65∶35，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm，理論板數(shù)按依普利酮峰計(jì)算不低于3000；C、取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5～100ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以依普利酮峰面積計(jì)算本品的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依普利酮原料或制劑中雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，其特征在于所述流動(dòng)相為甲醇和0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)的混合溶液，混合比為40∶60。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的依普利酮原料或制劑含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，其特征在于所述流動(dòng)相為甲醇和0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)的混合溶液，混合比為40∶60。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種依普利酮原料或其制劑的雜質(zhì)和含量的高效液相色譜法測(cè)定方法。該方法的色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用磷酸二氫銨溶液－甲醇或磷酸二氫銨溶液－乙腈的混合溶液；采用紫外檢測(cè)器，雜質(zhì)測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm；含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm；該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能很好地檢測(cè)依普利酮原料或其制劑的雜質(zhì)和含量。為生產(chǎn)進(jìn)程中的質(zhì)量控制分析提供了簡(jiǎn)單可靠的方法。
文檔編號(hào)B01J20/281GK1932505SQ20061009605
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者石慶平, 崔愛軍, 郭輝 申請(qǐng)人:石慶平