專利名稱：：膜分離與工業(yè)色譜分離聯(lián)用提取分離l-纈氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種L-纈氨酸的提取分離方法，尤其涉及一種利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取L-纈氨酸的方法。屬于生物化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：L-纈氨酸作為支鏈氨基酸之一，系人體必須氨基酸，具有多種生理功能。因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在人類生命代謝中占特別重要的地位，主要用以配制復(fù)合氨基酸輸液、合成多肽藥物和食品抗氧化劑等，尤其是在醫(yī)學(xué)研究和治療中的作用，日益受到重視。它在血腦屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及腎功能衰竭的治療，先天性代謝缺陷病的膳食治療，敗血癥及術(shù)后糖尿病患者的治療，加快外科創(chuàng)傷愈合，腫瘤患者的營(yíng)養(yǎng)支持治療中應(yīng)用廣泛。因此，在醫(yī)藥和食品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用及商業(yè)價(jià)值。L-纈氨酸的生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法由于原料來(lái)源受限制，生產(chǎn)成本高，污染環(huán)境，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。自1956年日本協(xié)和發(fā)酵公司用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸以后，氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展很快，到目前為止，絕大多數(shù)氨基酸已能用發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是目前生產(chǎn)L-纈氨酸最主要的方法。目前，L-纈氨酸的提取普遍采用離子交換工藝。該工藝的一般過(guò)程為發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體、采用該工藝從發(fā)酵液中分離提取L-纈氨酸存在以下問(wèn)題一是采用過(guò)濾的方法去除菌體，由于菌體細(xì)小，通常菌體去除不徹底；二是L-纈氨酸發(fā)酵液色值比較高，普通活性炭脫色不完全并且用量大，影響產(chǎn)品質(zhì)量和收率；三是L-纈氨酸發(fā)酵液中雜質(zhì)成分多、含量高，直接使用離子交換法處理，樹(shù)脂污染嚴(yán)重，容易引起樹(shù)脂結(jié)構(gòu)破環(huán)而失去再生能力，增加了運(yùn)行成本，同時(shí)高含量的離子性物質(zhì)會(huì)使樹(shù)脂快速飽和，增加樹(shù)脂再生次數(shù)，造成污水排放量大等問(wèn)題。國(guó)內(nèi)L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)提取方法基本沿用上述方法，個(gè)別工序進(jìn)行了調(diào)整，但未從根本上解決L-纈氨酸提取過(guò)程中發(fā)酵液雜質(zhì)去除不徹底、離子交換樹(shù)脂污染嚴(yán)重、L-纈氨酸提取收率低、L-纈氨酸產(chǎn)品純度低等問(wèn)題。上述L-纈氨酸提取工藝是二十世紀(jì)八十年代建立起來(lái)的。隨著生化分離技術(shù)的進(jìn)步，各種先進(jìn)的分離設(shè)備和工藝在生產(chǎn)中發(fā)揮越來(lái)越大的作用，特別是膜分離技術(shù)和工業(yè)色譜分離技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使各種生化分離工藝大為改觀。3膜分離技術(shù)用于發(fā)酵產(chǎn)品的分離精制已有成功的先例，但利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取L-異亮氨酸，還未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取L-纈氨酸的方法，該方法具有條件溫和、操作簡(jiǎn)便、分離步驟少、選擇性好，清潔生產(chǎn)環(huán)保的特點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的收率不高、污水排量大及生產(chǎn)強(qiáng)度大的缺點(diǎn)，并且使L-纈氨酸的收率和質(zhì)量顯著提高。本發(fā)明的技術(shù)方案基本步驟是首先將發(fā)酵液利用孔徑0.1-0.6pm的微孔濾膜去除菌體，得到發(fā)酵清液經(jīng)工業(yè)色譜柱分離無(wú)機(jī)鹽及部分雜酸，再用納濾膜去除色素和小分子雜質(zhì)，得到的澄清淡黃色的L-纈氨酸溶液，經(jīng)過(guò)RO反滲透膜預(yù)濃縮、結(jié)晶等步驟制得粗品，粗品經(jīng)精制后得到高純度的L-纈氨酸產(chǎn)品。一種利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中提取分離L-纈氨酸的方法，由以下步驟組成(1)發(fā)酵液超濾除菌體將發(fā)酵液通過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量10萬(wàn)-100萬(wàn)D的0.1-0.6^im微孔濾膜，徹底去除發(fā)酵液中的菌體，得到L-纈氨酸發(fā)酵清液，操作壓力為0.3-0.8MPa，操作溫度為10-60°C，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料發(fā)酵液體積的10%-90%;(2)工業(yè)色譜分離將步驟(1)得到的L-纈氨酸發(fā)酵清液預(yù)濃縮至固含物3%-6%，上工業(yè)色譜柱，用l-3倍發(fā)酵清液體積的水做助推劑進(jìn)行分離，操作溫度20-5(TC去除無(wú)機(jī)鹽和發(fā)酵液中的雜酸，得到高純度的分離發(fā)酵清液；(3)納濾去除小分子蛋白雜質(zhì)及色素將步驟(2)得到的高純度分離后的L-纈氨酸清液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100-3000D的納濾膜去除色素和小分子蛋白雜質(zhì)，得到澄清無(wú)色的L-纈氨酸溶液，操作壓力為1.0-3.0MPa，操作溫度為10-60°C，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料清液體積的10%-90%;(4)發(fā)酵液反滲透膜預(yù)濃縮將步驟(3)得到澄清淡黃色的L-纈氨酸溶液通過(guò)反滲透膜濃縮，得到固含物為3%-7%的濃縮料液，操作壓力為0.5-2.0MPa，操作溫度為10-60°C，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料液體積的10%-90°/。；(5)以常規(guī)方法進(jìn)行濃縮、結(jié)晶得到L-纈氨酸粗品。步驟(1)所述發(fā)酵液超濾除菌體的操作溫度選用20-4(TC。步驟(2)所述的工業(yè)色譜分離，操作溫度選用20-40°C。步驟(3)所述的納濾，操作壓力選用1.0-2.0MPa，操作溫度選用20-40°C，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料清液體積的10%-50°/。。步驟(4)所述反滲透膜預(yù)濃縮，操作壓力選用0.5-1.5MPa,操作溫度選用20-40°C，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料液體積的10%-50%;得到固含物為3%-7%的濃縮料液。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明涉及的從發(fā)酵液中分離提取L-纈氨酸的方法，首次將膜分離技術(shù)引入發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的的分離提取，并根據(jù)發(fā)酵液中雜質(zhì)的粒度分布建立了一套多級(jí)膜分離體系，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的收率不高、污水排放量大及生產(chǎn)強(qiáng)度高的缺陷，使L-纈氨酸的收率和質(zhì)量顯著提高，生產(chǎn)成本降低。與現(xiàn)有工藝技術(shù)相比，利用本發(fā)明的方法所具有的優(yōu)越性如下1、本發(fā)明采用微濾膜過(guò)濾去除發(fā)酵液中的菌體，改變了常規(guī)壓濾機(jī)過(guò)濾的方法。經(jīng)微濾膜過(guò)濾去除菌體徹底，過(guò)濾清液澄清透明，還能去除大分子蛋白，除菌效果大大高于過(guò)濾法。2、本發(fā)明采用膜分離技術(shù)使L-纈氨酸發(fā)酵液中的離子性雜質(zhì)和色素含量大大降低。3、工業(yè)色譜分離技術(shù)替代了離子交換的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，以水作為助推劑,避免了離子交換再生，洗脫過(guò)程形成的大量廢水。發(fā)揮了清潔生產(chǎn)的功效。同時(shí)工業(yè)色譜的高效分離，能夠去除發(fā)酵液其他與纈氨酸具有相似化學(xué)物理性質(zhì)的氨基酸，產(chǎn)品的純度比傳統(tǒng)離子交換提取工藝的純度明顯提高。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1L-纈氨酸發(fā)酵液4L經(jīng)過(guò)截留分子量20萬(wàn)微濾膜過(guò)濾去除菌體，操作壓力0.3MPa，溫度3(TC，透析水量1L。濾液徹底去除菌體；然后經(jīng)1L的工業(yè)色譜柱分離，用水量5升，溫度3(TC，得到分離的纈氨酸清液。分離清液經(jīng)過(guò)截留分子量為500的鈉濾膜過(guò)濾去除小分子雜質(zhì)和色素，操作壓力1.2MPa，溫度30°C，透析水量1.5L，然后經(jīng)過(guò)RO反滲透膜預(yù)濃縮。結(jié)果見(jiàn)下表。T(640nm)體積(L)L-纈氨酸(g/L)收率(％)發(fā)酵液8.34.041.1100超濾膜濾液71.34.535.898.2工業(yè)色譜柱83.45.628.597.4鈉濾清液99.56.026.596.1RO膜99.14.137.293.6總收率93.6實(shí)施例2L-纈氨酸發(fā)酵液300L經(jīng)過(guò)截留分子量80萬(wàn)微濾膜過(guò)濾去除菌體，操作壓力0.35MPa，溫度30'C，透析水量90L。濾液徹底去除菌體；然后經(jīng)80L的工業(yè)色譜柱分離，用水量500升，溫度3(TC，得到分離的纈氨酸清液。分離清液經(jīng)過(guò)截留分子量為500的鈉濾膜過(guò)濾去除小分子雜質(zhì)和色素，操作壓力1.2MPa，5溫度3(TC,透析水量1.5L，然后經(jīng)過(guò)RO反滲透膜預(yù)濃縮。結(jié)果見(jiàn)下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例3L-纈氨酸發(fā)酵液4.5MS經(jīng)過(guò)截留分子量80萬(wàn)微濾膜過(guò)濾去除菌體，操作壓力0.4MPa，溫度30'C，透析水量1.5噸。濾液徹底去除菌體；然后經(jīng)80L的工業(yè)色譜柱分離，用水量7噸，溫度3(TC，得到分離的纈氨酸清液。分離清液經(jīng)過(guò)截留分子量為1000的鈉濾膜過(guò)濾去除小分子雜質(zhì)和色素，操作壓力1.2MPa，溫度3(TC，透析水量1.5L，然后經(jīng)過(guò)RO反滲透膜預(yù)濃縮。結(jié)果見(jiàn)下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4L-纈氨酸發(fā)酵液45.8M3經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)截留分子量80萬(wàn)微濾膜過(guò)濾去除菌體，操作壓力0.35MPa，溫度30°C，透析水量90L。濾液徹底去除菌體；然后經(jīng)80L的工業(yè)色譜柱分離，用水量700升，溫度30'C，得到分離的纈氨酸清液。分離清液經(jīng)過(guò)截留分子量為500的鈉濾膜過(guò)濾去除小分子雜質(zhì)和色素，操作壓力1.2MPa，溫度3(TC，透析水量1.5L，再經(jīng)過(guò)RO反滲透膜預(yù)濃縮。結(jié)果見(jiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中提取分離L-纈氨酸的方法，由以下步驟組成(1)發(fā)酵液超濾除菌體將發(fā)酵液通過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量10萬(wàn)-100萬(wàn)D的0.1-0.6μm微孔濾膜，徹底去除發(fā)酵液中的菌體，得到L-纈氨酸發(fā)酵清液，操作壓力為0.3-0.8MPa，操作溫度為10-60℃，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料發(fā)酵液體積的10％-90％；(2)工業(yè)色譜分離將步驟(1)得到的L-纈氨酸發(fā)酵清液預(yù)濃縮至固含物3％-6％，上工業(yè)色譜柱，用1-3倍發(fā)酵清液體積的水做助推劑進(jìn)行分離，操作溫度20-60℃去除無(wú)機(jī)鹽和發(fā)酵液中的雜酸，得到高純度的分離發(fā)酵清液；(3)納濾去除小分子蛋白雜質(zhì)及色素將步驟(2)得到的高純度分離后的L-纈氨酸清液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100-3000D的納濾膜去除色素和小分子蛋白雜質(zhì)，得到澄清無(wú)色的L-纈氨酸溶液，操作壓力為1.0-3.0MPa，操作溫度為10-60℃，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料清液體積的10％-90％；(4)發(fā)酵液反滲透膜預(yù)濃縮將步驟(3)得到澄清淡黃色的L-纈氨酸溶液通過(guò)反滲透膜濃縮，得到固含物為3％-7％的濃縮料液，操作壓力為0.5-2.0MPa，操作溫度為10-60℃，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料液體積的10％-90％；(5)以常規(guī)方法進(jìn)行濃縮、結(jié)晶得到L-纈氨酸粗品。2.如權(quán)利要求1所述的一種利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中提取分離L-纈氨酸的方法，其特征在于，步驟(1)所述發(fā)酵液微濾除菌體的操作溫度選用20-40'C。3.如權(quán)利要求1所述的一種利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中提取分離L-纈氨酸的方法，其特征在于，步驟(2)所述的工業(yè)色譜分離，以1-3倍發(fā)酵清液體積的水做助推劑，操作溫度選用20-40°C。4.如權(quán)利要求1所述的一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中提取分離L-纈氨酸的方法，其特征在于，步驟(3)所述的納濾，納濾膜用截留相對(duì)分子質(zhì)量為300-1000D，操作壓力選用1.0-2.0MPa，操作溫度選用20-40°C,透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料清液體積的10%-50%。5.如權(quán)利要求1所述的一種利用膜分離與工業(yè)色譜分離組合技術(shù)從發(fā)酵液中提取分離L-纈氨酸的方法，其特征在于，步驟(4)所述反滲透膜預(yù)濃縮，操作溫度選用20-40°C，透析水量以體積百分計(jì)占進(jìn)料液體積的10%-50%;得到固含物為3%-7%的濃縮料液。全文摘要膜分離與工業(yè)色譜分離聯(lián)用提取分離L-纈氨酸的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。本發(fā)明由(1)發(fā)酵液除菌體；(2)工業(yè)色譜高效分離無(wú)機(jī)鹽及其他氨基酸；(3)發(fā)酵液除雜質(zhì)及色素；(4)發(fā)酵液濃縮結(jié)晶等步驟組成。本發(fā)明方法具有條件溫和、操作簡(jiǎn)便、分離步驟少、選擇性好，清潔生產(chǎn)等特點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的收率不高、污水排量大及生產(chǎn)強(qiáng)度大的缺點(diǎn)，并且使L-纈氨酸的收率和質(zhì)量顯著提高。文檔編號(hào)B01D15/08GK101503366SQ20091002583公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月11日優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日發(fā)明者寧健飛,蔡立明申請(qǐng)人:無(wú)錫晶海氨基酸有限公司