一種核殼式紫外熒光分子印跡材料的制備及材料在磺胺檢測中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種核殼式紫外熒光分子印跡材料的制備及材料在磺胺檢測中的應(yīng)用。該方法以帶FMOC熒光基團(tuán)的以賴氨酸為骨架的熒光功能單體，采用表面聚合方法，以磺胺甲基嘧啶為模板分子，以所合成的賴氨酸基的熒光分子為功能單體，以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，在單分散的直徑為100納米的甲基丙烯酰化的硅球表面聚合上一層約10納米的印跡層。用索氏提取法將材料中印跡的模板分子洗去，得到了對模板分子有熒光猝滅響應(yīng)的熒光分子印跡傳感材料，具有良好的分散性、較快的響應(yīng)速度、穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)，并應(yīng)用于加標(biāo)牛奶中磺胺甲基嘧啶含量的測定，這種方法可以間接將分析物的紫外吸收信號轉(zhuǎn)變?yōu)殪`敏的熒光信號，提高檢測靈敏度，取得較好的回收率。
【專利說明】一種核殼式紫外熒光分子印跡材料的制備及材料在磺胺檢 測中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種紫外熒光基團(tuán)功能化的核殼式熒光分子印跡聚合物的制備 方法，屬功能納米材料制備【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003]抗生素濫用而導(dǎo)致的抗生素殘留無疑是對致病菌抗藥能力的"加速進(jìn)化"，"抗藥 病菌"很大程度上就是抗菌藥物濫用催生出來的。如果這種情況繼續(xù)蔓延惡化下去，很可能 使人類面臨感染時無藥可用的境地。目前對食品中殘留抗生素的檢測已建立起多種儀器的 分析方法，但是都必須借助精密昂貴的儀器，操作處理費(fèi)時費(fèi)力，不適于現(xiàn)場和快速分析， 因此，研制開發(fā)便捷、快速、靈敏檢測抗生素殘留的方法和材料有重要現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 分子印跡一般是指對某種或某類模板分子有專一吸附能力的聚合物材料，其傳統(tǒng) 制備方法是將模板分子與聚合原料混合自組裝后進(jìn)行共聚合，將模板分子印跡包埋到聚合 基質(zhì)中，再將模板分子洗脫后，在材料中就留下了官能團(tuán)和尺寸大小與模板分子相匹配，具 有特異識別功能的印跡孔穴，可以在復(fù)雜的基質(zhì)環(huán)境中專一的吸附模板分子。其識別過程 類似于生物系統(tǒng)的"抗原抗體"識別機(jī)制，并且具有穩(wěn)定性好(耐高溫、耐酸堿、耐高壓、耐 有機(jī)溶劑等生物不良環(huán)境)、使用時間長(可再生循環(huán)使用）、制備簡單等特點(diǎn)，在目標(biāo)分子 識別、樣品前處理、催化合成、藥物載體等方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景(泛6皿5bc.TfeK, 2011, 40，2922-2942)。
[0005]近年來，把可對模板分子的吸附行為產(chǎn)生信號響應(yīng)的傳感單元引入到分子印跡材 料中，將印跡材料的選擇吸附能力、抗干擾能力和傳感單元的靈敏檢測能力相整合，不需將 印跡材料吸附的分析物解吸下來再用復(fù)雜儀器檢測，實(shí)現(xiàn)模板分子的富集檢測一體化，是 功能分子印跡研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。熒光檢測技術(shù)具有靈敏度高，檢測速度快的優(yōu)點(diǎn)。若 在分子印跡的印跡孔穴中包埋能跟模板分子產(chǎn)生熒光響應(yīng)的熒光基團(tuán)，使得材料在吸附模 板分子前后產(chǎn)生熒光信號的變化，通過對這一傳感信號的監(jiān)測就能實(shí)現(xiàn)直接對目標(biāo)分子的 快速定量檢測。
[0006]目前，大多突光印跡材料都以量子點(diǎn)或雜化的量子點(diǎn)為突光傳感單元，其制備過 程大多較為繁瑣，并且由于量子效應(yīng)的尺寸限制，所制備的量子點(diǎn)內(nèi)核大都粒徑較小，表面 能高，在修飾印跡層時材料容易團(tuán)聚，影響最終所得印跡材料的分散性和光學(xué)穩(wěn)定性（/P5T Adv.，2014, 4，2764 - 2771 )(Biosensors and Bioelectronics 2014, 57, 310 - 316 )，進(jìn)而影響檢測結(jié)果的重現(xiàn)性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于上述，本發(fā)明的目的旨在提供一種核殼式紫外熒光分子印跡材料的制備方 法。該方法制備的熒光分子印跡材料具有更好的分散性、更快的響應(yīng)速度、更穩(wěn)定的光學(xué)性 質(zhì)，是一種分散性好，印跡層薄、形貌均一、具有靈敏熒光檢測功能的分子印跡材料。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于紫外熒光分子印跡材料在加標(biāo)牛奶中磺胺甲基嘧啶檢測 中的應(yīng)用。即在外熒光分子印跡材料印跡孔穴中包埋有能跟模板分子產(chǎn)生熒光響應(yīng)的熒光 基團(tuán)，使得印跡材料在吸附模板分子后產(chǎn)生熒光信號的猝滅，通過體系熒光猝滅量和溶液 中模板分子濃度間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)對加標(biāo)牛奶中磺胺甲基嘧啶的快速定性定量檢測。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 紫外熒光功能單體N-芴甲酯甲?；?N-甲基丙烯?；?賴氨酸甲酯（FMOC-Lys-MC)的 制備 a)將N-芴甲酯甲酰基-N-叔丁酯甲?；?賴氨酸（FMOC-Lys-BOC)加入到40ml氯 化氫氣體飽和的甲醇中，室溫?cái)嚢?小時后抽濾，用甲醇洗滌干燥得到FM0C保護(hù)的賴氨酸 甲酯鹽酸鹽； b) 將脫完B0C的原料加入到無水二氯甲烷中（DCM)，再在上述溶液中加入甲基丙烯酰 氯后滴加無水三乙胺（TEA),原料摩爾比依次為3mmol:3. 3mmol:6mmol,反應(yīng)1小時結(jié) 束，加入DCM稀釋，然后依次用pH=l的鹽酸和飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后 濃縮過柱子（乙酸乙酯：石油醚=1:2)，旋干得到N-芴甲酯甲?；?N-甲基丙烯?；?賴氨 酸甲酯（FMOC-Lys-MC)白色晶體； 熒光分子印跡FMIP的制備 c) 制備甲基丙烯?；耐耷蜉d體：將乙醇、水、氨水按體積比80ml:6ml:3ml混勻 后，攪拌下滴加正硅酸四乙酯（TE0S)，室溫反應(yīng)8小時后乙醇離心洗滌2次，然后將所得裸 硅球分散到乙醇中，加入水和氨水，攪拌下滴加甲基丙烯?；籽趸柰椋∕PS)，反 應(yīng)12小時后用乙醇離心洗滌3次，50°C真空干燥，得到甲基丙烯?；墓枨颍洳卮?； d) 將聚合原料模板分子磺胺甲基嘧啶（SMZ)、熒光功能單體FMOC-Lys-MC、交聯(lián)劑 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA)、引發(fā)劑偶氮二異丁腈（AIBN)按摩爾比0. 15mmol:0. 15 mmol: 1.5mmol:0. 06mmol分批加入到乙腈中，鼓氮?dú)夂笫覝財(cái)嚢?小時超聲均勻，再加入 甲基丙烯酰化硅球的乙腈溶液，鼓氮?dú)?分鐘后60°C攪拌反應(yīng)20小時，在甲基丙烯?；?硅球表面聚合上一層印跡層； e)將d)步驟所得材料分別用乙醇、乙腈離心洗滌1次，然后用甲醇：醋酸=8:1)混合 液進(jìn)行索氏洗滌，直至上清液沒有模板分子SMZ的紫外吸收，60°C下真空干燥，得到了對模 板分子有熒光猝滅響應(yīng)的熒光分子印跡傳感材料（FMIP)。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果： 本發(fā)明克服以量子點(diǎn)為傳感單元制備熒光印跡材料時制備流程繁瑣、材料易團(tuán)聚的缺 點(diǎn)，以簡單的氨基酸衍生物為傳感單元，以尺寸稍大的單分散硅球?yàn)檩d體，將分子印跡技術(shù) 和熒光檢測方法相結(jié)合，制備了對溶液中磺胺甲基嘧啶抗生素有熒光猝滅檢測能力的傳感 印跡材料。用透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、熱重分 析等證明了這種熒光分子印跡材料的成功制備，所得的材料分散性好、形貌均一、響應(yīng)速度 快（30分鐘內(nèi)可達(dá)響應(yīng)平衡)、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有易制備，成本低的特點(diǎn)。用該材料通過 Stern-Volmer猝滅方程建立了體系熒光強(qiáng)度與磺胺甲基嘧啶濃度的線性關(guān)系，將該材料 初步應(yīng)用到實(shí)際樣品中磺胺甲基嘧啶抗生素的檢測，應(yīng)用于加標(biāo)牛奶中磺胺甲基嘧啶含量 的測定。對于紫外吸收在267nm左右的磺胺甲基嘧啶，這種方法可以間接將分析物的紫外 吸收信號轉(zhuǎn)變?yōu)殪`敏的熒光信號，產(chǎn)生熒光猝滅響應(yīng)，提高檢測靈敏度。在牛奶基質(zhì)中，該 檢測方法熒光猝滅標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0. 5i!M- 20i!M，最低檢測限為98. 4nM( 26. 0 ng/ml)具有快速便捷檢測磺胺抗生素的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為FMOC-Lys-MC熒光功能單體的反應(yīng)步驟示意圖。
[0012] 圖2a、b分別為所制備熒光功能單體FMOC-Lys-MC的H1譜和C13譜圖。
[0013]圖3為所制備熒光功能單體的質(zhì)譜圖。譜圖中451.17為熒光功能單體 FMOC-Lys-MC(分子量為450. 22)的+H分子尚子峰。
[0014] 圖4為所制備材料的電鏡表征圖。其中a、b、c分別為娃球載體的15000倍透射 電鏡圖、200000倍透射電鏡圖、掃描電鏡圖。d、e、f分別為所制得的核殼結(jié)構(gòu)熒光分子印跡 (FMIP)15000倍透射電鏡圖、200000倍透射電鏡圖、掃描電鏡圖。g、h、i分別為所制得的作 為對照的熒光非印跡材料（FNIP) 15000倍透射電鏡圖、200000倍透射電鏡圖、掃描電鏡圖。
[0015] 圖5a、b、c分別代表硅球載體、FMIP、FNIP的紅外譜圖。
[0016] 圖6a、b、c分別為裸硅球、FMIP、FNIP在(T700 °C范圍內(nèi)的熱重曲線圖。
[0017]圖7為材料在乙腈溶液中的激發(fā)發(fā)射譜圖，其中a、b分別代表FMIP在乙腈中的 激發(fā)譜線（Em=304)、FMIP在乙腈中的發(fā)射譜線（Ex=267);c、d分別代表FNIP在乙腈中的激 發(fā)譜線（Em=304)、FNIP在乙腈中的發(fā)射譜線（Ex=267);e為模板分子SMZ在乙腈中的紫外 吸收譜線。
[0018] 圖8為材料的乙腈溶液熒光穩(wěn)定性，其中a代表FMIP和FNIP的乙腈溶液熒光強(qiáng) 度隨時間的變化(激發(fā)波長Ex=267nm，發(fā)射波長Em=304nm，激發(fā)-發(fā)射狹縫寬為1. 5-3 )， b代表FMIP和FNIP的純水溶液熒光強(qiáng)度隨時間的變化（Ex=267,Em=304,狹縫寬1. 5-3)。
[0019] 圖9a為5批塊聚合材料在SMZ的ACN溶液中的靜態(tài)吸附量對比，圖9b為5批 塊聚合材料在SMZ的DMF溶液中的靜態(tài)吸附量對比。
[0020] 圖10為FMIP熒光印跡材料和分析物SMZ在溶液中混合后，體系熒光猝滅程度隨 時間的變化示意圖。
[0021] 圖11b為不同濃度FMIP材料乙腈溶液的熒光強(qiáng)度曲線。
[0022] 圖12a為100iig/ml的FMIP乙腈溶液對不同濃度的SMZ響應(yīng)平衡后，各體系的 熒光發(fā)射譜線（Ex=267,Em=304,狹縫寬1. 5-3)。
[0023] 圖13為FMIP和FNIP的熒光檢測選擇性示意圖。
[0024] 圖14a為100iig/ml的FMIP牛奶基質(zhì)溶液跟不同濃度的SMZ響應(yīng)平衡后，各體 系的熒光譜線（Ex=267,Em=318,狹縫寬3-5)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對本發(fā)明再做進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1 制備熒光功能單體：將2. 5g的N-芴甲酯甲酰基-N-叔丁酯甲?；?賴氨酸 (FMOC-Lys-BOC)加入到40ml氯化氫氣體飽和的甲醇中，室溫?cái)嚢?小時后抽濾，用25ml 甲醇洗滌3次后，干燥得到FM0C保護(hù)的賴氨酸甲酯鹽酸鹽。取3mmol脫完B0C的原料加 入到25ml無水二氯甲烷中（DCM)，加入3. 3mmol甲基丙烯酰氯后滴加6mmol無水三乙胺 (TEA)，反應(yīng)1小時結(jié)束，加入25ml無水二氯甲烷（DCM)中稀釋，然后依次用pH=l的鹽酸和 飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后濃縮過柱子純化（乙酸乙酯：石油醚=1:2)， 產(chǎn)物旋干得到N-芴甲酯甲?；?N-甲基丙烯?；?賴氨酸甲酯（FMOC-Lys-MC)白色晶體。 將聚合原料模板分子磺胺甲基嘧啶、熒光功能單體FMOC-Lys-MC、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯 酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈按摩爾比〇. 15mmol:0. 15mmol: 1.5mmol:0. 06mmol分批加入 乙腈中超聲均勻，再加入甲基丙烯酰化硅球的乙腈溶液，鼓氮?dú)?分鐘后60°C攪拌反應(yīng)20 小時，在甲基丙烯?；墓枨虮砻婢酆仙弦粚佑≯E層。
[0026] 合成流程圖如圖1所示，產(chǎn)物核磁和質(zhì)譜表征如圖2、3所示，證明熒光單體 FMOC-Lys-MC的成功合成。產(chǎn)物氫譜、碳譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下： 4NMR(400MHz，CDC13 ) 8 = 7.72 (d，J= 7.5Hz, 2H)，7.63 - 7.51 (m，2H)， 7.36 (t,J= 7. 3Hz, 2H), 7.28 (dd, J= 10.6, 4.3Hz, 2H), 6.30 (s, 1H), 5.85 (d,J= 8. 1Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 5.24 (d,J= 1.6Hz, 1H), 4.49 - 4.28 (m, 3H), 4.18 (t,J= 7. 1Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.27 (dd,J= 13.0, 6.6 Hz, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.88 - 1.63 (m, 2H), 1.53 (dt,J= 13.4, 6.8Hz, 2H), 1.44 - 1. 28 (m, 2H)。
[0027]13CNMR(101MHz,CDC13 ) 8 =173.12, 168.83, 156.34, 143.82, 141.33, 140.14, 127.82, 127.17, 125.21, 120.08, 119.54, 67.08, 53.84, 52.51, 47.18, 39.13, 31.86，29.04，22.62，18.83。
[0028]ESI-MSm/z(M+H+) = 451. 17〇
[0029] 實(shí)施例2 用本體聚合的方法制備5批摻雜不同功能單體的熒光印跡材料(從中篩選出最優(yōu)原料 配比):以摻雜甲基丙烯酸(MAA)功能單體的熒光印跡材料為例，將0. 15mmol模板分子SMZ 和0.45mmol的MAA加入到3ml帶蓋小瓶中，然后加入1.5mlN，N-二甲基甲酰胺（DMF) 溶解，磁力攪拌1h后加入熒光單體FMOC-Lys-MC，鼓氮?dú)夂笫覝財(cái)嚢?小時，放置過夜。然 后依次加入1.5mmol交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA)、6mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈 (AIBN)，鼓氮?dú)夂?0°C攪拌20小時，研磨過篩后索氏洗滌（甲醇：醋酸=8:1)直至上清沒有 模板分子的紫外吸收，60°C下真空干燥待用。此材料編號為M2。Ml的制備步驟與M2相比， 除了不加MAA外，其余完全相同；M3、M4、M5的制備步驟與M2相比，除了將摻雜的MAA依次 換為丙烯酰胺（AM)、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)、4乙烯基吡啶（4-VP)外，其余完 全相同；作為各組對照的非印跡材料N1、N2、N3、N4、N5的制備方法，除了不加模板分子SMZ， 其余與對應(yīng)Ml、M2、M3、M4、M5的制備方法完全相同，通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)篩選出Ml、N1組材 料為最佳原料配比，即模板分子磺胺甲基嘧啶、熒光功能單體FMOC-Lys-MC、交聯(lián)劑乙二醇 二甲基丙烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈的摩爾比為〇. 15mmol:0. 15mmol:1. 5mmol:0. 06 mmol〇
[0030] 實(shí)施例3 制備甲基丙烯酰化的硅球載體：將80ml乙醇、6ml水、3ml氨水混勻后，攪拌下滴加 8ml正硅酸四乙酯（TE0S)，室溫反應(yīng)8小時后乙醇離心洗滌2次，然后將所得硅球分散到 60ml乙醇中，加入0.5ml水和0.1ml氨水，攪拌下滴加1ml的甲基丙烯?；?氧基硅烷（MPS)，反應(yīng)12小時后用乙醇離心洗滌3次，50°C真空干燥，得到2. 28g甲基丙烯 酰化的硅球，冷藏待用。
[0031] 將0? 15mmol模板分子SMZ和0? 15mmol熒光單體FMOC-Lys-MC加入到25ml乙 腈中超聲溶解，鼓氮?dú)夂笫覝財(cái)嚢?小時，然后依次加入1. 5mmol交聯(lián)劑EGDMA、300mg甲 基丙烯?；耷虻?ml乙腈溶液、0. 06mmol引發(fā)劑偶氮二異丁腈AIBN，鼓氮?dú)?分鐘后 60°C攪拌反應(yīng)20小時，在甲基丙烯酰化的硅球表面聚合上一層印跡層；所得材料分別用乙 醇、乙腈離心洗滌1次。然后索氏洗滌（甲醇：醋酸=8:1)直至上清液沒有模板分子SMZ的 紫外吸收，60°C下真空干燥待用。該材料編號為FMIP，作為對照的非印跡材料FNIP的制備 方法與FMIP相同只是不加模板分子SMZ。所得材料電鏡圖如圖4所示，其中a、b、c分別為 硅球載體的15000倍透射電鏡圖、200000倍透射電鏡圖、掃描電鏡圖。d、e、f分別為所制得 的核殼結(jié)構(gòu)熒光分子印跡（FMIP) 15000倍透射電鏡圖、200000倍透射電鏡圖、掃描電鏡圖。 g、h、i分別為所制得的作為對照的熒光非印跡材料（FNIP) 15000倍透射電鏡圖、200000倍 透射電鏡圖、掃描電鏡圖。由圖4b和e、h的透射電鏡圖對比可知經(jīng)過表面聚合反應(yīng)后，在 直徑100nm的單分散娃球載體外成功包覆了約10nm厚的印跡層。
[0032] 圖5中a、b、c分別代表硅球載體、FMIP、FNIP的紅外譜圖。圖5顯示，F(xiàn)MIP(b) 和FNIP(c)譜圖中出現(xiàn)的1730cm'1260cm'1450cnT1峰依次對應(yīng)于交聯(lián)劑EGDMA中羰 基C=0的伸縮振動峰、EGDMA中碳氧單鍵C-0的對稱伸縮振動峰、聚合碳鏈中亞甲基CH2的伸 縮振動峰；2965cnT1峰是C-H的特征振動峰，690cnT1是FM0C基團(tuán)苯環(huán)上的特征峰；同時， 相比于硅球載體（a)，F(xiàn)MIP(b)和FNIP(c)譜圖中3420cm'1100cnT1處的硅羥基Si-〇H 和Si-0-Si特征峰強(qiáng)度減弱，證明聚合印跡層成功包覆在硅球載體上。此外，F(xiàn)MIP(b)和 FNIP(c)圖譜基本一致，可間接證明FMIP中的模板分子基本被洗脫干凈。
[0033] 圖6a、b、c分別為裸硅球、FMIP、FNIP在(T700 °C范圍內(nèi)的熱重曲線圖。從圖6 可以看到，在30-280 °C之間，各材料發(fā)生第一次失重，約為4 %一5 %，這是由材料中物理 吸附的水和溶劑揮發(fā)導(dǎo)致。在280-450 °C之間，材料發(fā)生第二次失重，裸硅球（a)的失重 是由其中殘留的TE0S制備原料分解導(dǎo)致，F(xiàn)MIP(b)和FNIP(c)的失重是由于其表面包覆 的有機(jī)印跡層熱分解導(dǎo)致，失重率分別為40. 20 %和42. 25 %，證明印跡層的成功修飾。印 跡材料與非印跡材料失重率的略微差別可能是由于聚合過程中模板分子存在與否引起的 交聯(lián)度的差異，進(jìn)而導(dǎo)致材料密度差異所造成的。根據(jù)熱重曲線可知，所制備的熒光印跡材 料在低于280 °C條件下都有很好的穩(wěn)定性。
[0034] 圖7為材料在乙腈溶液中的激發(fā)發(fā)射譜圖，其中a、b分別代表FMIP在乙腈中的 激發(fā)譜線（Em=304)、FMIP在乙腈中的發(fā)射譜線（Ex=267);c、d分別代表FNIP在乙腈中的激 發(fā)譜線（Em=304)、FNIP在乙腈中的發(fā)射譜線（Ex=267);e為模板分子SMZ在乙腈中的紫外 吸收譜線。
[0035] 由圖7a、b、c、d譜線對比可看出所制備的FMIP和FNIP材料的激發(fā)、發(fā)射譜線完 全一致，只是強(qiáng)度略有差異，可能是印跡孔穴的有無導(dǎo)致。此外，由于SMZ的吸收譜線（e)與 材料的激發(fā)譜線（a)有很大疊合，當(dāng)模板分子SMZ進(jìn)入材料的印跡空穴后就能吸收其中熒 光基團(tuán)的激發(fā)能量，從而產(chǎn)生熒光猝滅的響應(yīng)信號，為檢測模板分子的濃度奠定了理論基 礎(chǔ)。
[0036] 圖8為材料的乙腈溶液熒光穩(wěn)定性，其中a代表FMIP和FNIP的乙腈溶液熒光強(qiáng) 度隨時間的變化(激發(fā)波長Ex=267nm，發(fā)射波長Em=304nm，激發(fā)-發(fā)射狹縫寬為1. 5-3 )，b代表FMIP和FNIP的純水溶液熒光強(qiáng)度隨時間的變化（Ex=267,Em=304,狹縫寬1. 5-3)。
[0037] 由圖8a可以看出材料在有機(jī)溶劑中具有很好的分散能力，因而在長時間內(nèi)（30 分鐘)熒光信號穩(wěn)定。由圖7b看出材料在水溶劑中隨著時間增長會有一定的沉降，為材料 表面有機(jī)印跡層之間的疏水作用力導(dǎo)致，但是體系在分散開后10分鐘內(nèi)熒光信號是穩(wěn)定 的。
[0038]圖4一8說明成功制備的核殼式紫外熒光分子印跡材料具有分散性良好，光學(xué)性 質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)。
[0039] 試驗(yàn)例1 首先優(yōu)化制備熒光印跡材料的原料配比，將用本體聚合的方法制備5批材料分別在 500yM的SMZ的乙腈(ACN)溶液和DMF溶液中做靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定吸附能力和印跡因子 最優(yōu)的一組，用其原料配比制備核殼結(jié)構(gòu)的熒光分子印跡材料。
[0040] 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)：分別稱取用本體聚合方法制備的10mg的Ml、N1、M2、N2、M3、N3、 M4、N4、M5、N5材料，分別加入5ml濃度為500yM的SMZ乙腈溶液和DMF溶液，室溫下?lián)u床 吸附16小時后離心取上清，稀釋20倍后通過紫外吸光值推算每種材料的單位吸附量。重 復(fù)兩次，最終確定用制備Ml、N1的原料配比制備核殼結(jié)構(gòu)的突光分子印跡材料。吸附實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如圖9所示。其中，圖9a為5批塊聚合材料在SMZ的ACN溶液中的靜態(tài)吸附量對比， 圖9b為5批塊聚合材料在SMZ的DMF溶液中的靜態(tài)吸附量對比。
[0041] 由圖9對比可以看出：聚合材料在乙腈溶劑中吸附效果好，不摻雜普通功能單體 的第一批材料（MIPUNIP1)印跡因子最高，Ml和N1的吸附能力差異最為明顯，所以用制備 Ml、N1的原料配比制備下一步核殼式的熒光分子印跡材料。
[0042] 試驗(yàn)例2 對FMIP的熒光檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，分別確定了檢測的響應(yīng)時間、檢測的材料濃度、檢 測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0043] 1、首先研究材料和分析物到達(dá)熒光響應(yīng)平衡所需的時間，配2ml濃度為125iig/ ml的FMIP乙腈溶液，加入20yl濃度為500yM的SMZ乙腈溶液，在不同時間記錄體系的 熒光值變化(激發(fā)波長Ex=267nm，發(fā)射波長Em=304nm，激發(fā)-發(fā)射狹縫寬為1. 5-3)，重復(fù)3 次。以時間為橫坐標(biāo)，熒光猝滅率為縱坐標(biāo)，最終確定檢測時最佳響應(yīng)時間（材料和分析物 的孵育時間)為30分鐘，如圖10所示。圖10為FMIP熒光印跡材料和分析物SMZ在溶液中 混合后，體系熒光猝滅程度隨時間的變化示意圖。從圖10可以看出：體系熒光的猝滅速度 開始很快，后逐漸趨于定值，由此確定檢測時最佳響應(yīng)時間為30分鐘。
[0044] 2、接著考察材料濃度對等量分析物猝滅率的影響，配2ml濃度為10?150iig/ ml的FMIP乙腈溶液，分別加入20ill濃度為500yM的SMZ溶液，搖床孵育30分鐘后測 各自的熒光猝滅情況（Ex=267nm，Em=304nm，狹縫寬為1.5-3 )。重復(fù)3次，以材料濃度 為橫坐標(biāo)，熒光猝滅率為縱坐標(biāo)，得到不同濃度FMIP材料對相同濃度SMZ的猝滅情況。最 終確定檢測時最佳材料濃度為100Ug/ml，如圖11所示。圖11b為不同濃度FMIP材料乙 腈溶液的熒光強(qiáng)度曲線。從圖11可以看出材料濃度和熒光強(qiáng)度呈很好的線性關(guān)系。圖11 a為不同濃度FMIP材料對等量SMZ分析物的猝滅率曲線，看出材料的量越多，等量SMZ對 其猝滅率越低。在檢測溶液中SMZ濃度時，F(xiàn)MIP材料的用量影響著檢測的線性范圍和靈敏 度，所以應(yīng)兼顧材料的熒光強(qiáng)度和猝滅能力，最終確定檢測時最佳材料濃度為100yg/m。
[0045] 3、然后測定等量材料對不同濃度分析物的猝滅率，建立熒光猝滅率跟分析物濃度 的線性關(guān)系，分別在2ml的100yg/ml的FMIP乙腈溶液中加入不同量的SMZ，使體系中SMZ濃度為1~11yM，搖床孵育30分鐘后測得各自的熒光強(qiáng)度（Ex=267nm，Em=304nm，狹 縫寬為1. 5-3 )，用Stern-Volmer猝滅方程（F^ /F=l+Ksv . [C])對所測峰值進(jìn)行處理，式 中匕為體系初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為體系平衡后的熒光強(qiáng)度，C為體系中分析物濃度（yM/L)， Ksv為猝滅常數(shù)（L/yM)。以分析物濃度為橫坐標(biāo)，猝滅率（匕/F-1)為縱坐標(biāo)，得到FMIP 的熒光猝滅率對SMZ濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖12所示。圖12a為100yg/ml的FMIP乙腈溶 液對不同濃度的SMZ響應(yīng)平衡后，各體系的熒光發(fā)射譜線（Ex=267，Em=304,狹縫寬1. 5-3)， 從圖12可以看出隨著SMZ濃度的增加，體系的熒光逐漸猝滅。圖12b為用Stern-Volmer 猝滅方程處理各譜線峰值后，作圖得到材料的熒光猝滅率對SMZ濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所研 究濃度范圍內(nèi)（1一9yM)具有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)曲方程為FQ/F-1=0. 0426 ?C-0. 012， 相關(guān)系數(shù)為0. 998,根據(jù)空白體系偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率求出在乙腈溶劑中該方法的檢測限 為 463. 5nM( 122. 5ng/ml)。
[0046] 試驗(yàn)例3 對FMIP的熒光檢測選擇性進(jìn)行研究，分別用磺胺類藥物磺胺二甲基嘧啶（SDM)、磺胺 異噁唑（SIZ)以及利巴韋林（RBV)、己烯雌酚（DES)、地塞米松（DEX)、布洛芬（IBU)為對照 物在乙腈中做FMIP的熒光猝滅選擇性實(shí)驗(yàn)。配數(shù)份濃度為100yg/ml的FMIP和FNIP 乙腈溶液2ml，依次分別加入不同量的SMZ、SDM、SIZ、RBV、DES、DEX、IBU溶液，使體系內(nèi)各 分析物濃度依次為1、2、3、5、7yM，搖床孵育30分鐘后檢測各自的熒光猝滅情況（Ex=267 nm，Em=304nm，狹縫寬為1. 5-3 )，分別計(jì)算FMIP和FNIP對各分析物的猝滅常數(shù)Ksv，重復(fù) 3次。結(jié)果如圖13所示。圖13為FMIP和FNIP的熒光檢測選擇性示意圖。圖中表明FMIP 的熒光猝滅常數(shù)均大于非印跡材料FNIP的，而且FMIP對模板分子SMZ的猝滅程度明顯大 于SIZ以及DEX、DES、RBV、IBU，而對SDM，其猝滅率只是略低于SMZ，這是由于SDM與模板 分子SMZ結(jié)構(gòu)極為相似，說明所制備的印跡材料FMIP對模板分子SMZ有較好的選擇結(jié)合能 力，同時看出這種檢測方法具有較好的抗干擾能力。
[0047]試驗(yàn)例4 研究用FMIP對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測： 1、先做FMIP材料在牛奶中對SMZ猝滅的標(biāo)準(zhǔn)曲線：取20ml牛奶兩份，各加入200yl鹽酸和3ml乙腈，渦旋后6000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清，用氫氧化鈉調(diào)為中性后放置10min, 再離心取上清得到除蛋白的牛奶清，用水定容到50ml得到檢測用的牛奶基質(zhì)，用其配 100yg/ml的FMIP的牛奶清溶液，取FMIP的牛奶基質(zhì)溶液數(shù)份，加入不同量的SMZ溶液使 體系中SMZ濃度為1iiM-15iiM，搖床孵育30分鐘后檢測各自熒光（Ex=267nm，Em=318nm， 狹縫寬為3-5)，用Stern-Volmer猝滅方程處理得到FMIP在牛奶基質(zhì)中的猝滅標(biāo)準(zhǔn)曲線， 如圖14所示。圖14a為100yg/ml的FMIP牛奶基質(zhì)溶液跟不同濃度的SMZ響應(yīng)平衡后， 各體系的熒光譜線（Ex=267，Em=318,狹縫寬3-5)。從圖14可以看出隨著SMZ濃度的增加， 體系的熒光逐漸猝滅。圖14b為用Stern-Volmer猝滅方程處理各譜線峰值后，作圖得到 材料的熒光猝滅率對SMZ濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所研究濃度范圍內(nèi)（1一 15yM)具有良好的 線性關(guān)系，在牛奶基質(zhì)中猝滅標(biāo)曲方程為FQ/F-1=0. 0868，C+0. 0111，相關(guān)系數(shù)為0. 9982,根 據(jù)空白體系熒光偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率求出該方法的檢測限為98.4nM/L( 26.0ng/ml) 2、然后檢測加標(biāo)牛奶中SMZ的濃度：取6ml牛奶5份，分別加入0ml、0. 1ml、0. 2ml、 1ml、2ml濃度為50yM的SMZ乙腈溶液后混勻，然后各加入100ill鹽酸，接著分別加入 2ml、l. 9ml、1. 8ml、lml、0ml乙腈渦旋后離心，上清用pH=12的氫氧化鈉溶液調(diào)為中性后 放置10分鐘，再離心除蛋白，取上清后各加入0.5ml濃度為2000iig/ml材料的乙腈溶液， 最后分別用水定容至l〇ml，得到加SMZ標(biāo)濃度分別為0、0. 5、1、5、10iiM，材料濃度均為 100yg/ml的牛奶清溶液，搖床孵育30min后檢測熒光強(qiáng)度（Ex=267nm，Em=318nm，狹縫寬為 3-5)，根據(jù)標(biāo)曲推算出檢測濃度，計(jì)算回收率，重復(fù)3次。結(jié)果見表1。
[0048]表1為用熒光猝滅方法檢測加標(biāo)牛奶中SMZ濃度的結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種核殼式紫外熒光分子印跡材料的制備方法，其步驟是： 紫外熒光功能單體N-芴甲酯甲?；?N-甲基丙烯酰基-賴氨酸甲酯的制備 a)將N-芴甲酯甲?；?N-叔丁酯甲酰基-賴氨酸加入到40 ml氯化氫氣體飽和的 甲醇中，室溫?cái)嚢?小時后抽濾，用甲醇洗滌干燥得到FMOC保護(hù)的賴氨酸甲酯鹽酸鹽； b) 將脫完BOC的原料加入到無水二氯甲烷中，再在上述溶液中加入甲基丙烯酰氯后 滴加無水三乙胺，原料摩爾比依次為3 mmol :3. 3 mmol :6 mmol,反應(yīng)1小時結(jié)束，加入25ml 二氯甲烷稀釋，然后依次用pH=l的鹽酸和飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后濃 縮過柱子，洗脫液為乙酸乙酯：石油醚=1:2,40°C真空旋干，得到N-芴甲酯甲酰基-N-甲基 丙烯?；?賴氨酸甲酯白色晶體； 紫外熒光分子印跡FMIP的制備 c) 制備甲基丙烯?；耐耷蜉d體：將乙醇、水、氨水按體積比80 ml :6 ml :3 ml混勻 后，攪拌下滴加正硅酸四乙酯，室溫反應(yīng)8小時后乙醇離心洗滌2次，然后將所得裸硅球分 散到乙醇中，加入水和氨水，攪拌下滴加甲基丙烯?；籽趸柰?，反應(yīng)12小時后 用乙醇離心洗滌3次，50°C真空干燥，得到甲基丙烯?；墓枨?，冷藏待用； d) 將聚合原料模板分子磺胺甲基嘧啶、熒光功能單體N-芴甲酯甲?；?N-叔丁酯甲 ?；?賴氨酸、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈按摩爾比〇. 15 mmol : 0.15 mmol :1. 5 mmol :0.06 mmol分批加入乙腈中，鼓氮?dú)夂笫覝財(cái)嚢?小時，再加入甲基 丙烯?；枨虻囊译嫒芤海牡?dú)?分鐘后60°C攪拌反應(yīng)20小時，在甲基丙烯酰化的硅球 表面聚合上一層印跡層； e) 將d)步驟所得材料分別用乙醇、乙腈離心洗滌1次，然后用甲醇：醋酸=8:1混合液 進(jìn)行索氏洗滌，直至上清液沒有模板分子SMZ的紫外吸收，60°C下真空干燥；得到了對模板 分子有熒光猝滅響應(yīng)的熒光分子印跡傳感材料（FMIP)。
2. 權(quán)利要求1所制備一種核殼式紫外熒光分子印跡材料在加標(biāo)牛奶中磺胺甲基嘧啶 含量測定中的應(yīng)用。
【文檔編號】B01J20/26GK104277190SQ201410473748
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】張海霞, 于辨非, 張健健, 楊艷杰, 張柯林 申請人:蘭州大學(xué)