專利名稱：用于干填充色譜柱的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及可用于生物分子的液相色譜分離的填充床體柱、填充這種柱的方法以及利用柱分離生物分子的方法。
背景技術(shù)：
在液相色譜法中使用的色譜柱通常包括封裝有多孔色譜介質(zhì)的填充床體的管狀主體，載液從填充床體中流過，其中通過在載液與多孔介質(zhì)的固相之間的隔離而發(fā)生分離。在任何分離過程之前，必須從將引入色譜柱中的顆粒介質(zhì)開始對(duì)床體進(jìn)行制備。床體成形過程被稱為“填充過程”，并且正確填充的床體是影響包含填充床體的色譜柱的性能的關(guān)鍵因素。通常，填充床體通過漿料填充，即壓實(shí)被泵入、倒入或吸入色譜柱中的稱為漿料的液體中的離散顆粒的懸浮液而制備。一旦將預(yù)定體積的漿料輸送到色譜柱中，就需要通過沿著色譜柱的縱向軸線朝色譜柱的底部向下以通常恒定的速度移動(dòng)活動(dòng)的適配器來進(jìn)一步壓實(shí)和壓縮漿料。在此過程中過量液體在色譜柱出口被排出，而依靠所謂的“床體支承”的過濾材料保持介質(zhì)顆粒，其中過濾材料的孔太小，以致于不允許介質(zhì)顆粒通過。一旦已經(jīng)將填充床體壓縮到最佳的壓縮度，填充過程就完成了。用于色譜柱漿料填充的另一種途徑是流動(dòng)填充方法，其中多孔結(jié)構(gòu)的壓縮主要通過在色譜柱上施加高流量來實(shí)現(xiàn)，從而形成在出口床體支承處開始的多孔結(jié)構(gòu)。所產(chǎn)生的對(duì)多孔結(jié)構(gòu)中顆粒的阻力最終引起壓降和床體的壓縮。通過使適配器就位而最終限制壓縮的床體。后續(xù)色譜分離的效率強(qiáng)烈地依賴于I)在填充床體的流體入口和出口處的液體分布和收集系統(tǒng)，2)填充床體中的介質(zhì)顆粒的特殊取向(也被稱為填充幾何)，以及3)填充床體的壓縮。如果填充床體的壓縮太低，那么在床體上執(zhí)行的色譜分離將受到“拖尾”的困擾，并且這種壓縮不足的床體通常是不穩(wěn)定的。如果填充床體的壓縮太高，那么由床體執(zhí)行的色譜分離將受到“前延(leading) ”的困擾，并且這種過壓縮的床體可能影響通過量和粘合能力，并且，通常提供高得多的操作壓力。如果壓縮是最佳的，那么在使用期間形成的分離峰很少出現(xiàn)前延或拖尾，并且是基本上對(duì)稱的。就實(shí)現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)的良好的長期穩(wěn)定性從而在多個(gè)工藝循環(huán)中確保最佳性能而言，色譜柱所需要的最佳壓縮程度也是關(guān)鍵的。色譜柱所需的最佳壓縮程度是按照每個(gè)色譜柱的尺寸(寬度或直徑)、床體高和介質(zhì)類型通過實(shí)驗(yàn)確定的。一種備選的填充方法被稱為“干填充”，其中色譜柱利用多孔介質(zhì)的干燥顆粒充填，并且隨后在色譜柱中引入液體。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是，可以將預(yù)填充的色譜柱以干燥狀態(tài)交付客戶而不必向填充液添加任何防腐劑，并且使運(yùn)輸期間的重量最小化。干填充通常用于旨在分離小分子的二氧化娃(silica)介質(zhì)，如例如G Guiochon J Chromatogr A 704(1995) 247-268中所描述的，但獲得的色譜柱效率非常低。然而，對(duì)于溶脹性的色譜介質(zhì)，例如生物分子的分離中常用的葡聚糖或瓊脂糖基介質(zhì)，由于意識(shí)到顆粒的溶脹將引起較差的填充床體性能，因而避免了干填充。US 4，353，801提到溶劑溶脹性苯乙烯-二乙烯苯顆粒的干填充劣于濕填充。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種用于從干燥可溶脹顆粒開始的高效色譜柱的填充方法。這通過包括下列步驟的方法實(shí)現(xiàn)a)將一定量的所述干燥可溶脹顆粒5轉(zhuǎn)移到色譜柱I中的柱室2，所述量足以提供柱室體積的約105-120%的液體中的溶脹體積Ks，b)關(guān)閉色譜柱，并且c)將所述液體提供到色譜柱。換言之，該方法包括計(jì)量(例如，通過稱量)干燥可溶脹顆粒5的等分試樣；將所述等分試樣提供到色譜柱I中的柱室2 ;關(guān)閉柱室；并且將液體供應(yīng)到柱室，其中所述等分試樣的溶脹體積Vs為柱室體積的約105-120%。本發(fā)明的具體方面為存儲(chǔ)穩(wěn)定的預(yù)填充柱，該預(yù)填充柱易于運(yùn)輸?shù)绞褂谜咛幉⒂墒褂谜邅砥胶?。這由包括干燥可溶脹顆粒的色譜柱實(shí)現(xiàn)，其中顆粒的量足以提供柱室體積的約105-120%的水性液體中的溶脹體積Ks。以上方面中的一個(gè)或多個(gè)可由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另外 的方面、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)將從下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求中顯而易見。


圖I示出色譜柱和利用干燥可溶脹顆粒填充該色譜柱的方法的示意圖。圖2示出在柱室中插入柔性容器的實(shí)施例。圖3示出管狀柱室安裝在剛性殼體中的實(shí)施例。圖4示出填充方法的流程圖。圖5示出其中干燥可溶脹顆粒的液體吸收率為確定的實(shí)施例的流程圖。圖6示出其中色譜柱在施加液體之前被振動(dòng)的實(shí)施例的流程圖。圖7示出如何計(jì)算色譜柱性能。
具體實(shí)施例方式定義
術(shù)語“可溶脹顆?！痹诒疚闹惺侵附胍后w之后尺寸增加的顆粒。這可被看作是液體中的沉降體積，該體積顯著大于相同量的干燥顆粒的總體積。術(shù)語“溶脹體積” m在本文中是指在液體中懸浮和平衡的顆粒的等分試樣的沉降體積?？赏ㄟ^下列步驟測(cè)量沉降體積將顆粒的等分試樣懸浮；平衡最多24h ;如果需要，再次懸浮顆粒；讓顆粒沉降；并且在有刻度的容器(例如量筒)中測(cè)量沉降體積。術(shù)語“液體吸收率”(Ks/ /)在本文中是指如以上定義的顆粒的等分試樣的溶脹體積Vs與顆粒的等分試樣在浸入液體中之前的干重之間的比率。在圖I和圖4所示的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，一定量的干燥可溶脹顆粒5被轉(zhuǎn)移到色譜柱I中的柱室2，其中顆粒的量足以提供柱室體積的約105-120%的液體中的溶脹體積1 ，色譜柱被關(guān)閉，并且液體被供應(yīng)到柱室。由于溶脹體積高于柱室體積，所以顆粒床體將被壓縮到對(duì)應(yīng)的程度(填充柱的壓縮系數(shù)CF通常定義為Ks/KcW，其中Vcol為柱室體積)，這提供了高的柱效率和低的峰不對(duì)稱度。柱效率可表示為折合塔板高度(reducedplate height)A，該值為塔板高度除以顆粒的平均直徑。塔板高度通過本領(lǐng)域中熟知的方法測(cè)量。峰不對(duì)稱度可表示為不對(duì)稱因子As，該值為從峰的后坡到峰的中心的距離與從前坡到峰中心的距離(全部在峰高度的10%處測(cè)量)之間的比率。塔板高度和不對(duì)稱因子兩者均對(duì)小分子非保持物質(zhì)適當(dāng)?shù)販y(cè)量。色譜柱可設(shè)計(jì)用于軸向或徑向流，并且它可包括流體分配器3。柱室的入口和出口可以由多孔篩4定界，以保持顆粒并讓液體通過。多孔篩可由織造篩目、燒結(jié)玻璃料或任何其它類型的多孔材料制備。在圖5所示的又一實(shí)施例中，該方法的初始步驟是確定干燥可溶脹顆粒的液體吸收率并從所述液體吸收率決定待轉(zhuǎn)移到柱室的干燥可溶脹顆粒的量。液體吸收率可使用用于提取代表性樣品的成熟方法從顆粒的單獨(dú)的樣品等分試樣確定。樣品被稱量干重(即與環(huán)境大氣平衡)，并且然后懸浮在測(cè)試液中。測(cè)試液可以是與色譜柱的填充和操作中所使用的相同的液體或具有類似成分的液體；通常為具有類似離子強(qiáng)度/電導(dǎo)率和PH值的水性緩沖液或鹽溶液。讓測(cè)試液中的顆粒平衡通常約一小時(shí)，且在任何情況下不超過24小時(shí)。將顆粒再次懸浮并讓其沉降。例如在量筒中測(cè)量沉降體積。然后，將液體吸收率計(jì)算為沉降體積Vs與干燥顆粒樣品的重量 /之間的比率Vs/md。首先測(cè)量液體吸收率的優(yōu)點(diǎn)是可以預(yù)測(cè)色譜柱中的顆粒的溶脹體積，從而導(dǎo)致更好控制壓縮和柱效率。在特定實(shí)施例中，液體吸收率以小于5%的變異系數(shù)、或者甚至小于2%的變異系數(shù)確定，以允許色譜柱性 能的控制的高精度。在備選實(shí)施例中，代替使用干燥顆粒重量作為基準(zhǔn)，液體吸收率基于干燥顆粒體積而確定。同樣地，將充填到具有給定特定柱的至少一個(gè)柱中的等分試樣的制備可基于干燥顆粒體積而不是干燥顆粒質(zhì)量來進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，在將液體提供到色譜柱之前，可以操縱柱室中的干燥可溶脹顆粒以允許更均勻的空間分布。在圖6所示的一個(gè)實(shí)施例中，在提供液體之前，使色譜柱經(jīng)受振動(dòng)，而在另一個(gè)實(shí)施例中，在提供液體之前，從色譜柱的底端注射氣體(例如空氣)。這些動(dòng)作都可引起干燥顆粒至少部分地流化，從而導(dǎo)致在柱室的水平底部表面上的更均勻的顆粒分布。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是，在施加液體之后，可以實(shí)現(xiàn)溶脹顆粒更均勻的空間分布。振動(dòng)或氣體注射可以在將干燥可溶脹顆粒轉(zhuǎn)移到柱室或柔性容器之后的任何階段進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將惰性氣體注入色譜柱中以在存儲(chǔ)期間提供針對(duì)氧化降解反應(yīng)的保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施例中，液體沿上流方向提供到色譜柱。液體接著將沿豎直方向上從底部入口均勻地上升穿過干燥顆粒床體，從而導(dǎo)致比液體從色譜柱的頂部向下倒入時(shí)更均勻的顆粒分布。一旦顆粒已被液體溶脹，就可以在任何方向上(上流、下流、傾斜等)操作色譜柱。在特定實(shí)施例中，到干燥可溶脹顆粒的液體加入速率不超過顆粒的毛細(xì)管抽吸速率。毛細(xì)管抽吸速率可通過例如以下方式確定將具有干燥可溶脹顆粒的色譜柱放入包含高達(dá)干燥床體的下端的液體的槽中，并且通過光學(xué)、重量分析或其它方法測(cè)量液體上升穿過床體的速率。使液體加入速率低于或等于毛細(xì)管抽吸速率具有如下優(yōu)點(diǎn)，即在溶脹之后提供更均勻的顆粒分布以及因此更好的色譜柱性能。液體加入速率可表示為柱室中的液體速度(液體流量除以柱室的內(nèi)部橫截面積)。在特定實(shí)施例中，在將液體加入到干燥顆粒期間，柱室中的液體速度小于lOOcm/h，例如在5與70cm/h之間。在一個(gè)實(shí)施例中，液體為水性的，并且因此其可包括諸如低級(jí)醇(如乙醇)的潤濕劑(減小表面張力的添加劑)或表面活性劑。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是，在溶脹之后可以獲得更均勻的顆粒分布。在圖2所示的一個(gè)實(shí)施例中，將干燥可溶脹顆粒轉(zhuǎn)移到色譜柱中的柱室的步驟包括首先將干燥可溶脹顆粒5轉(zhuǎn)移到柔性容器7，并且然后將柔性容器放入柱室2中。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是，可以將顆粒包裝在容易運(yùn)輸?shù)牡统杀救嵝匀萜髦泄┙o給使用者，并且使用者可以將容器放入色譜柱中并施加液體。柔性容器的壁可具有多孔部分，該多孔部分將抵靠柱室的多孔的頂板和底板裝配。柔性容器可以為例如塑性袋構(gòu)造或由模制和/或擠出部件組裝而成。在一個(gè)實(shí)施例中，柔性容器被溶脹顆粒膨脹以配合柱室。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括下列步驟在將干燥可溶脹顆粒轉(zhuǎn)移到柱室8之后和在色譜柱關(guān)閉之前，將柱室8轉(zhuǎn)移到剛性殼體11，該殼體在凝膠溶脹和/或色譜柱操作期間為柱室提供尺寸穩(wěn)定性。在此背景下，獨(dú)立式柱室8可以在凝膠的溶脹期間或由于加壓而在色譜柱操作期間略微撓曲。剛性殼體11將防止任何這種撓曲和任何相關(guān)的色譜柱性能劣化。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括在將液體加入到色譜柱之前對(duì)具有干燥可溶脹顆粒的色譜柱或柔性容器輻射消毒的步驟。此步驟可以在該方法的任何階段進(jìn)行。輻射消毒可通過伽馬射線或電子束照射進(jìn)行。 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例為包括干燥可溶脹顆粒的色譜柱，其中顆粒的量足以提供柱室體積的約105-120%的水性液體中的溶脹體積Ks。在一個(gè)實(shí)施例中，該液體為O. lmol/1的20°C下的氯化鈉(NaCl)水溶液。這種溶液具有大約10 mS/cm的電導(dǎo)率，該值在生物分子/生物醫(yī)藥分離中使用的許多緩沖液的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，干燥可溶脹顆粒的液體吸收率Vs/md(在O. IM的20°C下的NaCl水溶液中)在5與25 ml/g之間，例如在5和15 ml/g之間。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)是在色譜柱的操作期間對(duì)壓縮系數(shù)的良好控制和最小化所施加液相成分的溶脹(和色譜柱性能)的波動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施例中，干燥可溶脹顆粒在蒸餾水中的液體吸收率比在O. IM水性NaCl中的液體吸收率的I. 5倍小。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是將液相成分的溶脹波動(dòng)保持在較低水平。在一個(gè)實(shí)施例中，柱體積為固定的。固定體積的色譜柱可以構(gòu)造成不具有任何移動(dòng)部件(適配器等)，這樣簡化了構(gòu)造，并且從成本角度來看是有利的。在一個(gè)實(shí)施例中，色譜柱包括模制或擠出部件。諸如注模、吹模、旋模、壓縮模制等的模制和擠出方法對(duì)于由例如熱塑性材料制造柱部件來說是方便而節(jié)約成本的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，柱室體積為至少一升。具有超過I升的床體體積的色譜柱常常用于工業(yè)生物藥品純化中。這種色譜柱常常是具有移動(dòng)部件的復(fù)雜而昂貴的鋼結(jié)構(gòu)，因此需要允許使用簡單的塑性結(jié)構(gòu)的解決方案。在圖2所示的一個(gè)實(shí)施例中，色譜柱I包括包含干燥可溶脹顆粒5的柔性容器7。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是，可以將顆粒包裝在容易運(yùn)輸?shù)牡统杀救嵝匀萜髦刑峁┙o使用者，并且使用者可以將容器放入色譜柱中并施加液體。柔性容器可包括至少一個(gè)柔性壁，即，當(dāng)把I巴的過壓施加到無支承的容器時(shí)，可以足夠撓曲以引起至少1%的容器體積變化的壁。柔性容器的壁可具有多孔部分，該多孔部分將抵靠柱室2的多孔頂板和底板13裝配。柔性容器可以為例如塑性袋構(gòu)造或由模制和/或擠出部件組裝而成。在一個(gè)實(shí)施例中，柔性容器為可膨脹的，以在顆粒溶脹時(shí)配合柱室。在另一個(gè)實(shí)施例中，保持顆粒且提供液體分布的多孔頂板和底板區(qū)段可以合并到柔性容器中。在這種情況下，柔性容器為封閉系統(tǒng)，并且不與殼體或從外部機(jī)械地支承柔性容器的其它部件流體接觸。在圖3所示的一個(gè)實(shí)施例中，色譜柱包括具有例如圓形、橢圓形或矩形截面的至少一個(gè)管狀柱室8，并具有至少一個(gè)剛性管壁9和至少一個(gè)柔性端件10。柔性端件可以是多孔的且被放置成與剛性殼體11中的多孔頂板或底部13緊密接觸。剛性殼體的頂端和底端可由本領(lǐng)域中熟知的一般夾緊結(jié)構(gòu)(圖3中未示出)保持在一起。在一個(gè)實(shí)施例中，干燥可溶脹顆粒包括多聚糖，例如交聯(lián)瓊脂糖。由于其高通過量和低非特異性吸收，交聯(lián)瓊脂糖顆粒對(duì)于生物分子純化和生物醫(yī)藥純化非常有用。交聯(lián)瓊脂糖顆粒通常在水性乙醇溶液中供應(yīng)，并且使用干燥瓊脂糖顆粒的優(yōu)點(diǎn)在于不必處理易燃乙醇。瓊脂糖顆粒的干燥可使用例如冷凍干燥、噴霧干燥或真空干燥進(jìn)行。在實(shí)施例中，干燥可溶脹顆粒包括帶電配體。這種配體主要在離子交換和多模式分離中使用，這兩種分離都是生物分子分離和生物醫(yī)藥分離中非常有用的。可以設(shè)想陽離子交換劑、陰離子交換劑和多模式離子交換劑。在一個(gè)實(shí)施例中，干燥可溶脹顆粒包括具有疏水性官能團(tuán)的配體。這種配體在疏水作用色譜和許多多模式分離中使用，這兩種應(yīng)用都是生物分子分離和生物醫(yī)藥分離中非常有用的。具有疏水性官能團(tuán)的配體和配體部分的實(shí)例為烷基和芳基。 在一個(gè)實(shí)施例中，干燥可溶脹顆粒包括親和配體。這種配體在生物分子和生物醫(yī)藥的高選擇性分離中非常有用。親和配體的實(shí)例為蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、酶底物、凝集素、生物素、抗生物素蛋白、抗體、抗體片段、抗原等。在一個(gè)實(shí)施例中，提供到具有干燥可溶脹顆粒的色譜柱的液體包括至少一種生物分子，例如生物藥品。這種液體的實(shí)例包括蛋白溶液和病毒懸浮液，例如，生物處理操作中將純化的進(jìn)料。直接利用進(jìn)料溶脹干燥顆粒的優(yōu)點(diǎn)是，可以取消單獨(dú)的溶脹步驟，并且溶脹本身可以為未滲入溶脹結(jié)構(gòu)中的物質(zhì)提供分離和濃縮效果。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是包括根據(jù)前述實(shí)施例填充的溶脹顆粒的色譜柱。在特定實(shí)施例中，色譜柱具有小于15的折合塔板高度A，例如對(duì)于測(cè)試物質(zhì)小于10。測(cè)試物質(zhì)可以是非保留小分子，例如無機(jī)鹽或丙酮。在又一個(gè)實(shí)施例中，色譜柱的不對(duì)稱因子As小于3，例如，對(duì)于如上所選的測(cè)試物質(zhì)小于2. 5。一個(gè)實(shí)施例是由同一批干燥可溶脹顆粒制備的至少兩個(gè)色譜柱。在特定實(shí)施例中，色譜柱并聯(lián)連接。將具有相同床體體積、顆粒類型和床體高度的色譜柱并聯(lián)連接是一種增加總橫截面積和通過量的方便的方式。然而，當(dāng)使用并聯(lián)連接的色譜柱時(shí)，很重要的一點(diǎn)是，色譜柱中的流體速度相同，以確保在每個(gè)柱中實(shí)現(xiàn)相同的分離。這對(duì)色譜柱在流體阻力和壓力-流量行為方面的可重復(fù)性提出較高要求。當(dāng)色譜柱中具有來自同一批次的干燥可溶脹顆粒時(shí)，可以足夠好地控制流體阻力和壓力-流量行為以允許并聯(lián)使用。在一個(gè)實(shí)施例中，包括溶脹顆粒的色譜柱被用于分離至少一種生物分子，例如生物藥品。合適的生物分子可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、病毒顆粒等。合適的生物藥品可以是免疫球蛋白(如單克隆抗體)、免疫球蛋白片段和其它構(gòu)造、胰島素和其它治療性肽、促紅細(xì)胞生成素、血漿蛋白、低聚核苷酸、質(zhì)粒、疫苗等。在特定實(shí)施例中，生物分子或生物藥品為蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，生物分子或生物藥品結(jié)合到顆粒并且通過用洗滌液洗滌而除去至少一種雜質(zhì)。然后，可以用洗提液從顆粒洗提生物分子或生物藥品。此模式常常被稱為結(jié)合-洗提分離，并且當(dāng)雜質(zhì)量較大和/或需要非常高的分離選擇性時(shí)尤其有用。在另一實(shí)施例中，至少一種雜質(zhì)結(jié)合到顆粒，并且在流過色譜柱的過程中回收生物分子或生物藥品。此模式常常被稱為流過分離(flow-through separation),并且提供非常高的通過量，特別是當(dāng)雜質(zhì)的量相對(duì)較低時(shí)。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從下面的實(shí)例并且從所附權(quán)利要求顯而易見。該書面描述利用示例來公開本發(fā)明，包括最佳模式，并且還使本領(lǐng)域技術(shù)人員能實(shí)施本發(fā)明，包括制造和使用任何設(shè)備或系統(tǒng)以及執(zhí)行任何合并的方法。本發(fā)明的專利保護(hù)范圍由權(quán)利要求所限定，并且可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所想到的其它示例。如果這種其它示例具有與所附權(quán)利要求的字面語言沒有不同的結(jié)構(gòu)元件，或者如果它們包括與所附權(quán)利要求的字面語言無實(shí)質(zhì)差別的等同結(jié)構(gòu)元件，則這種其它示例意圖在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。附圖描述 圖I i)示出色譜柱I的示意圖，色譜柱I具有由多孔篩4定界的流體分配器3和柱室2。圖I ii)示出在柱室中具有干燥可溶脹顆粒5的色譜柱。圖I iii)示出在施加液體之后具有充填柱室的此時(shí)溶脹的顆粒6的色譜柱。圖2 i)示出具有干燥可溶脹顆粒5的柔性容器7的示意圖。圖2 ii)示出放入具有多孔板13的柱室2中的柔性容器7。圖2 iii)示出在施加液體之后的色譜柱，其具有在柱室中充填且使柔性容器膨脹的此時(shí)溶脹的顆粒6。圖3示出具有在管狀柱室8中的干燥可溶脹顆粒5的色譜柱14的示意圖，管狀柱室8具有剛性管壁9、柔性多孔端件10且裝配到剛性殼體11中，剛性殼體11具有與多孔端件10接觸的多孔板13和流體分配器12。圖4為實(shí)施例的流程圖，其中步驟a)包括將干燥顆粒轉(zhuǎn)移到色譜柱，步驟b)包括關(guān)閉色譜柱，并且步驟c)包括將液體供應(yīng)到色譜柱。圖5為實(shí)施例的流程圖，其中步驟a)之前為步驟a’)，該步驟包括確定干燥顆粒的液體吸收率，并且從液體吸收率決定將轉(zhuǎn)移到色譜柱中的顆粒量。圖6為實(shí)施例的流程圖，其中步驟c)之前為步驟C，)，該步驟包括振動(dòng)色譜柱。圖7示出了用于色譜柱的折合塔板高度A和不對(duì)稱因子As的計(jì)算。實(shí)例 梓效率測(cè)試
將示蹤劑(丙酮2% v/v去離子水溶液)作為具有色譜柱體積的1-1. 5%的體積的示蹤劑施加，以分析柱出口處的停留時(shí)間分布(在280 nm下的UV信號(hào))。停留時(shí)間分布應(yīng)表示為單峰，參見圖7。下面描述評(píng)估。柱效率通常由兩個(gè)參數(shù)限定
在色譜柱上的峰展寬由等價(jià)的理論塔板數(shù)(平衡級(jí))描述 峰對(duì)稱性由峰不對(duì)稱因子As描述
相對(duì)峰寬定義為(理論)塔板數(shù)N、理論塔板當(dāng)量高度HETP或優(yōu)選地折合塔板高度h :
權(quán)利要求
1.一種用于利用干燥可溶脹顆粒填充色譜柱(I)的方法包括如下步驟a)將一定量的所述干燥可溶脹顆粒(5)轉(zhuǎn)移到所述色譜柱中的柱室(2)，所述量足以提供所述柱室體積的約105-120%的液體中的溶脹體積Vs’ b)關(guān)閉所述色譜柱，并且c)將所述液體提供到所述色譜柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還包括在步驟a)之前，確定所述干燥可溶脹顆粒的液體吸收率fe/ /并從所述液體吸收率決定將轉(zhuǎn)移到所述柱室的干燥可溶脹顆粒的量的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述液體吸收率以小于5%的變異系數(shù)確定。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括在步驟c)之前使所述色譜柱經(jīng)受振動(dòng)的步驟。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟c)中，所述液體沿上流方向被提供到所述色譜柱。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟c)中，液體的加入速率不超過所述顆粒的所述毛細(xì)管抽吸速率。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟a)包括首先將所述干燥可溶脹顆粒轉(zhuǎn)移到柔性容器(7)，然后將所述柔性容器放入所述柱室(2)中。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟a)包括將所述柱室(8)轉(zhuǎn)移到剛性殼體(11)，所述剛性殼體(11)在所述凝膠溶脹和/或所述色譜柱操作期間為所述柱室提供尺寸穩(wěn)定性。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括在步驟c)之前對(duì)具有所述干燥可溶脹顆粒的色譜柱或柔性容器進(jìn)行輻射消毒的步驟。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，提供到具有所述干燥可溶脹顆粒的色譜柱的液體包括至少一種生物分子，例如生物藥品。
11.一種包括干燥可溶脹顆粒的色譜柱，其中，顆粒的量足以提供所述柱室體積的約105-120%的水性液體中的溶脹體積Ks。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的色譜柱，其特征在于，所述液體為O.IM的20°C下的水性NaCl。
13.根據(jù)權(quán)利要求11-12所述的色譜柱，其特征在于，所述干燥可溶脹顆粒的所述液體吸收率Vs/md{在O. IM的20°C下的水性NaCl中)在5與25ml/g之間，例如在5與15ml/g之間。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述干燥可溶脹顆粒在蒸餾水中的液體吸收率比在O. IM水性NaCl中的液體吸收率的I. 5倍小。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14所述的色譜柱，其特征在于，所述柱體積為固定的。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述色譜柱包括具有所述干燥可溶脹顆粒(5)的柔性容器(7，8)。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-15中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述色譜柱包括至少一個(gè)管狀柱室(8)，所述至少一個(gè)管狀柱室(8)具有至少一個(gè)剛性管壁(9)和至少一個(gè)柔性端件(10)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的色譜柱，其特征在于，所述管狀柱室安裝在剛性殼體(11)中。
19.根據(jù)權(quán)利要求11-18中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述色譜柱包括模制或擠出部件。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-19中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述干燥可溶脹顆粒包括交聯(lián)瓊脂糖。
21.根據(jù)權(quán)利要求11-20中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述干燥可溶脹顆粒包括帶電配體。
22.根據(jù)權(quán)利要求11-21中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述干燥可溶脹顆粒包括具有疏水性官能團(tuán)的配體。
23.根據(jù)權(quán)利要求11-22中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述干燥可溶脹顆粒包括親和配體。
24.根據(jù)權(quán)利要求11-23中的任一項(xiàng)所述的色譜柱，其特征在于，所述液體包括至少一種生物分子,例如生物藥品。
25.—種包括根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)制備的溶脹顆粒的色譜柱。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的色譜柱，其特征在于，所述折合塔板高度A小于15，例如小于10。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的色譜柱，其特征在于，所述不對(duì)稱因子As小于3，例如小于2. 5。
28.根據(jù)權(quán)利要求11-27中的任一項(xiàng)所述的至少兩個(gè)色譜柱，其特征在于，所述至少兩個(gè)色譜柱由同一批干燥可溶脹顆粒制備。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的至少兩個(gè)色譜柱，其特征在于，所述至少兩個(gè)色譜柱并聯(lián)連接。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-29中的任一項(xiàng)所述的至少一個(gè)色譜柱用于分離諸如生物藥品的至少一種生物分子的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的用途，其特征在于，所述生物分子或生物藥品為蛋白質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30-31中的任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述生物分子或生物藥品結(jié)合到所述顆粒，并且通過利用洗滌液洗滌而除去至少一種雜質(zhì)。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中的任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，至少一種雜質(zhì)結(jié)合到所述顆粒，并且所述生物分子或生物藥品在流過所述色譜柱的過程中被回收。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于從干燥可溶脹顆粒開始的高效色譜柱的填充方法以及通過該方法填充的色譜柱和該色譜柱在生物分子分離中的用途。在該填充方法中，一定量的干燥可溶脹顆粒被轉(zhuǎn)移到色譜柱，所述量足以提供柱室體積的105-120%的液體中的溶脹體積，色譜柱被關(guān)閉，并且液體被提供到色譜柱。
文檔編號(hào)B01D15/20GK102656452SQ201080058776
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者倫德格倫 B., 哈爾格倫 E., 韋德格倫 H., 沙納加爾 J., 施特里斯貝格-弗里登 K., 格鮑爾 K., 林德 O., 倫門斯 R. 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司