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      用于識別和定量分析被分析物,特別是真菌毒素的裝置和方法

      文檔序號:4990454閱讀:190來源:國知局
      專利名稱:用于識別和定量分析被分析物,特別是真菌毒素的裝置和方法
      用于識別和定量分析被分析物,特別是真菌毒素的裝置和
      方法本發(fā)明涉及一種用于識別(Nactweis)和定量分析被分析物的裝置和方法以及它們用于識別和定量分析真菌毒素的應用。在生物化學和醫(yī)學中,分析經(jīng)常是基于檢測以已知的量和位置存在的分子(分子探針)與待檢測的未知分子(分子的目標或靶分子)之間的相互作用。為了檢測該相互作用,探針(通常固定到載體上)和與樣品溶液中存在的靶分子接觸和在規(guī)定條件下培養(yǎng)。作為所述的培養(yǎng)的結(jié)果,在探針和目標之間發(fā)生了特異性的相互作用,其能夠以不同的方式探測。檢測是基于這樣的事實,即,靶分子僅僅會與特定的探針分子形成特異性結(jié)合。所述的結(jié)合明顯比靶分子與對于該靶分子來說不是特異性的探針的結(jié)合更穩(wěn)定。沒有特異性結(jié)合的靶分子可以通過清洗除去,而該特異性結(jié)合的靶分子通過探針得以保留。在現(xiàn)代的測定中,將多種探針以作為矩陣(陣列)的物質(zhì)庫形式以這樣的方式設(shè)置到載體上,即,樣品可以在多個探針上同時進行平行的分析(D. J. Lockhart, Ε. A. Winzeler, Genomics,gene expression and DNA arrays ;Nature 2000,405,827-836)。靶和它的探針之間的特異性相互作用因此可以基于人們所說的“標記物”,通過多種方法來進行,其通常取決于在該靶分子與探針所述的相互作用之前、之中或者之后所引入的標記物的類型。典型地,這樣的標記物是熒光基團,并因此特異性的靶分子-探針相互作用可以以熒光-光學方式,用比其他常規(guī)檢測方法,特別是質(zhì)量敏感方法更高的空間解析度和更少的花費來讀出(A. Marshall, J. Hodgson, DNA Chips =An array of possibilities, Nature Biotechnologyl998,16, 27-31 ;G. Ramsay, DNA Chips :State of the art, Nature Biotechnology 1998,16,40-44)。在本上下文中特別有利的是使用漸逝場生物芯片作為探針分子的載體。漸逝場生物芯片包含光波導,其能夠用于檢測與該波導層毗鄰介質(zhì)的光學性能變化。當光是以引導模式在該波導層中傳播時,在該介質(zhì)/波導器界面處光場不會突然消失掉,而是在鄰近該波導器的人們所說的檢測介質(zhì)中呈指數(shù)下降。這種指數(shù)下降的光場被稱作漸逝場。在該漸逝場中,啦鄰該波導器的介質(zhì)的光學性能的變化可以通過合適的測量裝置來檢測。因此,可以經(jīng)由波導器/固定化的物質(zhì)界面層的光學性能變化,來在對于固定到波導器上的探針特異性結(jié)合的靶分子進行檢測。優(yōu)選給出的是檢測該漸逝場中的熒光信號。該熒光標記的探針/靶分子結(jié)合對是通過漸逝場激勵的。漸逝場生物芯片的一個例子在US595^92中給出。取決于固定在載體上的探針的物質(zhì)庫和取決于靶分子的化學性質(zhì),基于這種測定原理,可以研究例如核酸與核酸之間,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間,抗體與抗原之間,和核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用。為了能進行實際的快速檢測方法,數(shù)年來已經(jīng)嘗試了小型化化學-和/或生物傳感器裝置和完成幾乎全部的試劑(其要求在人們所說的分析盒中定性和/或定量測量樣品)備用。更特別地,使用了微流體工藝,目標是制造可供使用的廉價的、可存儲的和易于操作的一次性盒子,其能夠?qū)崟r傳遞可再現(xiàn)的結(jié)果。關(guān)于分析盒的存儲性和運輸性,現(xiàn)有技術(shù)特別利用了干燥測定技術(shù),在其中全部的試劑是以干燥狀態(tài)提供在盒子中的,任選地提供到分開的室中。該樣品液體通常依靠微流體通道從一個室傳輸?shù)较乱粋€室中。例如,W02005/088300描述了一種整合的微流體分析盒,用于血液分析,其是由下物體部分和上物體部分組成的。兩種元件是結(jié)構(gòu)化的,具有室和通道(其是通過兩個部分的拼合來封閉的)。該測試盒具有一個或多個用于制備樣品的預處理的元件(預處理室), 一個或多個用于識別樣品液體的一種或多種靶分子的多層干燥測定元件(檢測室),和一個或多個連接該預處理元件與該多層干燥測定元件的通道(平均< 3mm)。該預處理元件特別是過濾器元件或者是這樣的具有多孔性能的元件,其為通道或者(微米/納米)墊(其任選地帶有干燥劑)形式。該樣品首先行經(jīng)該預處理元件,然后進入該多層干燥測定元件。 該多層干燥測定識別元件具有至少一個帶有探針的功能層,該探針用于定性和定量測定干燥和穩(wěn)定形式的靶分子。這種試劑層由水吸收層組成,在其中可被激勵的探針相當規(guī)則地分布在親水聚合物結(jié)合材料(凝膠,瓊脂糖等等)中。檢測是經(jīng)由穿過光透明窗的反射測光法,通過照亮該多層干燥測量元件中的檢測層來進行的,在該層中,擴散有來自該識別反應的可光學激勵液體。該樣品是通過使用毛細管力或者壓力來傳輸?shù)?。這種裝置的缺點是該多層干燥測定元件設(shè)計的復雜性和被分析物與檢測試劑的混合未經(jīng)優(yōu)化。此外,各個反應步驟精確的時間控制,特別是體積和培養(yǎng)時間的控制,是不可能的,因此測試結(jié)果不能定量再現(xiàn)。沒有描述參考方式。對于生物化學分析來說,側(cè)向?qū)游鰷y定(LFA)工藝在多年以來就已經(jīng)是已知的。 側(cè)向?qū)游鰷y定(LFA)利用了抗體-抗原反應的作用。另外,通過毛細管力將待分析的樣品 (溶液)沿著傳感器表面牽引。為了依靠LFA來檢測被分析物,例如直接競爭性免疫測定可以在硝化纖維條上進行,其中待分析的樣品由于毛細管力而被牽引通過整個硝化纖維條。 區(qū)域(抗-被分析物抗體已經(jīng)固定在其中)被用作該條測定的檢測區(qū)。檢測真菌毒素(例如脫氧瓜萎鐮菌醇)的LFA測定的一個例子是來自Neogen,Lansing, MI, USA的揭示測定 (Reveal-Assay)(測試盒子),具有相應的Accukan閱讀器。將分析盒插入該閱讀器中,該儀器記錄了所述條測定的結(jié)果區(qū)的圖像。該閱讀器解釋了該結(jié)果圖像,并且當線已經(jīng)識別時,進行了評價。該儀器消除了解釋的主觀性,并且提供了對于測試結(jié)果客觀的、可實行的資料。所述的測定能夠容易和相當快速地進行,并且不需要任何復雜的讀出儀器。不利的是,該方法僅僅允許定性或者最多半定量進行真菌毒素檢測。W02007/079893描述了一種快速檢測真菌毒素的方法,其包含將用于真菌毒素的固定化的結(jié)合配偶體的經(jīng)負載的物質(zhì)庫和/或用于真菌毒素的探針(在空間隔開的測量區(qū)域中)施加到薄層波導器的表面,將含有真菌毒素和所述真菌毒素的探針的樣品與固定化的結(jié)合配偶體接觸,和基于漸逝場中(即,在該波導器界面處)的信號變化,來檢測所述的固定化的結(jié)合配偶體與該真菌毒素和/或所述真菌毒素的識別要素的反應。特別有利的是,該方法能夠限制或者甚至完全免去清洗掉在信號檢測之前熒光標記的結(jié)合配偶體或者含有標記的結(jié)合配偶體的樣品或者溶液。這能夠節(jié)約分析過程的時間和簡化該過程,因為能免去提供清洗溶液。信號強度是基于測定照片,依靠合適的軟件來確定的,計算樣品中存在的真菌毒素的量也是如此。但是,該現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了合適的參考方法對于定量分析
      5的可靠性是有利的。W02007/079893沒有描述這樣的參考方法?,F(xiàn)有技術(shù)描述了利用一種或多種測量區(qū)域用于測量的校正。例如W001/13096使用測量區(qū)域用于在多個沿著傳感器平臺分布的樣品容器中參考相同的化學或者光學參數(shù) (例如局部可利用的激勵光的強度),使得能夠確定所述參數(shù)在傳感器平臺上的局部分布。 用于上述排列的測量區(qū)域中的參考用的測量區(qū)域的數(shù)目和位置是任意的。EP-A0093613描述了一種方法,依靠傳感器,基于光波導的漸逝場中熒光激勵來校正樣品液體中靶分子的定量測定,該傳感器具有第一測量區(qū)域(測量區(qū)),用于特異性結(jié)合第一標記(其的用量是樣品中所存在的被分析物的函數(shù)),和第二測量區(qū)域(校正區(qū)),用于結(jié)合第二標記,其中所述兩個標記的結(jié)合不受樣品中被分析物存在的影響。該測量區(qū)和校正區(qū)利用了不同、但性質(zhì)相似的結(jié)合對。該第二標記物在測定過程中在校正區(qū)中的量產(chǎn)生了用于在濃縮區(qū)域中的被分析物的預定濃度的信號值。兩個測量區(qū)域是在相同的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)上緊靠著放置的,目的是使得由傳感器可能的局部變化引起的差異最小化。用測量區(qū)的信號值除以緊鄰著其放置的校正區(qū)的信號值,來校正該傳感器對于該信號的非特異性作用。沒有給出該傳感器的構(gòu)造和激勵光束的方向的任何細節(jié)。W02004/023142描述了一種方法,依靠傳感器,基于光波導的漸逝場中熒光激勵來校正樣品液體中靶分子的定量測定,在該傳感器上,識別元件和參考分子(Cy5-BSA,BSA= 牛血清白蛋白)已經(jīng)以垂直于漸逝場傳感器平臺中引導的激勵光的傳播方向的分別平行交替的微陣列,分別以測量點和參考點進行了點樣。為了參考每個測量點的信號強度,將所述測量點的凈信號強度除以同一排的相鄰參考點(在激勵光傳播方向上排列)的平均凈信號強度。這種參考補償了垂直于光傳播方向的可利用的激勵光強度的局部差異,包括每個微陣列內(nèi)的和不同微陣列之間二者。當使用現(xiàn)有技術(shù)所述的參考方法時,已經(jīng)表明不適于參考流體系統(tǒng)中的測定。當使用點樣的熒光蛋白質(zhì)作參考時,它傾向于僅僅能夠補償系統(tǒng)中的在傳感器水平上發(fā)生的這些波動,例如諸如熒光的衰減或者陣列點中的波動。由所述現(xiàn)有技術(shù)出發(fā),一個目標是提供廉價的、可存儲的和易于操作的手段,用于依靠負載在薄膜波導體(PWG生物芯片,PWG=平面波導)上在空間隔開的測量區(qū)域(免疫測定)中的固定化的結(jié)合配偶體的物質(zhì)庫,來定量分析被分析物,特別是真菌毒素。本發(fā)明的另一目標是使得能夠進行所產(chǎn)生信號的絕對測量,即,參考。這個目標根據(jù)本發(fā)明通過微流體分析盒來實現(xiàn),該分析盒用于定性和/或定量分析被分析物,特別是真菌毒素,其包括進行該測定所需的干燥形式的全部試劑。本發(fā)明的分析盒具有結(jié)構(gòu)化體,向其中已經(jīng)引入了通過通道彼此連接的腔室。根據(jù)本發(fā)明,該分析盒具有至少一個用于引入包含真菌毒素的樣品液體的入口,至少一個試劑室和至少一個檢測室。該試劑室容納著干燥形式的一種或多種標記的真菌毒素探針和標記的參考探針,所述真菌毒素探針用于與來自樣品液體的真菌毒素反應,所述標記的參考探針用于與參考抗原反應。該檢測室的底部是由薄膜波導體(PWG生物芯片)組成,其包含在第二光學透明層(b) 上的第一光學透明層(a),該層(b)的折射率低于層(a),并且在其中引入了光柵,該光柵是垂直于激勵光的光路來取向的,該激勵光依靠所述光柵耦合到該薄膜波導體中。檢測試劑是如下來固定到薄膜波導體表面上的通過在成排的空間隔開的測量區(qū)域中施加用于真菌毒素和/或用于真菌毒素探針的固定化的結(jié)合配偶體的物質(zhì)庫形式的真菌毒素測定(免疫測定),和包含固定化的參考抗原的獨立的對照測定。該陣列是以這樣的方式施加到PWG生物芯片上的,即,測量區(qū)域成排地平行于光柵取向。在激勵光的方向上,在每排免疫測定的上面和下面各有一排對照測定(參見

      圖1),來使得能夠如下來獲得真菌毒素測定測量區(qū)域的參考的熒光強度用該真菌毒素測定測量區(qū)域的熒光強度除以在激勵光方向上相鄰的對照測定測量區(qū)域的平均熒光強度。令人驚訝地表明,在流體系統(tǒng)中免疫測定的參考通過使用本發(fā)明的動態(tài)參考概念替代已知的靜態(tài)參考概念帶來相當大的改進。有利地,動態(tài)參考能夠補償流體系統(tǒng)中的波動(例如在通道中的吸收,體積波動,墊子中抗體量的變化)和PWG生物芯片表面上的波動 (例如衰減,斑點中的變化)二者。因此,本發(fā)明的第一主題是一種用于識別和定量分析樣品液體中的被分析物的分析盒(Kartusche),其包含結(jié)構(gòu)化體,向其中引入了通過通道彼此連接的腔室,所述分析盒具有至少一個用于引入包含被分析物的樣品液體的入口,至少一個試劑室和至少一個檢測
      室,其中
      a.在該試劑室中設(shè)置有干燥形式的一種或多種標記的被分析物探針和一種或多種標記的參考探針,所述被分析物探針用于與來自樣品液體的被分析物反應,所述參考探針用于與參考抗原反應,
      b.該檢測室的底部是薄膜波導體,其包含在第二光學透明層(b)上的第一光學透明層(a),該層(b)的折射率低于層(a),并且在層(a)或者(b)中引入了光柵,該光柵是垂直于激勵光的光路來取向的,該激勵光依靠所述光柵耦合到該薄膜波導體中,
      c.將免疫測定和獨立的對照測定施加到所述薄膜波導體表面上,該免疫測定呈被分析物和/或被分析物探針的結(jié)合配偶體物質(zhì)庫的形式,該結(jié)合配偶體固定在成排的空間隔開的測量區(qū)域中;所述對照測定包含參考抗原,該參考抗原固定在成排的空間隔開的測量區(qū)域中,和
      d.各排是平行于該光柵取向的,并且在激勵光的方向上,在每排免疫測定的上面和下面都存在一排對照測定。優(yōu)選如此選擇該對照測定,以使得該參考抗原的分子量類似于被分析物,和該參考探針的結(jié)合性能類似于被分析物探針(親合性,結(jié)合動力學)。此外,該對照測定不得表現(xiàn)出與該免疫測定的任何交叉反應性,并且該抗原不得自然產(chǎn)生于被測試基質(zhì)中。此外有利的是該對照測定和免疫測定的降解行為是類似的,來為生產(chǎn)批次提供校正曲線的長期穩(wěn)定性。在本發(fā)明一種特別的實施方案中,該被分析物是真菌毒素。優(yōu)選給出的是使用W02007/079893所述的免疫測定,其內(nèi)容在此引入作為參考。優(yōu)選作為免疫測定的是成排的真菌毒素-蛋白質(zhì)綴合物例如真菌毒素-BSA綴合物。對照測定的例子是對真菌毒素的測定,其不在測試基質(zhì)中自然產(chǎn)生。該對照測定優(yōu)選是這樣選擇的,即,檢測< lOOOg/mol的分子。特別優(yōu)選給出的是在PWG生物芯片上施加用于熒光素的對照測定和一排對照-蛋白質(zhì)綴合物,例如熒光素-BSA。該PWG生物芯片例如由涂覆有五氧化二鉭層的玻璃載體(Glastdger)組成。該層的厚度是40-160nm,優(yōu)選80-160nm,特別優(yōu)選120_160nm,非常特別優(yōu)選155nm。該玻璃載體包含這樣的光柵,其的光柵深度(Gittertiefe)是3_60歷,優(yōu)選5_30歷,特別優(yōu)選10_25歷, 非常特別優(yōu)選18nm,和光柵周期(Gitterperiod)是200_1000nm,優(yōu)選220_500nm,特別優(yōu)選 318nm。優(yōu)選該光柵具有單個周期,即,它是單衍射(monodiffraktiv)的。該五氧化二鉭表面通常涂覆有單層形式的十二烷基磷酸酯/鹽。被分析物-蛋白質(zhì)綴合物,優(yōu)選真菌毒素-BSA綴合物,和參考抗原-蛋白質(zhì)綴合物,優(yōu)選熒光素-BSA-綴合物固定在這個表面上。為了固定化,通常向所述的表面上施加和在這里吸收下面濃度的蛋白質(zhì)綴合物0. l_5mg/ml,優(yōu)選0. 2_aiig/ml,特別優(yōu)選0. 5-1. 5mg/ml,非常特別優(yōu)選Img/ ml ο該蛋白質(zhì)綴合物可以使用選自下面的一種或多種方法來施加噴墨點樣,使用針或者筆的機械點樣,微接觸印刷,測量區(qū)域與生物或者生物化學或者合成識別元件通過在壓力差或者電或者電磁勢作用下將后者供給到平行或者交叉的微通道中而進行的流體接觸。在蛋白質(zhì)綴合物固定后,PWG芯片表面仍然空閑的區(qū)域是通過BSA處理來鈍化的, 目的是抑制非特異性結(jié)合。該PWG生物芯片構(gòu)成了本發(fā)明分析盒的檢測室的底部,并且整合到所述的分析盒中。該分析盒由結(jié)構(gòu)化體組成,其中引入了腔室和通道,并且該腔室優(yōu)選以這樣的方式引入所述體中,即,它們通過施加密封單元而至少在一個面上形成。該結(jié)構(gòu)化體是依靠密封單元在頂部和底部密封的,入口、檢測室底部和任選的通風口除外。優(yōu)選給出的是,在所述密封單元之前,使所述生物芯片就位,并通過該密封單元將所述生物芯片保持在所述位置上。該密封單元優(yōu)選是密封膜。優(yōu)選給出的是在該通道和在該室中傳輸精確界定體積的樣品液體,并且這通過通道和室的設(shè)計以及通過使用傳輸該樣品液體的合適的期間而成為可能。反應時間在此同樣能夠精確控制,這提高了該分析的可再現(xiàn)性。所述室和通道的匹配設(shè)計確保了具有降低的死體積的最佳流動曲線,和任選的與固定化檢測試劑的最佳接觸。通道將入口、試劑室和檢測室彼此相連,并且通常直徑是0. 1-2. 5mm,優(yōu)選 0. 5-1. 5mm,特別優(yōu)選 1mm。在分析盒的一種特別的實施方案中,該試劑室具有試劑墊,在其上設(shè)置有被分析物探針和參考探針,特別是用于用于真菌毒素和熒光素的抗體。對該試劑墊如此選擇使得滿足該檢測室下面的要求上清液溶液的液體體積和在所述溶液中各個組分的濃度。該試劑墊通常是由纖維或者多孔材料,例如細粒子或者織物組成,試劑已經(jīng)混入 (通過在其上吸收,在其上固定,在其中分散,在其中干燥)其中。優(yōu)選的試劑墊是由玻璃或者聚合物例如諸如纖維素組成的。例如,所用的試劑墊還用于人們所說的側(cè)向?qū)游鰷y定中, 并且其是不同形式的市售品。優(yōu)選的試劑室需要10-100μ1,優(yōu)選20_60μ1,特別優(yōu)選40μ1的液體體積,并且溶解在其中的被分析物探針和參考探針的濃度是 ο—7 Μ-ΙΟ,Μ,優(yōu)選納摩爾濃度。這種試劑室是通過選擇試劑墊來填充的,其優(yōu)選由來自Pall Corporation的特厚玻璃過濾器(孔徑1 Mm,典型的厚度1270Mm(50密爾),典型的水流速210ml/min/cm2,30kPa)組成,具有彼此疊置的兩個圓形過濾片,該過濾片具有適配的直徑(通常是 5-10mm)。所形成的試劑墊通常浸漬有大約ΙΟΟμΙ的溶液,該溶液含有熒光標記的探針和通常用于支持所述浸漬的另外的組分。該浸漬例如是通過干燥或者凍干來進行。該試劑墊通常是在分析盒中,以這樣的方式來運行的,即,將它用大約80μ1的樣品液體(例如真菌毒素提取物)進行潤濕。在I-IOmin的預培養(yǎng)時間之后,通常將20_60μ1的溶液傳輸?shù)綑z測室中。精確的體積控制對本發(fā)明是有利的,但并非必需的,因為不同的分析盒之間的變化可以通過本發(fā)明的參考方法來補償。本發(fā)明還涉及一種依靠本發(fā)明的分析盒來識別被分析物,特別是真菌毒素的方法。本發(fā)明的第二主題是一種定量分析被分析物的方法,其包含以下步驟
      a.任選地將被分析物從基質(zhì)中萃取到樣品液體中,
      b.在權(quán)利要求1-7任一項的分析盒中進行測定,其中在該樣品液體已經(jīng)引入該分析盒之后,將所述的樣品液體傳輸?shù)皆噭┦抑校⑶遗c施加到這里的標記的探針混合和/或反應,然后
      c.將該樣品液體傳輸?shù)綑z測室中,并且讓該被分析物和/或該標記的探針與免疫測定和對照測定反應,隨后
      d.照亮該薄膜波導體來激勵免疫測定和對照測定的經(jīng)標記的探針,用于發(fā)熒光和拍攝熒光圖像,然后
      e.基于該對照測定來計算該免疫測定的參考的熒光強度,其中每個免疫測定測量區(qū)域的參考的熒光強度是如下來計算的將所述的免疫測定測量區(qū)域的熒光強度除以在激勵光方向上相鄰的對照測定測量區(qū)域的平均熒光強度,和
      f.基于校正曲線來計算和顯示該被分析物值。如果該真菌毒素存在于固體基質(zhì)中,后者通常在本發(fā)明方法的任選的第一步驟中經(jīng)破碎,隨后用合適的溶劑從基質(zhì)中提取真菌毒素。提取劑的例子是甲醇、乙醇或者乙腈的水溶液。固體基質(zhì)的例子是小麥,玉米,大麥,黑麥,花生,榛實等等。如果該提取物包含大于10%的非水性溶劑,則在填充分析盒之前通常需要稀釋步驟。液體基質(zhì)(牛奶,果汁,酒等)可以直接或者在合適的稀釋之后加入到該分析盒中。在另外的步驟中,用戶將該提取物或者樣品溶液填入到該分析盒中,并且密封該分析盒。該分析盒然后填入到閱讀器中。該閱讀器包含泵,其將空氣泵入到該分析盒中, 并且因此將溶液從樣品入口傳輸?shù)椒磻抑?,在這里所述的溶液潤濕了施加到這里的試劑墊。當該試劑墊潤濕時,借助于提取物將該抗體從試劑墊上溶出,并因此與所述的提取物進行混合。提取物在該試劑墊中的培養(yǎng)時間優(yōu)選是l-20min,特別優(yōu)選3-7min。所述泵現(xiàn)在再次將空氣泵入該分析盒中,并由此將液體體積移動到PWG生物芯片上面的檢測室中。再次進行培養(yǎng)步驟,其通常持續(xù)Ι-lOOmin,優(yōu)選5-15min。優(yōu)選地,在所述方法過程中,將該分析盒加熱到優(yōu)選20-37°C,特別優(yōu)選25°C的溫度。
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      在標記的抗體在PWG生物芯片上的培養(yǎng)之后,將激光束耦合到光柵中。通過PWG 生物芯片的面照明來激勵標記的抗體,使其發(fā)熒光。該生物芯片的熒光圖像是借助于照相機和合適的熒光濾光片來記錄的。圖像分析軟件(其安裝在閱讀器的計算機上)現(xiàn)在確定了真菌毒素和對照測定測量區(qū)域的熒光強度。真菌毒素測定測量區(qū)域的參考的熒光強度是如下來獲得的將真菌毒素測定測量區(qū)域的熒光強度除以在激勵光方向上相鄰的對照測定測量區(qū)域的平均熒光強度。在真菌毒素測定測量區(qū)域的參考熒光強度與移液到分析盒中的溶液中的真菌毒素濃度之間的定量關(guān)系通常是通過記錄校正曲線來建立的。所形成的數(shù)學關(guān)系式存儲于閱讀器的計算機上。當測量樣品時,參考的熒光強度是在拍攝熒光圖像之后確定的,并且相應的真菌毒素濃度是基于校正曲線來計算的。該真菌毒素值然后顯示在閱讀器的屏幕上。本發(fā)明的裝置和本發(fā)明的方法將基于下面的實施例和附圖進行更詳細的說明,但不限于此。腿
      圖1 真菌毒素陣列的構(gòu)造圖2 分析盒設(shè)計圖3 =PffG生物芯片側(cè)視4 :PWG生物芯片尺寸。附圖標記 1分析盒
      2入口 3通道
      4具有試劑墊的試劑室 5檢測室 6 PffG生物芯片 7光柵 8玻璃板 9波導層
      10十二烷基磷酸酯/鹽/附著力促進層的單層
      11參考點/對照測定
      12真菌毒素-BSA綴合物點/免疫測定
      13參考點/對照測定
      14 BSA。分析盒(1)由結(jié)構(gòu)化體組成,向其中已經(jīng)引入了通道和腔室。例如,本發(fā)明的分析盒是通過注塑法來生產(chǎn)的。所述的體是由黑色聚甲醛(POM) 制成的板組成的,在其中已經(jīng)鉆孔和銑削出通道和室。該分析盒(1)包含入口 O)(用于將含有待檢測的被分析物的樣品液體加入到分析盒⑴的樣品室中),具有試劑墊⑷的試劑室(將樣品液體經(jīng)由通道⑶傳輸?shù)狡渲?,和檢測室(5)(將樣品液體經(jīng)由另一通道C3)傳輸?shù)狡渲?,并且包含PWG生物芯片(6))。將反應室(4)包含的用熒光染料(該抗體對于來自樣品液體的真菌毒素是特異性的)標記的抗體,和對于熒光素特異性的標記的抗體,浸漬到試劑墊上。將PWG生物芯片(6)和試劑墊二者保持在POM板中的兩個聚烯烴膜之間,該膜還充當了密封膜,用于密封所述測試盒。上密封膜的厚度是ISOMffl,下部密封膜的厚度是 80Mm。下膜在PWG生物芯片(6)中具有窗口,其提供了到達PWG生物芯片(6)的測量區(qū)的自由通路。在測試開始時,將樣品液體通過入口(2)引入到樣品室中,并且入口(2)用合適的蓋子氣密性密封。將界定體積的空氣在入口借助于傳輸單元引入到分析盒(1)中。這種體積的空氣排擠樣品液體,使得流入試劑室(4)和完全潤濕該試劑墊。由于向該試劑室(4)導入樣品液體,因此抗體被溶解,與該樣品液體混合和與所述的樣品液體中存在的真菌毒素形成特異性結(jié)合(真菌毒素-抗體綴合物)。隨著樣品液體中的真菌毒素量的增加,抗體的自由結(jié)合位置變得逐漸飽和。在25°C溫度一定的停留時間(10分鐘)之后,將該含有真菌毒素-抗體綴合物和用于熒光素的抗體的樣品液體在接下來的步驟中傳輸?shù)綑z測室(5)中。在檢測室(5)中,檢測了該生物化學檢測反應的過程或者端點。該檢測室( 被該樣品液體完全填充。整個通道系統(tǒng)是排氣的(entlilftet)。整個通道系統(tǒng)的排氣是通過施加到上密封膜上的排氣孔來進行的。檢測室(5)包含PWG生物芯片(6)。圖2示意性顯示了 PWG生物芯片(6)的頂視圖,和圖3示意性顯示了 PWG生物芯片(6)的側(cè)視圖。檢測室(5)中的PWG生物芯片(6)由厚度0. 7mm的IOmmX 12mm玻璃板⑶(12. 0 +/-0. 05mmX 10. 0+/-0. 05mmX0. 70+/-0. 05mm)組成。Ta2O5(五氧化二鉭)的薄的 155nm波導層(9)位于PWG芯片(6)的一個面上。該芯片的測量區(qū)由中心10mmX6mm的矩形區(qū)組成。 平行于這種測量區(qū),這里存在著500μπι寬度的新月形帶子用于耦合激勵光的光柵(7)。光柵(7)相對于邊緣的位置精確度是+/-0. 05mm。該光柵深度是18nm,光柵周期是318nm,占空度是0.5。將十二烷基磷酸酯/鹽單層作為附著力促進層(10)施加到該PWG生物芯片(6) 上。該附著力促進層(10)上以吸附方式滴加/固定化真菌毒素-BSA綴合物,其處于免疫測定(1 的形式,呈平行于光柵的成排的點的形式(陣列)。在每排真菌毒素-BSA綴合物點(免疫測定(1 )上面和下面是一排BSA-熒光素點(對照測定/參考點(11,13))(圖 1)。免疫測定(12)和對照測定之間的自由區(qū)是用BSA(14)閉塞的(鈍化)。在檢測室( 中,該真菌毒素-抗體綴合物和任選的,具有自由結(jié)合位置的抗體以及用于熒光素的抗體到達了固定化的被分析物-BSA綴合物的免疫測定(12),和到達PWG生物芯片(6)上的對照測定(11,13)。具有自由結(jié)合位置的抗體形成了與對應的固定化被分析物-BSA綴合物的特異性結(jié)合。所述溶液中存在的具有自由結(jié)合位置的抗體越多(即,樣品液體中對應的被分析物的比例越低),用熒光染料標記的抗體結(jié)合到PWG生物芯片上越多。用樣品液體中的被分析物飽和的抗體保持在所述溶液中。
      通過將電磁輻射耦合到該PWG生物芯片(6)中,可以在波導器的漸逝場中激勵結(jié)合到固定化的被分析物-BSA綴合物上,并且用熒光染料標記的抗體發(fā)熒光。在溶液中存在的并用熒光染料標記的抗體在這種情況中沒有被激勵。在這種方式中,樣品液體中存在的真菌毒素被間接定量測定。真菌毒素點的參考的熒光強度是如下來獲得的將真菌毒素點的熒光強度除以參考點的平均熒光強度。真菌毒素點的參考的熒光強度與移液到分析盒中的溶液中的真菌毒素濃度之間的定量關(guān)系是通過記錄校正曲線來確定的。所形成的數(shù)學關(guān)系存儲在閱讀器的計算機上。實施例1
      吿瞧驢■廳PWG物郎卜._氧,臓廉麵(DON) 將M個PWG生物芯片(Unaxis,Liechtenstein)凈化和用十二烷基磷酸酯/鹽涂覆, 所述生物芯片的外部尺寸10mmX 12mm,由玻璃制成,并且具有五氧化二鉭的層(155nm), 該層中已經(jīng)印刷有光柵(光柵深度18nm)。將脫氧瓜萎鐮菌醇和牛血清白蛋白的綴合物 (DON-BSA, Biopure,奧地利)以及牛血清白蛋白和熒光素的綴合物(BSA-FITC,Sigma,德國)借助于NanoplotteHGe-SIM,德國)類型的點樣機施加到該生物芯片上。該點是以交替成排的形式施加到PWG生物芯片上的,在每排中各有16個BSA-FITC綴合物點和BSA-DON 綴合物點,這樣在每種情況中,所述的排平行于所述光柵。將所述點干燥,然后經(jīng)歷BSA水溶液的霧處理。將該PWG生物芯片清洗,然后干燥。將該PWG生物芯片使用雙面膠帶粘合到分析盒中。所述的分析盒包含用于容納樣品的樣品室,具有玻璃纖維墊的試劑室和用于 PWG生物芯片的檢測室。所述室是通過通道彼此連接的。該玻璃纖維材料浸漬有抗體的納摩爾濃度的溶液,該抗體是用熒光染料DY-647 (Dyomics,德國)標記的,其中使用抗脫氧瓜萎鐮菌醇和熒光素的單克隆抗體。該抗體已經(jīng)溶解在含有BPS (=磷酸鹽緩沖的鹽水),0. 1% 卵清蛋白,0. 05%吐溫和5%的蔗糖的緩沖液中。將所獲得的試劑墊真空干燥,然后印刷到分析盒中。將該分析盒用密封膜在兩個面上密封,來密封所述的通道。實施例2
      記錄標準曲線(校IH曲線),用于DON的定量測量
      制備了濃度0-6000ppb的DON溶液,并且向17個分別的分析盒填入在每種情況中 200μ1所述的溶液。密封所述分析盒,然后填入到MyToLab閱讀器(Bayer Technology Services,德國)中。設(shè)定該閱讀器,以使得該儀器的內(nèi)部傳輸單元將填入到該分析盒中的液體首先傳輸?shù)皆噭|中,并且預培養(yǎng)5分鐘的時間后,傳輸?shù)綑z測室中。在此期間,溫度保持恒定在25°C。在芯片室中IOmin的培養(yǎng)時間之后,將激光耦合到該PWG生物芯片的光柵中。拍攝每個單個PWG生物芯片的熒光圖像,積分時間2-3s。將所獲得的每個DON點的熒光強度除以位于各DON點上面和下面的BSA-FITC點的平均熒光強度。確定了全部16個 DON點的以此方式參考的平均熒光強度。將所獲得的依賴于濃度的參考的熒光強度借助于計算機程序Origin 7G(Origin Lab Corporation,美國)通過S形擬合進行擬合。實施例3
      測量人工污染的小壽樣品中的DON
      將小麥粒研磨,并將所形成的面粉用已知量的DON溶液處理,將其放置干燥。該均化的樣品包含了 888mg/kg(ppb)的DON。將5g面粉樣品用25ml的70%甲醇通過強力震蕩^iin來提取。將提取物靜置沉降,將上清液用緩沖液以1:3的比例稀釋。將該稀釋的提取物填入到7個不同的分析盒中。該分析盒然后如上所述在MyToLab閱讀器中測量,并且確定了 DON點的參考的熒光強度。相對于上述標準曲線來確定DON濃度(單位ppb),這產(chǎn)生了 1042,757,710,660,431,728和984ppb的值。DON測量的平均值是760ppb,具有27%的百分比標準偏差。
      權(quán)利要求
      1.用于識別和定量分析樣品液體中的被分析物的分析盒,其包含結(jié)構(gòu)化體,在其中引入了通過通道彼此連接的腔室,其中所述分析盒具有至少一個用于引入包含該被分析物的樣品液體的入口,至少一個試劑室和至少一個檢測室,其中a.該試劑室中設(shè)置有干燥形式的一種或多種標記的被分析物探針和一種或多種標記的參考探針,所述被分析物探針用于與來自所述樣品液體的所述被分析物反應,所述參考探針用于與參考抗原反應,b.該檢測室的底部是薄膜波導體,其包含在第二光學透明層(b)上的第一光學透明層(a),該層(b)的折射率低于層(a),并且在層(a)或者(b)中引入了光柵,該光柵垂直于激勵光的光路取向,該激勵光依靠所述光柵耦合到該薄膜波導體中,c.將免疫測定和獨立的對照測定施加到所述薄膜波導體表面上,所述免疫測定為針對被分析物和/或被分析物探針的結(jié)合配偶體物質(zhì)庫形式,該結(jié)合配偶體固定在成排的空間隔開的測量區(qū)域中;所述對照測定包含參考抗原,該參考抗原固定在成排的空間隔開的測量區(qū)域中,和d.所述各排平行于該光柵取向,并且在激勵光的方向上,在每排免疫測定的上面和下面都有一排對照測定。
      2.權(quán)利要求1的分析盒,特征在于該參考抗原的分子量類似于該被分析物,該參考探針的結(jié)合性能類似于該被分析物探針,該對照測定不表現(xiàn)出任何對免疫測定的交叉反應性,和該參考抗原不存在于所測試的基質(zhì)中。
      3.權(quán)利要求1和2任一項的分析盒,其中該被分析物探針是抗體。
      4.權(quán)利要求1-3任一項的分析盒,特征在于該被分析物是真菌毒素。
      5.權(quán)利要求4的分析盒,其中該參考抗原在對照測定中<lOOOg/mol。
      6.權(quán)利要求4和5任一項的分析盒,其中該參考抗原是熒光素。
      7.權(quán)利要求4-6任一項的分析盒,其中該免疫測定包括真菌毒素-蛋白質(zhì)綴合物和/ 或該對照測定包括對照分子-蛋白質(zhì)綴合物。
      8.定量分析被分析物的方法,其包含以下步驟a.任選地,將被分析物從基質(zhì)中萃取到樣品液體中,b.在權(quán)利要求1-7任一項的分析盒中進行測定,其中在該樣品液體引入該分析盒之后,將所述樣品液體傳輸?shù)皆噭┦抑?,并且與施加到這里的標記探針混合和/或反應,然后c.將該樣品液體傳輸?shù)綑z測室中,并且使該被分析物和/或該標記的探針與免疫測定和對照測定反應,隨后d.照亮該薄膜波導體來激勵免疫測定和對照測定的標記的探針,用于發(fā)熒光和拍攝熒光圖像,然后e.基于該對照測定來計算該免疫測定的參考的熒光強度,其中每個免疫測定測量區(qū)域的參考的熒光強度是如下來計算的將所述的免疫測定測量區(qū)域的熒光強度除以在激勵光方向上相鄰的對照測定測量區(qū)域的平均熒光強度,和f.基于校正曲線來計算和顯示該被分析物值。
      9.權(quán)利要求8的方法,在其中在該方法的過程中,將該分析盒調(diào)節(jié)到20-37°C的溫度。
      10.權(quán)利要求8和9任一項的方法,其中步驟b.中的反應進行了l-20min的時間長度和/或步驟c.中的反應進行了 I-IOOmin的時間長度。
      11.權(quán)利要求1-7任一項的分析盒和權(quán)利要求8-10任一項的方法用于識別和定量分析真菌毒素的用途。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種用于識別和定量分析被分析物的裝置和方法以及它們用于識別和定量分析真菌毒素的應用。
      文檔編號B01L3/00GK102460127SQ201080025738
      公開日2012年5月16日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日
      發(fā)明者多恩 I., 伯邁斯特 J., 拉策克 U., 巴齊爾彥斯卡 V. 申請人:拜爾農(nóng)作物科學股份公司
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