本發(fā)明屬于分離介質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種適用于復雜基質(zhì)中對黃曲霉毒素具有特異性分子識別能力的限進介質(zhì)-印跡聚合物的制備方法及其應用。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素（aflatoxins，af）主要由黃曲霉和寄生曲霉在霉變過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有廣泛的污染范圍特別是對農(nóng)產(chǎn)品的污染，如大米、小麥、玉米、大豆、高粱和花生等糧食作物，既可在各種農(nóng)作物、植物及其產(chǎn)品的儲藏、制備與加工過程中產(chǎn)生，也會對以我國傳統(tǒng)的植物性中藥材及其制品造成污染。

黃曲霉毒素對人類和動物的毒性極大而且毒害作用多樣。例如，暴露在黃曲霉毒素中會損害中樞神經(jīng)，心血管和呼吸系統(tǒng)，引起急性和慢性毒性或死亡。動物一旦攝入了被真菌毒素污染的飼料，其乳、肉、蛋中能積累、殘留這些真菌毒素。通過食物鏈的轉(zhuǎn)化，這些被污染的食物進入人或動物的的體內(nèi),會導致突變，畸形和降低免疫力等。

由于黃曲霉毒素對各類食物的嚴重污染和對人類健康的嚴重威脅，已成為全世界關(guān)注的焦點，因此迫切需要建立一種簡單、快速、準確、靈敏、特異、經(jīng)濟的檢測方法去控制和監(jiān)測真菌毒素的污染，保障人類的身體健康。目前已建立的分析檢測方法主要有薄層色譜法、免疫親和柱-高效液相色譜法和紫外、熒光、質(zhì)譜檢測器以及酶聯(lián)免疫吸附試驗。但真菌毒素多為痕量檢測，且受污染的對象基質(zhì)多比較復雜，增大了檢測難度，因此其前處理技術(shù)的好壞在很大程度上決定了檢測結(jié)果的準確與否。

目前黃曲霉毒素的前處理除了液液萃取、固相萃取等傳統(tǒng)方法外，免疫親合柱是常用的樣品前處理方法，但免疫親合柱的凈化效果容易受樣品基質(zhì)、ph、溶劑、鹽濃度等的影響，同時其價格昂貴，難于重復使用，不適宜大面積推廣使用，很大程度上限制了黃曲霉毒素檢測的普及。

新近發(fā)展起來的分子印跡聚合物作為固相萃取柱的填料，以其高選擇性和特異性的吸附能力、重復性高、檢測線低、又不易受樣品基體的干擾的特點，正被逐漸應用到食品中對痕量有毒有害物質(zhì)的前處理過程中，彌補了傳統(tǒng)固相萃取和免疫親和柱的不足。

由于真菌毒素有較強毒性和廣泛傳播性對試驗操作人員有很強的毒性作用，毒素獲取困難，價格昂貴。用毒素本身作模板分子會增加實驗的成本和操作的危險性，所以研究用毒素的結(jié)構(gòu)類似物作為替代模板合成印跡聚合物，避免了其中的模板因未洗脫完全，對目標分析物的檢測造成干擾，降低對實驗人員的傷害，毒素的特異性吸附不會造成太大影響且符合環(huán)境友好的要求。本發(fā)明中采用黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)類似物作為替代模板合成印跡聚合物。

當用固相萃取富集分離復雜基質(zhì)中的小分子毒素目標物時，其中的生物大分子如蛋白質(zhì)、油脂分子等，遇到疏水性反相固相萃取填料時會發(fā)生變性，變性后的大分子物質(zhì)會吸附在填料的表面，嚴重干擾對目標物的分析測定。而限進介質(zhì)作為固相萃取的吸附劑在一定程度上克服了上述不足。限進介質(zhì)是一種外層具有親水性，內(nèi)層具有富集能力的多功能材料，只要對其外表面進行適當?shù)挠H水性修飾，就可保證生物大分子在吸附劑的外表面不會發(fā)生不可逆的變性和吸附，實現(xiàn)對大分子的排阻。本發(fā)明把限進介質(zhì)與分子印跡結(jié)合起來構(gòu)建新的分離體系，使其兼具對小分子選擇性的富集和對大分子的排阻，將具有極為廣闊的應用前景，目前尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對復雜基質(zhì)中存在的痕量黃曲霉毒素，樣品前處理采用傳統(tǒng)的液液溶劑萃取效率低，使用商品化的免疫親和柱凈化效果容易受樣品基質(zhì)、ph、溶劑、鹽濃度等的影響，同時其價格昂貴，難于重復使用等問題，本發(fā)明采用懸浮聚合的方法，擬解決的技術(shù)問題是提供一種適用于復雜基質(zhì)中對黃曲霉毒素具有特異性分子識別能力的限進介質(zhì)-印跡聚合物的制備方法。

本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術(shù)解決方案如下：

在聚乙烯醇溶液中加入替代模板、功能單體、能水解的單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑，加熱攪拌反應，結(jié)束后用水洗去聚乙烯醇，得到印跡聚合物；酸性條件下水解，得到表面羥基修飾的限進介質(zhì)-印跡聚合物，洗去模板分子得到對黃曲霉毒素有選擇性吸附的分離介質(zhì)。所述的替代模板為7-乙酰氧基-4-甲基香豆素、6-甲基-4-苯基-2-色滿酮、香豆素-3-羧酸乙酯、香豆素-3-甲酸乙酯；所述的功能單體為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、氯甲基苯乙烯；所述的能水解的單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯酸縮水甘油酯；所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲醇丙烯酸酯、二乙烯基苯；所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、過氧化苯酰；

所述分離介質(zhì)通過如下步驟制得：

（1）黃曲霉毒素替代分子印跡聚合物的合成：在聚乙烯醇溶液中加入替代模板、功能單體、能水解的單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑，加熱攪拌反應，結(jié)束后用水洗去聚乙烯醇，得到印跡聚合物；所述的替代模板為7-乙酰氧基-4-甲基香豆素、6-甲基-4-苯基-2-色滿酮、香豆素-3-羧酸乙酯、香豆素-3-甲酸乙酯；所述的功能單體為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、氯甲基苯乙烯；所述的能水解的單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯酸縮水甘油酯；所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲醇丙烯酸酯、二乙烯基苯；所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、過氧化苯酰；

（2）限進介質(zhì)-分子印跡聚合物的合成：把（1）制得的印跡聚合物加入到酸的水溶液(1:9,v/v)中水解，反應結(jié)束后，抽濾，洗滌，晾干，得到限進介質(zhì)-分子印跡聚合物；

（3）模板分子的洗脫：把（2）制得的聚合物在索氏提取器用有機溶劑-酸的混合物抽提，洗去模板分子，直到不能檢測出模板分子為止，再用有機溶劑洗去殘留的酸，真空干燥至恒重，得到可以在復雜基質(zhì)體系中對黃曲霉毒素有選擇性吸附的限進介質(zhì)-印跡聚合物。

同時用同樣比例和方法制取非印跡聚合物（不加模板分子）。

步驟（1）中所述的替代模板、功能單體、能水解的單體的比例為1:4～9:3～8。

步驟（1）中所述的模板分子和交聯(lián)劑的比例為1:10～100。

步驟（1）中所述的引發(fā)劑的比例為0.5%～5%，反應溫度為50℃～100℃，反應時間為2小時～48小時。

步驟（2）中，所述的酸為高氯酸。

步驟（3）中，所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈，所述的酸為乙酸，印跡聚合物用有機溶劑和酸混合液去除模板分子，處理后得到對黃曲霉毒素有選擇性吸附的限進介質(zhì)-印跡聚合物。

附圖說明

圖1限進介質(zhì)-分子印跡聚合物（ram-mip）的電鏡掃描圖；

圖2限進介質(zhì)-分子印跡聚合物（ram-mip）的粒徑分布圖；

圖3限進介質(zhì)-分子印跡聚合物（ram-mip）、限進介質(zhì)-非印跡聚合物（ram-nip）和分子印跡聚合物（mip）的熱力學實驗；

具體說明

實施例1

將1.0mmol的6-甲基-4-苯基-2-色滿酮加入裝有10ml的三氯甲烷的燒杯中，超聲使其完全溶解，然后加入6.0mmolα-甲基丙烯酸。用滴液漏斗將其滴加到100ml的聚乙烯醇懸浮液中，充分磁力攪拌2小時后，再分別加入6.0mmol甲基丙烯酸縮水甘油酯、40mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和1.0%的偶氮二異丁腈。超聲5min，待溶液混合均勻，慢慢滴加到三口瓶中，機械攪拌，置于75℃恒溫油浴中，反應8h，高速離心得反應產(chǎn)物。

將聚合物放入沸水中重復洗滌6-10次，直至完全除去聚合物表面的聚乙烯醇。然后用甲醇/乙酸(9∶1，體積/體積)與甲醇清洗反應產(chǎn)物，直到無模板分子洗出為止。晾干后于40℃下真空干燥24h，得到能夠進一步水解的分子印跡聚合物。

將分子印跡聚合物放入到50ml高氯酸水溶液(1:9,v/v)中磁力攪拌24h，然后抽濾，將聚合物依次在200ml的乙醇、丙酮、乙醚中不斷回流洗脫，最后抽慮，晾干，得到限進介質(zhì)-分子印跡聚合物。

限進介質(zhì)-非印跡聚合物的制備方法，除不加模板分子外，其他同上。

實施例2

將1.0mmol的6-甲基-4-苯基-2-色滿酮加入裝有10ml的三氯甲烷的燒杯中，超聲使其完全溶解，然后分別加入6.0mmol的丙烯酰胺，甲基丙烯酸縮水甘油酯，用滴液漏斗將其滴加到100ml的聚乙烯醇懸浮液中，充分磁力攪拌2小時后，再分別加入6.0mmol甲基丙烯酸縮水甘油酯、40mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和1.0%的劑偶氮二異丁腈。超聲5min，待溶液混合均勻，慢慢滴加到三口瓶中，機械攪拌0，置于75℃恒溫油浴中，反應8h，高速離心得反應產(chǎn)物。

將聚合物放入沸水中重復洗滌6-10次，直至完全除去聚合物表面的聚乙烯醇。然后用甲醇/乙酸(9∶1，體積/體積)與甲醇清洗反應產(chǎn)物，直到無模板分子洗出為止。晾干后于40℃下真空干燥48h，得到表面具有親水性的分子印跡聚合物。

將分子印跡聚合物放入到50ml高氯酸水溶液(1:9,v/v)中磁力攪拌24h，然后抽濾，將聚合物依次在200ml的乙醇、丙酮、乙醚中不斷回流洗脫，最后抽慮，晾干，得到限進介質(zhì)-分子印跡聚合物。

實施例3

將1.0mmol的6-甲基-4-苯基-2-色滿酮加入裝有10ml的三氯甲烷的燒杯中，超聲使其完全溶解，然后加入6.0mmolα-甲基丙烯酸。用滴液漏斗將其滴加到100ml的聚乙烯醇懸浮液中，充分磁力攪拌2小時后，再分別加入6.0mmol甲基丙烯酸縮水甘油酯、60mmol的乙二醇二甲基丙烯酸酯和1.0%的劑偶氮二異丁腈。超聲5min，待溶液混合均勻，慢慢滴加到三口瓶中，機械攪拌，置于75℃恒溫油浴中，反應8h，高速離心得反應產(chǎn)物。

將聚合物放入沸水中重復洗滌6-10次，直至完全除去聚合物表面的聚乙烯醇。然后用甲醇/乙酸(9∶1，體積/體積)與甲醇清洗反應產(chǎn)物，直到無模板分子洗出為止。晾干后于40℃下真空干燥48h，得到表面具有親水性的分子印跡聚合物。

將分子印跡聚合物放入到50ml高氯酸水溶液(1:9,v/v)中磁力攪拌24h，然后抽濾，將微球依次在200ml的乙醇、丙酮、乙醚中不斷回流洗脫，最后抽慮，晾干，得到限進介質(zhì)-分子印跡聚合物。

實施例4

研究限進介質(zhì)-分子印跡材料的吸附性能：將10mg的限進介質(zhì)-分子印跡聚合物置于5ml離心管中，分別加入4ml不同濃度(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0μg/ml)的黃曲霉毒素b1的乙腈/水（1:9，v/v）標準溶液，在室溫下靜置10h。準確移取1ml的上清液，高效液相-熒光檢測器測定其吸附后游離黃曲霉毒素的濃度，根據(jù)標準曲線計算黃曲霉毒素b1的濃度，根據(jù)吸附前后毒素濃度的變化計算聚合物的吸附量q。同時平行做分子印跡聚合物和限進介質(zhì)-非印跡聚合物對黃曲霉毒素b1的吸附實驗，即將10mg的分子印跡聚合物和限進介質(zhì)-非印跡聚合物置于5ml離心管中，分別加入4ml黃曲霉毒素b1的乙腈/水標準溶液。隨著黃曲霉毒素b1濃度的升高，吸附容量逐漸增大。在相同濃度下，限進介質(zhì)-分子印跡聚合物的吸附容量大于分子印跡聚合物的吸附容量。