本發(fā)明屬于功能性生物材料制備及其在蛋白質(zhì)識(shí)別及純化中的應(yīng)用，具體的說(shuō)是一種新型的基于金屬螯合作用的分子印跡材料制備及其作為親和純化材料用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的識(shí)別及純化。

背景技術(shù)：

重組蛋白技術(shù)是一種非常重要的、可獲得大量目標(biāo)蛋白的技術(shù)，在蛋白質(zhì)結(jié)晶、蛋白質(zhì)藥物、蛋白質(zhì)相互作用及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有非常重要的作用(T.Hyeon,et al.Adv.Mater.,2010,22,57–60；A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)研究到功能性蛋白質(zhì)表達(dá)與純化工藝的開(kāi)發(fā)，親和標(biāo)簽已經(jīng)成為重組蛋白純化的一個(gè)重要且有效的工具，其中組氨酸標(biāo)簽具有標(biāo)簽短小、不影響蛋白構(gòu)象及功能、表達(dá)暴露于蛋白表面、親和力強(qiáng)、易于純化等優(yōu)點(diǎn)，是目前重組蛋白純化中使用最廣泛親和標(biāo)簽。

目前組氨酸標(biāo)簽蛋白一般采用固定化金屬離子親和色譜(IMAC)進(jìn)行分離純化，即通過(guò)IMAC材料上的金屬離子與組氨酸標(biāo)簽之間的螯合作用實(shí)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白的捕獲，隨后利用競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑或低pH洗脫液洗脫，使組氨酸標(biāo)簽蛋白特異性洗脫，實(shí)現(xiàn)其純化。然而，由于IMAC材料上金屬離子暴露在材料表面，任何可與金屬離子產(chǎn)生螯合作用的蛋白質(zhì)均可被捕獲在IMAC上，如表面富含組氨酸、半胱氨酸、賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)。另外，含有金屬離子的蛋白質(zhì)也可被IMAC捕獲(A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。這些蛋白質(zhì)的吸附會(huì)導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽純化純度大幅降低，為達(dá)到所需純度必須進(jìn)行后期的二次甚至三次純化(J.K.Shea,etal.J.Am.Chem.Soc.,2014,136,1194-1197)，純化步驟越多，純化回收率越低，相對(duì)應(yīng)的純化成本也大幅增加。因此，開(kāi)發(fā)新型的組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化材料意義重大。

分子印跡技術(shù)是通過(guò)人工合成方法制備對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識(shí)別材料的技術(shù)(M.J.Whitcombe,et al.Chem.Soc.Rev.,2011,40,1547–1571；J.K.Shea,et al.Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,2392–2396)。以目標(biāo)分子或者目標(biāo)分子上特異性區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行印跡，去除模板后形成的印跡位點(diǎn)具有與目標(biāo)分子匹配的形狀及互補(bǔ)的相互作用力，可以對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識(shí)別。與天然的分子識(shí)別系統(tǒng)相比，如抗體，分子印跡材料不僅選擇性高，還具有環(huán)境耐受性強(qiáng)，重復(fù)利用性好等優(yōu)勢(shì)。

因此，我們選擇IMAC材料作為基質(zhì)材料，以組氨酸標(biāo)簽為模板，通過(guò)分子印跡技術(shù)在IMAC材料表面形成組氨酸標(biāo)簽的分子印跡層。由于分子印跡層的阻擋作用，不含組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)無(wú)法靠近IMAC材料上的螯合位點(diǎn)；而組氨酸標(biāo)簽與印跡位點(diǎn)具有匹配的形狀及相互作用力，因此可以進(jìn)入印跡位點(diǎn)， 進(jìn)而被螯合位點(diǎn)底部的金屬離子螯合捕獲。通過(guò)結(jié)合金屬螯合的強(qiáng)親和力及分子印跡的高選擇性，制備得到了新型的組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化材料，并實(shí)現(xiàn)了組氨酸標(biāo)簽蛋白的高純度純化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

選擇表面固載了金屬離子的基質(zhì)材料，以組氨酸標(biāo)簽為模板分子，利用金屬螯合作用將模板分子固載于基質(zhì)材料表面，通過(guò)功能單體的聚合形成分子印跡層，去除組氨酸標(biāo)簽?zāi)０搴笮纬苫诮饘衮献饔玫慕M氨酸標(biāo)簽分子印跡材料；并且將該材料用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的親和純化中，該材料可對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白進(jìn)行特異性捕獲、釋放及純化。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

將組氨酸標(biāo)簽?zāi)０逋ㄟ^(guò)金屬螯合作用固載于表面固載了金屬離子的基質(zhì)材料表面，通過(guò)功能單體的聚合反應(yīng)在基質(zhì)材料表面形成聚合物層；隨后利用競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑或低pH洗脫液進(jìn)行洗脫，使模板分子得以洗脫，形成印跡位點(diǎn)，得到分子印跡材料。

具體步驟為：

(1)在基質(zhì)材料表面通過(guò)化學(xué)修飾引入金屬螯合配基，如IDA、NTA、DPA、OPS、多巴胺等，利用金屬螯合配基與金屬離子的螯合作用，將金屬離子(如Cu²⁺，Ni²⁺，Co²⁺)固載于基質(zhì)材料表面。

(2)在室溫條件下，在上述基質(zhì)材料中加入組氨酸標(biāo)簽?zāi)０迦芤?，室溫下反?yīng)，使模板固載于基質(zhì)材料表面。

(3)隨后將上述固載了模板的基質(zhì)材料與功能單體分散于聚合溶劑中，加入引發(fā)劑，攪拌情況下進(jìn)行聚合；聚合溶劑可以是甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基甲酰胺(NMP)、水及上述溶劑以任意比例混合所得的混合溶劑。

(4)聚合完成后，反復(fù)用20mM-2000mM的競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑或者pH為0-7的洗脫液清洗聚合物材料，使其中的模板分子洗脫出來(lái)，直至洗脫液中檢測(cè)不出模板分子，進(jìn)而得到基于金屬螯合作用的分子印跡材料(MIP)；競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑可以是咪唑、組氨酸、半胱氨酸、賴(lài)氨酸及含有上述基團(tuán)的化合物等。

(5)在基質(zhì)材料上不固載模板分子，通過(guò)上述相同的步驟制備得到非印跡微球1(NIP1)。

(6)在基質(zhì)材料上只固載金屬離子，不進(jìn)行后續(xù)印跡過(guò)程，制備得到非印跡材料2(NIP2)。

(7)將該分子印跡材料用于生物分析、生物化工、生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)組氨酸標(biāo)簽蛋白的選擇性捕獲、釋放及純化。

所述金屬螯合作用，是指：固載于基質(zhì)材料表面的金屬離子與組氨酸或組氨酸殘基之間的螯合作用；所述的金屬離子是指可提供金屬螯合相互作用的離子，包括Cu2+，Ni2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，Ca2+，Co2+，F(xiàn)e3+，Al3+，Yb3+或Ga3+ 中的一種或二種以上；所述的金屬離子通過(guò)螯合基團(tuán)固載于基質(zhì)材料表面，螯合基團(tuán)包括亞氨基二乙酸基團(tuán)(IDA)、次氨基三乙酸基團(tuán)(NTA)、二甲基吡啶胺基團(tuán)(DPA)、磷酸化絲氨酸基團(tuán)(OPS)，三(2-胺乙基)胺基團(tuán)、多巴胺基團(tuán)或磷酸基團(tuán)中的一種或二種以上。

所述組氨酸標(biāo)簽?zāi)０?，是指：?-50個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基構(gòu)成的肽段，該肽段可通過(guò)化學(xué)合成、重組表達(dá)獲得，也可從天然蛋白中提取。

所述的基質(zhì)材料是指表面可固載金屬離子的無(wú)機(jī)或有機(jī)高分子材料，包括瓊脂糖、磁性顆粒、硅基質(zhì)、金屬氧化物基質(zhì)或丙烯酸酯基質(zhì)中的一種或二種以上；所述的功能單體是指可以聚合形成高分子聚合物的單體，包括丙烯酰胺類(lèi)、硅氧烷類(lèi)、多巴胺、乙烯基類(lèi)、丙烯基類(lèi)或苯乙烯基類(lèi)中的一種或二種以上。

所述的組氨酸標(biāo)簽?zāi)０宓墓梯d方法為：將組氨酸標(biāo)簽?zāi)０灏茨０?基質(zhì)材料的質(zhì)量比1:1000-3000:1000加入基質(zhì)材料的懸浮液中，室溫下反應(yīng)，使組氨酸標(biāo)簽?zāi)０骞梯d于基質(zhì)材料上。

所述的功能單體聚合是指：按功能單體:基質(zhì)材料的質(zhì)量比1:1000-100000:1000將功能單體加入固載了模板的基質(zhì)材料懸浮液中，加入引發(fā)劑，隨后在0℃-200℃下聚合1分鐘-72小時(shí)；上述引發(fā)劑為包括過(guò)硫酸鹽引發(fā)劑、偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、過(guò)硫酸銨/亞硫酸氫鈉氧化還原引發(fā)劑或過(guò)硫酸鉀/亞硫酸氫鈉氧化還原引發(fā)劑中的一種或二種以上。

所述的競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑，是指可與基質(zhì)材料上的金屬離子產(chǎn)生金屬螯合相互作用的任何試劑，包括咪唑、組氨酸、半胱氨酸、賴(lài)氨酸及含有咪唑及吲哚基團(tuán)的化合物、多巴胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、IDA、NTA或DPA中的一種或二種以上。所用的競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑濃度為20mM-5000mM。

所述的低pH洗脫是指在pH為0-7條件下洗脫金屬離子。洗脫過(guò)程中，可單獨(dú)使用競(jìng)爭(zhēng)性螯合試劑和低pH洗脫液，也可二者共同使用。

上述組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化材料在生物分析、生物化工、生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)組氨酸標(biāo)簽蛋白的選擇性捕獲、釋放及純化中可以得到廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明以IMAC材料為基質(zhì)，利用分子印跡技術(shù)制備得到了可用于組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化的新型親和純化材料。通過(guò)表面分子印跡技術(shù)形成組氨酸標(biāo)簽的表面印跡位點(diǎn)，充分結(jié)合了印跡位點(diǎn)高選擇性及IMAC材料的親和性，降低了組氨酸標(biāo)簽蛋白純化時(shí)強(qiáng)非特異性吸附的干擾，提高了純化純度。

(2)本發(fā)明中所得的親和純化材料對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白識(shí)別時(shí)，分子印跡位點(diǎn)與IMAC同時(shí)起作用，識(shí)別時(shí)的親和力是印跡位點(diǎn)的親和性與IMAC的金屬螯合作用的疊加，因此對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白有更高的親和力。

(3)本發(fā)明中IMAC材料外包被一層分子印跡聚合物層，這會(huì)阻礙IMAC 材料上金屬離子向外擴(kuò)散，降低了金屬離子泄露的可能。

(4)本發(fā)明中金屬離子可以被競(jìng)爭(zhēng)螯合試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)洗脫，隨后可用其他種類(lèi)的金屬離子進(jìn)行再生以適用于不同需求的純化。

(5)本發(fā)明基質(zhì)材料、金屬螯合臂、金屬離子及分子印跡聚合物層都具有很好的穩(wěn)定性，因此所制備得到的材料可以重復(fù)利用。

附圖說(shuō)明：

圖1實(shí)施例1制備的基于金屬螯合作用的分子印跡材料(MIP1)的透射電鏡圖。

圖2實(shí)施例1、2、3制備的印記材料和非印記材料對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白純化效果圖。

圖3實(shí)施例1制備的基于金屬螯合作用的分子印跡材料(MIP2)的透射電鏡圖。

圖4MIP2對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白純化效果圖。

圖5MIP3對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白純化效果圖。

實(shí)施例1

基于IDA及Ni²⁺螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡二氧化硅材料(MIP1)的制備

采用法制備單分散性的二氧化硅納米顆粒，參考文獻(xiàn)方法制備表面修飾IDA及Ni²⁺的基質(zhì)材料(L.Zhang,et al.Chem.Commun.,2011,47,3969-3971；L.Zhang,et al.Anal.Chem.,DOI:10.1021/ac5047246)：5g二氧化硅納米顆粒加入100mL GLYMO-IDA溶液中，65℃下反應(yīng)24小時(shí)，將IDA基團(tuán)修飾于二氧化硅材料表面。將5g上述材料加入150mL甲醇中，隨后加入10mLγ-MAPS，于90℃下回流15小時(shí)，在該基質(zhì)材料表面修飾γ-MAPS，以便作為基質(zhì)材料進(jìn)行印跡。隨后將100mg上述材料重新分散于1mL 12mg/mL模板分子組氨酸標(biāo)簽(HHHHHH)的水溶液中(模板分子與上述基質(zhì)材料質(zhì)量比為120:1000)，室溫下孵育2h。4500rpm離心5min收集材料，棄去上清，用水沖洗所得固體，重懸所得固體于20mL乙腈中，加入15mg丙烯酰胺(AAm)，15mg亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)，0.7mg AIBN(功能單體AAm和MBA與基質(zhì)材料的比為300:1000)，通N₂20min后，65℃磁力攪拌反應(yīng)12h，4500rpm離心5min收集材料，棄去上清，收集固體，隨后用250mM咪唑水溶液反復(fù)清洗所得材料，直至高效液相色譜(日立高新chromaster,10×4.6mm，C18柱)檢測(cè)不出洗脫液中的模板分子，真空干燥，得到基于金屬螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡材料(MIP1)。如圖1，所制得印跡材料大小均勻、分散性好，粒徑300-400nm。同時(shí)，DLS粒徑表征及熱重表征均顯示基質(zhì)材料外表面形成了聚合物分子印跡層，層厚約2-3nm，這既保證可形成完整的印跡位點(diǎn)，又降低了印跡位點(diǎn)的傳質(zhì)阻力，使目標(biāo)蛋白能夠在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入識(shí)別位點(diǎn)，達(dá)到吸附平衡。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1用相同的方法，但不加模板分子組氨酸標(biāo)簽(HHHHHH)，制備 得到非印跡材料1(NIP1)。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1用相同的方法，在基質(zhì)材料上只固載金屬離子，不進(jìn)行后續(xù)印跡過(guò)程，制備得到非印跡材料2(NIP2)。

實(shí)施例4

基于IDA及Ni²⁺螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡材料用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化

4mg MIP1用80μL含10mM咪唑的磷酸鹽緩沖液作為上樣緩沖液于4℃下清洗兩次，使MIP1處于上樣環(huán)境。將重組蛋白提取液用上樣緩沖液稀釋至4mg/mL，加200μL于上述預(yù)平衡的MIP1中，4℃下振蕩孵育30min。4800rpm離心10min收集材料，100μL上樣緩沖液洗滌一次，去除未結(jié)合蛋白。30μL含25mM咪唑的磷酸鹽緩沖液作為洗滌緩沖液洗滌2次，30min/次，以去除弱結(jié)合的雜蛋白。30μL含250mM咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫緩沖液洗脫4次，30min/次，洗脫組氨酸標(biāo)簽蛋白，SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物。

作為參照組，與上述步驟相同的操作條件下，分別用NIP1、NIP2代替MIP1對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析。

如圖2，其中1號(hào)泳道(lane1)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2(lane2)為含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞裂解液，泳道3、4、5分別為NIP1、NIP2、MIP1純化后的組氨酸標(biāo)簽蛋白。由于NIP1表面包被了聚合物層，而沒(méi)有分子印跡位點(diǎn)，因此目標(biāo)蛋白很難進(jìn)入金屬螯合位點(diǎn)被捕獲，因此捕獲的目標(biāo)蛋白很少，純度僅為19％(lane 3)；而NIP2表面沒(méi)有聚合物層，金屬螯合位點(diǎn)裸露在外，因此可大量捕獲目標(biāo)蛋白組氨酸標(biāo)簽蛋白，但是同時(shí)也吸附了大量的干擾蛋白，純度為38％(lane 4)；而MIP表面存在分子印跡層，可阻礙干擾蛋白接近螯合位點(diǎn)，降低了非特異性吸附，同時(shí)表面上存在的印跡位點(diǎn)可選擇性地使組氨酸標(biāo)簽蛋白進(jìn)入印跡位點(diǎn)進(jìn)而被捕獲，因此MIP對(duì)目標(biāo)蛋白吸附量較高，而對(duì)非特異性吸附明顯降低，純化純度可提高至65％(lane 5)。

實(shí)施例5

基于IDA及Ni²⁺螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡磁性材料(MIP2)的制備及應(yīng)用

采用溶劑熱法制備包被有硅層的磁性納米顆粒，參考文獻(xiàn)方法制備表面修飾IDA及Ni²⁺的基質(zhì)材料(L.Zhang,et al.Chem.Commun.,2011,47,3969-3971；L.Zhang,et al.Anal.Chem.,DOI:10.1021/ac5047246)：5g二氧化硅包被的Fe₃O₄納米顆粒加入100mL GLYMO-IDA溶液中，65℃下反應(yīng)24小時(shí)，將IDA基團(tuán)修飾于二氧化硅材料表面。將5g該材料加入150mL甲醇中，隨后加入10mLγ-MAPS，于90℃下回流15小時(shí)，在該基質(zhì)材料表面修飾γ-MAPS，以便作為基質(zhì)材料進(jìn)行印跡。隨后通過(guò)甲醇回流的方法，在該基質(zhì)材料表面修飾γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)，以便后續(xù)進(jìn)行印跡。同實(shí)施例1印跡方法，以1.2mg 過(guò)硫酸銨和10ul四乙基二乙胺作為引發(fā)劑，可制得基于IDA及Ni²⁺螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡磁性材料(MIP2)，如圖3所示。同實(shí)施例1，用MIP2代替其中的MIP1純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，純化結(jié)果如圖4示，其中1號(hào)泳道(lane1)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2(lane2)為含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞裂解液，泳道3為MIP2純化后的組氨酸標(biāo)簽蛋白。如圖所示，含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞裂解液(lane2)中組氨酸標(biāo)簽蛋白的含量?jī)H為15％，經(jīng)過(guò)MIP2純化(lane3)，純化組分中組氨酸標(biāo)簽蛋白的純度可達(dá)到80％，體現(xiàn)了MIP2良好的純化效果。

實(shí)施例6

基于NTA及Ni²⁺螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡二氧化硅材料(MIP3)的制備及應(yīng)用

采用法制備單分散性的氨基二氧化硅納米粒子：2g二氧化硅納米顆粒加入100mL甲苯中，隨后加入2mL APTES于120℃下回流36小時(shí)，將氨基修飾于二氧化硅材料表面。2g上述材料分散于40mL甲苯中，于120℃下加入4mLγ-MAPS后回流24小時(shí)。3600rpm下離心10分鐘，收集材料。將上述材料重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入5mL戊二醛，于50℃下反應(yīng)5小時(shí)，3600rpm下離心10分鐘，收集沉淀。用水清洗沉淀3次，隨后將沉淀重懸于50mL磷酸鹽緩沖液中，加入100mg NTA，60℃下反應(yīng)5小時(shí)。3600rpm下離心10分鐘，收集沉淀，用水清洗三次后，將該材料重懸于200mL 1mg/mL NiSO₄水溶液中，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，得到表面固載了Ni²⁺的基質(zhì)材料。用得到的基質(zhì)材料代替實(shí)施例1中的基質(zhì)材料，可制得基于NTA及Ni²⁺螯合作用的組氨酸標(biāo)簽分子印跡磁性材料(MIP3)，其純化結(jié)果如圖5所示，其中1號(hào)泳道(lane1)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2(lane2)為含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞裂解液，泳道3為MIP3純化后的組氨酸標(biāo)簽蛋白。如圖所示，含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞裂解液(lane2)中組氨酸標(biāo)簽蛋白的含量?jī)H為15％，由于MIP3上金屬螯合相互作用與表面印跡層的作用，經(jīng)過(guò)MIP3純化(lane3)，純化組分中組氨酸標(biāo)簽蛋白的純度可高達(dá)90％，充分說(shuō)明了MIP3良好的性能。

實(shí)施例7

基于多巴胺單體的組氨酸標(biāo)簽分子印跡二氧化硅材料(MIP4)的制備

其他條件同實(shí)施例6，制備表面修飾NTA及γ-MAPS的基質(zhì)材料。以多巴胺為功能單體進(jìn)行印跡，聚合1小時(shí)，可制備得到基于多巴胺單體的組氨酸標(biāo)簽分子印跡二氧化硅材料(MIP4)。

實(shí)施例8

基于NIPAAm單體的組氨酸標(biāo)簽分子印跡二氧化硅材料(MIP5)的制備

其他條件同實(shí)施例6，制備表面修飾NTA及γ-MAPS的基質(zhì)材料。以N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)為功能單體進(jìn)行印跡，聚合48小時(shí)，可制備得到 基于NIPAAm單體的組氨酸標(biāo)簽分子印跡二氧化硅材料(MIP5)。

實(shí)施例9

其他條件同實(shí)施例1及實(shí)施例6，用CoSO₄處理表面固載有IDA或NTA的基質(zhì)材料，可將Co²⁺螯合在該材料表面，隨后進(jìn)行后續(xù)印跡過(guò)程，可制備得到基于Co²⁺螯合的組氨酸標(biāo)簽分子印跡親和純化材料(MIP6)。

實(shí)施例10

其他條件同實(shí)施例1，模板固載時(shí)將100mg基質(zhì)材料分散于1mL 1mg/mL HHHHHH溶液中(模板與基質(zhì)材料質(zhì)量比為10:1000)，經(jīng)過(guò)后續(xù)印跡過(guò)程，制備得到親和純化材料(MIP7)。

實(shí)施例11

其他條件同實(shí)施例1，模板固載時(shí)將100mg基質(zhì)材料分散于10mL 20mg/mL HHHHHH溶液中(模板與基質(zhì)材料質(zhì)量比為2000:1000)，經(jīng)過(guò)后續(xù)印跡過(guò)程，制備得到親和純化材料(MIP8)。

實(shí)施例12

其他條件同實(shí)施例1，在100mg固載了模板的基質(zhì)材料中加入0.5mg AAm及0.5mg MBA，經(jīng)過(guò)后續(xù)操作，制備得到基質(zhì)材料與功能單體比例為10:1000的親和純化材料(MIP9)。

實(shí)施例13

其他條件同實(shí)施例1，將100mg固載了模板的基質(zhì)材料重懸與200mL乙腈中，隨后在其中加入2000mg AAm及2000mg MBA，經(jīng)過(guò)后續(xù)操作，制備得到基質(zhì)材料與功能單體比例為40000:1000的親和純化材料(MIP10)。