專利名稱：核酸純化柱再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸純化柱再生的方法，尤其是一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用性強(qiáng)、便于普
及的核酸純化柱再生的方法。
背景技術(shù)：
核酸純化是分子生物學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)之一?，F(xiàn)有核酸純化方法通常分為以下三 種經(jīng)典的堿裂解以及酚仿抽提法；未改良的硅膠膜吸附法；商品純化柱法。由于經(jīng)典方法 的費(fèi)時(shí)以及未改良硅膠膜吸附法的局限性，使得簡(jiǎn)便、快捷的商品純化柱純化方法得到了 廣泛的應(yīng)用。然而，商品化核酸純化柱價(jià)格較高且只作為一次性耗材使用，不僅增加了實(shí)驗(yàn) 開(kāi)銷，廢棄的純化柱還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，具有潛在的危害性。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始探求 有效的核酸純化柱再生方法。目前，雖然已有關(guān)于核酸純化柱再生研究的報(bào)道，但是因其操 作復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用性不理想、不便于普及等，使用一次性核酸純化柱的污染與浪費(fèi)問(wèn)題仍得 不到有效解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用性強(qiáng)、 便于普及的核酸純化柱再生的方法。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種核酸純化柱再生的方法，其特征在于按如下步驟 進(jìn)行 a.將使用過(guò)的核酸純化柱與外部套管分開(kāi)，均置于3. 68M H2S04中煮沸10min，再 以無(wú)菌水沖洗純化柱與套管3次； b.組裝純化柱與套管，向純化柱中加700 iil無(wú)菌水，12000 Xg離心lmin，棄濾液， 重復(fù)此過(guò)程兩次； c.向硅膠膜中央加入40iU滅菌的2. 5mM， pH8. 5的Tris-HCL，室溫靜置lmin， 12000 Xg離心2min ; d.純化柱與外套管經(jīng)121。C高壓滅菌15min，60。C干燥，待用。
本發(fā)明充分利用了核酸在酸性條件下水解從而與核酸純化柱上的硅膠膜分離的 原理，達(dá)到消除純化柱上殘留核酸污染的目的。所用的水解試劑為一定濃度的分析純硫酸 溶液，Tris-HCL為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑，除此之外無(wú)需其它任何化學(xué)試劑，降低了再生利用的操 作成本，減小了對(duì)環(huán)境的污染；操作全過(guò)程只需要20分鐘左右，較已報(bào)道的其它再生方法 快速，大幅提高了工作效率，因此具有較強(qiáng)的應(yīng)用性，便于推廣普及等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)PCR、限制 酶切及核酸比色法對(duì)再生純化柱的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià)，未發(fā)現(xiàn)有核酸殘留污染，且能繼 續(xù)使用。檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)該技術(shù)再生的純化柱至少可再生利用6次。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例再生處理后純化柱濾液的PCR檢測(cè)圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例再生核酸純化柱用紫外分光比色法(A)與電泳(B)檢測(cè)再生 柱提取質(zhì)粒DNA的含量與質(zhì)量圖。 圖3是本發(fā)明實(shí)施例再生核酸純化柱用PCR檢測(cè)再生柱提取質(zhì)粒DNA的質(zhì)量圖。
圖4是本發(fā)明實(shí)施例再生核酸純化柱用限制酶切檢測(cè)再生柱提取質(zhì)粒DNA的質(zhì)量 圖。
具體實(shí)施例方式
a.將使用過(guò)的核酸純化柱與外部套管分開(kāi)，均置于3. 68M H2S04中煮沸l(wèi)Omin，再 以無(wú)菌水沖洗純化柱與套管3次； b.組裝純化柱與套管，向純化柱中加700 iil無(wú)菌水，12000 Xg離心lmin，棄濾液， 重復(fù)此過(guò)程兩次； c.向硅膠膜中央加入40iU滅菌的2. 5mM， pH8. 5的Tris-HCL，室溫靜置lmin， 12000 Xg離心2min ; d.純化柱與外套管經(jīng)12rC高壓滅菌15min，6(TC干燥，待用即可。 對(duì)本發(fā)明再生核酸純化柱過(guò)程所產(chǎn)生的濾液及再生核酸純化柱質(zhì)量檢測(cè)如下 1.對(duì)b步驟中產(chǎn)生的濾液進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系如下 模板(濾液)liU， EX Buffer (Mg2+Plus) 2. 5 ii 1 ， d證Mixture (each 2. 5mM) 2. 0 ii 1， 正向引物和反向引物各O. 5iil(10pmol/iil)， EX Taq 0. 14 ii 1 ，以水補(bǔ)至25 ii 1 。 反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min ;94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸30s，35個(gè)
循環(huán)；72t:延伸2min。反應(yīng)結(jié)束后，各取5 iU擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)
果如下如圖1所示。圖中Rl-R6分別表示再生處理的次數(shù)，M為Maker ;每次再生處理后隨
機(jī)取3只柱進(jìn)行檢測(cè)，以下均同。 2.核酸純化柱再生利用效果的檢測(cè) (1)凝膠電泳與分光光度計(jì)比色定量檢測(cè) 以新純化柱和經(jīng)不同再生次數(shù)的純化柱提取同批連接有外源DNA片段的質(zhì)粒，所 提取的質(zhì)粒DNA于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。同時(shí)，采用紫外分光光度計(jì)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)粒 DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，圖中New表示新柱，以下均同。
(2) PCR擴(kuò)增檢測(cè) 分別取新柱與再生柱提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢領(lǐng)"反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同上述對(duì)b 步驟中產(chǎn)生的濾液進(jìn)行PCR檢測(cè)(循環(huán)為30次)，結(jié)果如圖3所示。
(3)限制性雙酶切檢測(cè) 分別取新柱與再生柱提取的質(zhì)粒進(jìn)行限制性雙酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系包含10 iU質(zhì) 粒，4iU lOXBuffer， HindIII 1 ii 1， BamHIl ii 1，以水補(bǔ)至20 ii 1。 37。C，lh。對(duì)酶切產(chǎn)物 進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。
權(quán)利要求
一種核酸純化柱再生的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行a.將使用過(guò)的核酸純化柱與外部套管分開(kāi)，均置于3.68M H2SO4中煮沸10min，再以無(wú)菌水沖洗純化柱與套管3次；b.組裝純化柱與套管，向純化柱中加700μl無(wú)菌水，12000×g離心1min，棄濾液，重復(fù)此過(guò)程兩次；c.向硅膠膜中央加入40μl滅菌的2.5mM，pH8.5的Tris-HCL，室溫靜置1min，12000×g離心2min；d.純化柱與外套管經(jīng)121℃高壓滅菌15min，60℃干燥，待用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用性強(qiáng)、便于普及的核酸純化柱再生的方法，具體步驟是將使用過(guò)的核酸純化柱與外部套管分開(kāi)，均置于3.68M H2SO4中煮沸10min，再以無(wú)菌水沖洗純化柱與套管3次；組裝純化柱與套管，向純化柱中加700μl無(wú)菌水，12000×g離心1min，棄濾液，重復(fù)此過(guò)程兩次；向硅膠膜中央加入40μl滅菌的2.5mM，pH8.5的Tris-HCL，室溫靜置1min，12000×g離心2min；純化柱與外套管經(jīng)121℃高壓滅菌15min，60℃干燥，待用即可。
文檔編號(hào)B01D15/42GK101717421SQ20091022075
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者劉慶坤, 劉海映, 劉長(zhǎng)偉, 姜玉聲, 張劍誠(chéng), 李岑, 王吉橋, 郭雷蕾 申請(qǐng)人:大連水產(chǎn)學(xué)院