本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的磁珠的制備方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)的分離純化主要有鹽析、離心、凝膠電泳和親和層析等方法。其中，鹽析、離心和凝膠電泳受限于成本高和效率低等因素，應(yīng)用比較局限。親和層析是將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過(guò)層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中，經(jīng)洗脫即可分離純化。目前，對(duì)于重組蛋白的分離純化，金屬螯合親和層析是最常應(yīng)用的技術(shù)手段。金屬螯合親和層析是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸如組氨酸、色氨酸和半胱氨酸等能與金屬離子發(fā)生特異性吸附，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)。其中的His-tag技術(shù)，就是以4-10個(gè)組氨酸標(biāo)記要分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)，組氨酸殘基帶有1個(gè)咪唑基團(tuán)，能夠與Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺金屬離子螯合從而特異吸附到介質(zhì)上實(shí)現(xiàn)分離。常規(guī)的金屬螯合親和層析介質(zhì)大多是葡聚糖和瓊脂糖，但這兩種層析介質(zhì)制備復(fù)雜，價(jià)格昂貴，且不耐壓，一般僅適合實(shí)驗(yàn)室使用。

作為葡聚糖和瓊脂糖基質(zhì)的替代者，殼聚糖有很多優(yōu)勢(shì)，如資源豐富價(jià)格低，生物相容性好，配基偶聯(lián)方法簡(jiǎn)單，非特異性吸附弱等。殼聚糖是一種天然的堿性多糖，C2位帶有氨基，C3和C6位帶有羥基，可與各種含有醛基的交聯(lián)劑反應(yīng)，因此易于衍生化。目前，對(duì)于殼聚糖應(yīng)用的開(kāi)發(fā)主要集中于廢水處理領(lǐng)域。CN201010610928.3于2011年7月27日公開(kāi)了一種磁性殼聚糖微球的制備方法，將殼聚糖，含F(xiàn)e³⁺，F(xiàn)e²⁺的溶液在酸性條件下混合，然后將該混合液滴加到堿性溶液中進(jìn)行沉淀反應(yīng)，所得沉淀物即為磁性殼聚糖微球。該發(fā)明制得的磁性殼聚糖微球，分布在表層，且對(duì)殼聚糖并未采用交聯(lián)劑增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度，承壓力較差，不適用于蛋白質(zhì)的分離純化，僅適合于污水處理或者用于作為藥物載體。CN201510622284.2于2015年12月23日公開(kāi)了一種糠醛改性交聯(lián)殼聚糖螯合樹(shù)脂磁性顆粒的制備方法，其步驟為：1、以糠醛為原料，殼聚糖為基質(zhì)，制備糠醛改性殼聚糖；2、使用戊二醛為交聯(lián)劑，將糠醛改性殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)，并將其包覆在顆粒表面，得到糠醛改性交聯(lián)殼聚糖螯合樹(shù)脂磁性顆粒。該發(fā)明采用糠醛對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，是為了引入更多的N原子和O原子，增加樹(shù)脂中可以與金屬離子配對(duì)的原子數(shù)量。這種處理辦法對(duì)于處理工業(yè)廢水污染中重金屬離子的回收吸附比較有效，但在金屬螯合親和層析中金屬離子過(guò)多反而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，因此不適用。CN201310257075.3于2013年10月9日公開(kāi)了一種一種咪唑和殼聚糖功能化磁性粒子及其制備方法，由磁粉、油酸、殼聚糖和咪唑等反應(yīng)制得，用于去除工業(yè)廢水中磺酸染料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種適用于工業(yè)化應(yīng)用的蛋白質(zhì)大規(guī)模分離純化的磁性殼聚糖介質(zhì)的制備方法。由于葡聚糖和瓊脂糖樹(shù)脂的機(jī)械強(qiáng)度低不耐壓，以及制備工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴等特點(diǎn)，使得這兩種介質(zhì)不適用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化。同時(shí)，普通的交聯(lián)殼聚糖也存在裝填較大的層析柱時(shí)會(huì)擠壓變形的問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種蛋白純化用磁珠的制備方法。該磁珠是將殼聚糖交聯(lián)在磁粉表面，避免了普通殼聚糖樹(shù)脂的擠壓變形問(wèn)題；顆粒內(nèi)部無(wú)螯合金屬離子也避免了因此而帶來(lái)的問(wèn)題；同時(shí)顆粒帶有磁感應(yīng)性，可以在磁場(chǎng)作用下從溶液中快速分離，便于雜蛋白的清洗與純蛋白的洗脫操作，尤其適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案

本發(fā)明提供一種蛋白純化用磁珠的制備方法，是在磁珠表面構(gòu)建羧甲基化的交聯(lián)殼聚糖包膜；所述羧甲基化交聯(lián)殼聚糖的結(jié)構(gòu)如下：

本發(fā)明提供的蛋白純化用磁珠的制備方法，其過(guò)程為：

1、取殼聚糖、純水、冰醋酸，充分溶解，得殼聚糖溶液；所述殼聚糖溶液中殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.1%-2%；

2、取步驟1所制殼聚糖溶液，加入磁粉，攪拌混勻，加入交聯(lián)劑，加入堿性溶液調(diào)節(jié)PH值至5.5-9.5，此時(shí)能發(fā)生醛胺縮合反應(yīng)，產(chǎn)生交聯(lián)殼聚糖；

3、在攪拌條件下加入NaBH₄，還原亞胺而形成穩(wěn)定交聯(lián)結(jié)構(gòu)；

4、充分洗滌后，往反應(yīng)體系中加入氯乙酸鈉，控制溫度為80-95℃，PH值為8-9，攪拌，此時(shí)產(chǎn)生羧甲基化反應(yīng)，形成可螯合金屬離子的交聯(lián)殼聚糖，即蛋白純化用磁珠；

將所得蛋白純化用磁珠加入螯合金屬離子溶液中，攪拌混勻，加入帶有His-tag的目標(biāo)蛋白混合液，經(jīng)反應(yīng)，目標(biāo)蛋白特異結(jié)合在蛋白純化用磁珠上，采用磁性吸附的方式將所述蛋白純化用磁珠分離出來(lái)，經(jīng)緩沖液洗雜和咪唑溶液洗脫，即得純化后的目標(biāo)蛋白。

步驟2中所述磁粉其規(guī)格為300-1200目；所述交聯(lián)劑為乙二醛或者戊二醛。

本發(fā)明所述蛋白純化用磁珠其改性交聯(lián)殼聚糖的實(shí)現(xiàn)過(guò)程可用反應(yīng)式表示如下：

有益效果

針對(duì)葡聚糖、瓊脂糖和普通交聯(lián)殼聚糖在蛋白質(zhì)大規(guī)模純化方面的不足，本發(fā)明采用以磁粉為內(nèi)核，以改性交聯(lián)殼聚糖為外殼的核殼結(jié)構(gòu)的磁珠，具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，其一是顆粒內(nèi)部為實(shí)心結(jié)構(gòu)，避免了大量的內(nèi)部螯合金屬離子洗脫導(dǎo)致洗脫液中Ni²⁺和Cu²⁺等金屬離子過(guò)多而使目標(biāo)蛋白變性；其二，由于蛋白純化用磁珠具有磁感應(yīng)性，在分離時(shí)，在磁場(chǎng)的作用下可以快速分離，易于操作；最后，由于磁場(chǎng)分離的便捷，渾濁的細(xì)胞破碎液無(wú)需繁瑣費(fèi)事的離心或過(guò)濾處理，而直接用于純化操作，特別適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。

以下實(shí)施例中的磁粉規(guī)格為600目，購(gòu)自靈壽縣宇通礦產(chǎn)品加工廠；殼聚糖脫乙酰度為95%，購(gòu)自桓臺(tái)縣金湖甲殼制品有限公司。

實(shí)施例1

（1）取殼聚糖9g，加純水900ml，攪拌下加入3ml冰醋酸，充分?jǐn)嚢枞芙?，冷卻至4℃，制得殼聚糖溶液；（2）在10L的反應(yīng)體系中，加入磁粉750g、蒸餾水1875ml，加入步驟（1）中所制的殼聚糖溶液750ml，在高速攪拌條件下加入冷的4%的乙二醛溶液37.5ml，充分混勻；（3）加入0.2mol/L的K₂HPO₄溶液220ml，高速攪拌2h；（4）加入（NH₄）₂SO₄ 40g，同時(shí)以1mol/L的NaOH溶液動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)并維持溶液的pH為8.5左右，攪拌2h；（5）加入NaBH₄ 10g，攪拌2h，去除上清液，用5L蒸餾水洗滌2次；（6）加入氯乙酸鈉66g，在85℃，PH8.5的條件下，攪拌2h；（7）經(jīng)以上步驟得到的混合物，用蒸餾水洗滌2次，即得到蛋白純化用磁珠。

取上述蛋白純化用磁珠0.3g（濕），加入0.1mol/l的NiSO₄ 1ml，混勻10min，磁吸去上清，用緩沖液（含0.5mol/LNaCl，20mmol/L 磷酸鹽，PH7.4）洗滌3次（1ml*3），加入含有6His標(biāo)記的青霉素?；傅拇竽c桿菌細(xì)胞破碎液，在4℃恒溫混合10min。磁吸去上清，以1ml 0.5mol/LNaCl溶液（含20mmol/L磷酸鹽，PH7.4）洗滌3次去除雜質(zhì)，最后加洗脫液（含0.5mol/LNaCl和0.5mol/L咪唑，PH7.4）洗脫三次（0.5ml*3），合并洗脫液，得到純化青霉素?；?。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到目標(biāo)蛋白的純度約為95%。

實(shí)施例2mol/L

（1）取殼聚糖9g，加純水900ml，攪拌下加入3ml冰醋酸，充分?jǐn)嚢枞芙?，冷?℃，制得殼聚糖溶液；（2）在10L的反應(yīng)體系中，加入磁粉750g、蒸餾水1875ml，加入步驟一中所制的殼聚糖溶液750ml，在高速攪拌條件下加入冷的4%的戊二醛溶液37.5ml，充分混勻；（3）加入0.2m/L的K₂HPO₄溶液220ml，高速攪拌2h；（4）加入（NH₄）₂SO₄ 40g，同時(shí)以1mol/L的NaOH溶液動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)并維持溶液的pH為8.5左右，攪拌2h；（5）加入NaBH₄ 10g，攪拌2h，去除上清液，用5L蒸餾水洗滌2次；（6）在85℃，PH8.5的條件下，加入氯乙酸鈉66g，攪拌2h；（7）經(jīng)以上步驟得到的混合物，用蒸餾水洗滌2次，即得到蛋白純化用磁珠。

同實(shí)施例1的操作過(guò)程測(cè)試蛋白純化效果，結(jié)果一致。