本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的血液灌流吸附材料的制備方法，特別是涉及一種膽紅素去除用血液灌流樹脂吸附劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：膽紅素(Bilirubin,BR)是膽色素的一種，呈橙黃色，是體內(nèi)血紅素的主要代謝產(chǎn)物。膽紅素是非極性的脂溶性物質(zhì)，難溶于水，但對血漿白蛋白具有很高的親和力。正常人血清中的膽紅素，一種是結(jié)合膽紅素(或稱直接膽紅素)，經(jīng)過肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作用，與葡糖醛酸或其他物質(zhì)結(jié)合；另一種是游離膽紅素(或稱間接膽紅素)，來自紅細胞破壞產(chǎn)生的膽紅素，在血漿中主要與白蛋白結(jié)合而運輸。正常人血漿中的膽紅素很少，當體內(nèi)因內(nèi)源性(血細胞缺陷或異常)或外源性因素(如中毒、急性病等)造成膽紅素生成過多，或因器官組織功能受損導致膽紅素的代謝障礙，可使血漿膽紅素濃度異常升高，成為內(nèi)源性毒素并形成高膽紅素血癥。其特征是在血漿濃度過高時膽紅素可以透過生物膜擴散進入并沉積在組織(包括腦部)中，造成黃疸，嚴重的可引起組織細胞壞死危及生命。血液灌流法是目前可以有效治療高膽紅素血癥的方法之一，其核心是用于去除血液中的代謝物或毒素的吸附材料。血液灌流用的吸附材料主要有活性炭和合成樹脂(包括各類陰離子交換樹脂和大孔吸附樹脂)以及其他類型的吸附劑(新型吸附微球、功能過濾膜、中空纖維等)?；钚蕴课絼﹣碓磸V泛，成本低廉，自身具有較大的比表面積和豐富的孔道，可以快速吸附去除外源性的毒素，但存在血液相容性較差，機械強度低，易發(fā)生脫落，吸附的選擇性差等缺點。合成樹脂是目前使用較多較為成熟的一類血液灌流用吸附劑。其中一類是大孔樹脂類吸附劑，基于交聯(lián)的聚苯乙烯、聚乙烯醇等，利用了大的比表面積和較大的孔徑以及良好的機械性能，通過疏水作用或配合改性后接枝的基團進行膽紅素的吸附，具有吸附量大的優(yōu)點，如國內(nèi)珠海健帆生產(chǎn)的HA型血液灌流器系列產(chǎn)品。大孔樹脂吸附劑的主要問題是對膽紅素的選擇性不強，雖然可以通過改性引入功能基團，如氰基(李乃宏等，中國生物醫(yī)學工程學報，1982,1(1)：40-43)等，但相關(guān)研究(中國專利，公開號CN102049242B)指出其存在蛋白吸附量過高或基團易受污染等問題。另一類是離子交換樹脂吸附劑，主要原理是樹脂吸附劑所帶離子正電荷與膽紅素所帶負電荷的靜電吸引作用，以交聯(lián)聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂為主要載體。目前在膽紅素灌流治療中較成熟的產(chǎn)品有日本可樂麗的BL-300型和旭化成的BRS-350型吸附器，國內(nèi)實現(xiàn)上市銷售的有天津紫波的HB-L-6、河北廊坊愛爾的AR-350吸附柱等。這類吸附劑的主要問題是：(1)現(xiàn)有產(chǎn)品，特別是進口產(chǎn)品價格昂貴，且部分產(chǎn)品治療時間較長；(2)國產(chǎn)膽紅素陰離子樹脂吸附劑產(chǎn)品的吸附率尚低于國外產(chǎn)品的水平，以AR-350為例，對膽紅素吸附率(董明清等，吉林大學學報(醫(yī)學版)，2010,36(01):19)在30％左右，而日本可樂麗的BL-300吸附柱對血漿膽紅素的吸附率可達58.1％(高蕾等.中國血液凈化,2008,11(7):615-617.)。其他類型的膽紅素吸附劑目前鮮有市售商品化的報道，更多的是在實驗室開發(fā)中，尚有較多技術(shù)問題需要解決。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有膽紅素灌流吸附劑技術(shù)中存在的制備工藝復(fù)雜，成本昂貴，產(chǎn)物吸附效率較低等不足，本發(fā)明的目的是提供一種膽紅素去除用的血液灌流樹脂吸附劑的制備方法。本發(fā)明針對膽紅素吸附的特點要求，選取具有一定結(jié)構(gòu)參數(shù)的聚合物微球作為載體，對所選的樹脂載體先通過胺化，接枝具有一定長度的間隔臂，再對間隔臂末端進行季銨化，最后對這種吸附劑包膜聚甲基丙烯酸-β-羥乙酯。該制備方法具有難度低、易于控制的優(yōu)點，獲得的膽紅素去除用的血液灌流樹脂吸附劑具有良好的生物相容性，對血漿中的膽紅素有較好的選擇吸附性，可應(yīng)用于血液灌流治療領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種膽紅素去除用血液灌流樹脂吸附劑的制備方法，具體包括以下步驟：(1)選擇交聯(lián)度4～20％，總平均孔徑10～100nm，粒徑30～80目的交聯(lián)丙烯酸酯聚合物微球作為膽紅素去除用血液灌流樹脂吸附劑的載體；所述的丙烯酸酯聚合物微球選自：丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸縮水甘油酯；(2)對所選擇的樹脂吸附劑的載體表面接枝間隔臂：將上述樹脂吸附劑的載體用大量乙醇和去離子水洗凈并干燥后，加入溶劑中溶脹1-2小時，隨后加入胺化劑進行胺化，升溫至80～120℃，300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌下恒溫反應(yīng)12-18小時后出料，用去離子水洗滌過濾，得到接枝間隔臂的樹脂吸附劑；所述的溶劑選自：二甲基甲酰胺、苯乙酮、二氯乙烷或正丁醇，其與樹脂吸附劑載體的質(zhì)量比為2:1～5:1。所述的胺化劑選自：己二胺、三乙烯四胺或四乙烯五胺，其與樹脂吸附劑載體的質(zhì)量比為1:1～3:1。(3)對上述樹脂吸附劑上所接枝的間隔臂末端季銨化。(4)對步驟(3)獲得的樹脂吸附劑進行表面包膜處理：將洗凈后的樹脂吸附劑與含有甲基丙烯酸-β-羥乙酯單體(HEMA)、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的油相溶液充分混合，再轉(zhuǎn)移到保溫在50-55℃的含有3％氯化鈉與1％明膠的水相溶液中，在300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌條件下，反應(yīng)10-20分鐘，然后升溫至65-70℃反應(yīng)4-6小時，再升溫至75-80℃固化4-6小時。最后將產(chǎn)物濾干，用相對于所述產(chǎn)物3-5倍體積的乙醇與8-10倍體積的去離子水交替清洗3次，過濾；所述的交聯(lián)劑選自：雙甲基丙烯酸乙二醇酯、乙二醇二乙基二烯丙基酯、二丙烯酸-1，4-丁二醇酯或丙烯酸丁酯。所述的引發(fā)劑選自：偶氮二異丁氰、偶氮二異庚腈、過氧化苯甲?；蜻^氧化月桂酰。所述的致孔劑選自：乙酸乙酯、正丁醇、十二醇或它們中的多個。所述的引發(fā)劑與樹脂吸附劑的質(zhì)量比為1:2000～1:4000。所述的HEMA單體與交聯(lián)劑、致孔劑、樹脂吸附劑的體積比為1:0.01～0.02:0.5:2～8。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明選取的樹脂吸附劑的載體屬于丙烯酸酯類交聯(lián)聚合物微球，它們具有表面親水、內(nèi)部骨架疏水的特點，配合優(yōu)選的載體孔結(jié)構(gòu)參數(shù)以及粒徑分布，有利于吸引脂溶性的膽紅素進入吸附劑內(nèi)部；在接枝間隔臂時，本發(fā)明所選的載體避免了一般交聯(lián)聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂常常需要先使用強致癌物氯甲基甲醚或二氯甲醚進行氯甲基化的問題，因此制備工藝除操作難度低易于控制外，還有綠色安全，對環(huán)境友好的優(yōu)點；本發(fā)明在引入間隔臂后對間隔臂末端季銨化，相比現(xiàn)有單純的接枝或季銨化的技術(shù)方式，可以有效的利用空間效應(yīng)和基團的強靜電吸引吸附膽紅素分子，提高膽紅素吸附效率；利用生物相容性良好HEMA為吸附劑包膜，有效的改善了吸附劑的血液相容性。附圖說明圖1是膽紅素標準吸附曲線。圖2是本發(fā)明的6個樹脂吸附劑樣品在吸附試驗過程中不同時間點模擬血漿內(nèi)的膽紅素濃度。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明：實施例一：(1)選擇交聯(lián)度4～20％，總平均孔徑10～100nm，粒徑30～80目的交聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯作為膽紅素去除用高分子樹脂型吸附劑的載體；(2)對所選擇的樹脂吸附劑載體表面接枝間隔臂：稱取上述樹脂吸附劑載體100g，洗凈后置于帶有溫度計、攪拌器的三口燒瓶中，加入200g二甲基甲酰胺溶脹1小時，隨后加入200g己二胺進行胺化，升溫至120℃，在300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌下恒溫反應(yīng)12小時后出料，用去離子水洗滌過濾，得到接枝間隔臂的樹脂吸附劑；(3)對上述樹脂吸附劑上所接枝的間隔臂末端季銨化：將在步驟(2)得到的接枝了間隔臂的樹脂吸附劑放入帶有攪拌器和溫度計的三口燒瓶中，加入10％的NaOH溶液60mL，加入8.16g碘甲烷，水浴保持20℃下反應(yīng)10小時后出料，用5％的鹽酸溶液轉(zhuǎn)型后清洗；(4)對上述獲得的樹脂吸附劑進行表面包膜處理：將洗凈后的樹脂吸附劑與含有50ml甲基丙烯酸-β-羥乙酯單體、1ml乙二醇二乙基二烯丙基酯、25ml正丁醇以及0.05g偶氮二異丁腈的油相溶液充分混合，再轉(zhuǎn)移到含有300ml保溫在50℃的含有3％氯化鈉與1％明膠的水相溶液的三口燒瓶中，在300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌條件下，反應(yīng)20分鐘，然后升溫至70℃反應(yīng)6小時，再升溫至80℃固化6小時。最后將產(chǎn)物濾干，用3-5倍的乙醇與8-10倍去離子水交替清洗3次，過濾。實施例二本實施例的方法與步驟與實施例一基本相同，不同之處在于步驟(1)中：選擇交聯(lián)度4～20％，總平均孔徑10～100nm，粒徑30～80目的交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯作為膽紅素去除用高分子樹脂型吸附劑的載體。實施例三本實施例的方法與步驟與實施例一基本相同，不同之處在于步驟(2)中：加入200g二甲基甲酰胺溶脹1小時，隨后加入300g四乙烯五胺進行胺化。實施例四本實施例的方法與步驟與實施例一基本相同，不同之處在于步驟(2)中：升溫至80℃，在300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌下恒溫反應(yīng)18小時后出料。實施例五本實施例的方法與步驟與實施例一基本相同，不同之處在于步驟(4)中：將洗凈后的樹脂吸附劑與含有25ml甲基丙烯酸-β-羥乙酯單體、0.5ml丙烯酸丁酯、25ml十二醇以及0.05g偶氮二異庚腈的油相溶液充分混合。實施例六本實施例的方法與步驟與實施例一基本相同，不同之處在于步驟(4)中：將洗凈后的樹脂吸附劑與含有100ml甲基丙烯酸-β-羥乙酯單體、1ml雙甲基丙烯酸乙二醇酯、25ml乙酸乙酯與十二醇等體積混合物以及0.1g過氧化苯甲酰的油相溶液充分混合。實施例七：本發(fā)明所述膽紅素去除用血液灌流樹脂吸附劑對膽紅素吸附評價。對實施例一至六制備的膽紅素去除用的血液灌流樹脂吸附劑進行模擬血漿中高濃度膽紅素的吸附評價：(1)樹脂預(yù)處理：將上述實施例一至六制備的樹脂吸附劑依次編號為SP1-SP6，消毒后，用生理鹽水沖洗至中性并濾干，待用。(2)配制試驗用試劑：a)重氮試劑配制(需新鮮配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)：試劑A：1.25g對氨基苯磺酸與15ml濃鹽酸混合，用蒸餾水稀釋至250ml；試劑B：2g亞硝酸鈉溶于100ml蒸餾水，置于冰箱中冷藏；將12ml試劑A與0.4ml試劑B混合即得重氮試劑；b)紫外檢測用緩沖液(UVdetectionbuffer)配制：12ml甲醇與0.4ml蒸餾水混溶；c)模擬血漿的配制：將2g人血清白蛋白溶于PBS緩沖液中，配制成含3.5％白蛋白的模擬血漿；d)膽紅素試劑(Bil.Reagent)的配制：將0.02g膽紅素溶于3ml二甲亞砜(DMSO)和2ml濃度為0.1M的Na2CO3的混合溶液中，用上述配制的模擬血漿稀釋至100ml，以棕色瓶冷藏于冰箱中(配制時避免強光照射，儲存瓶應(yīng)用黑紙包裹)。(3)試驗方法：a)按照表1準備6種不同濃度的標樣用于標準曲線繪制。表1六種不同濃度標樣序號ABCDEF模擬血漿(μl)4003603002001000Bil.Reagent(μl)040100200300400膽紅素濃度(mg/ml)00.020.050.100.150.20b)標準曲線繪制：按照表2將UVdetectionbuffer與重氮試劑以及標樣(或測試樣品)混合配制作為檢測溶液。在黑暗中保持30分鐘，用紫外-可見分光光度計讀取標樣序號B-F在560nm波長處的吸收值(以上述A號標樣作為空白比對，校準光密度零點)，與對應(yīng)的膽紅素濃度繪制標準曲線，如圖1所示。表2膽紅素吸附測定用溶液配制溶液組成體積(ml)UVdetectionbuffer4.2重氮試劑0.4標樣(或樣品)0.2c)樹脂吸附劑樣品對膽紅素吸附率的測定：稱取1g經(jīng)預(yù)處理的待測樹脂吸附劑置于三角燒瓶中，加入30ml的膽紅素試劑，37℃水浴振蕩4小時；根據(jù)不同時間點抽取溶液樣品，測定膽紅素濃度。d)樹脂吸附劑對膽紅素吸附率和吸附效率的計算：吸附率(％)＝(0.20-C)/0.20×100％，吸附效率(mg/g)＝(0.20-C)(mg/ml)×30ml/1g，其中，C＝(A-0.0048)/4.6831，C代表吸附一定時間后模擬血漿內(nèi)膽紅素濃度，A代表吸附一定時間后測得的模擬血漿內(nèi)膽紅素濃度對應(yīng)的紫外吸收值。(4)測試結(jié)果：樹脂吸附劑樣品SP1-SP6對膽紅素的吸附率以及吸附效率測試結(jié)果如表3所示，不同條件下制備的6個樹脂吸附劑樣品對模擬血漿內(nèi)的高濃度膽紅素都具有很高的吸附率和吸附效率，其中實施例一所制備的樣品吸附效果最優(yōu)。上述6個樹脂吸附劑樣品在吸附試驗過程中不同時間點對應(yīng)的模擬血漿內(nèi)剩余的膽紅素濃度如圖2所示，在吸附開始后0.5小時即可使膽紅素濃度下降75％以上，1-2小時以內(nèi)即可達到吸附平衡。表3六種不同樹脂吸附劑樣品對膽紅素的吸附率以及吸附效率(吸附時間：4小時)樣品編號SP1SP2SP3SP4SP5SP6吸附率％93.8787.4690.0283.5991.6586.13吸附效率mg/g5.6325.2475.4015.0155.4995.168根據(jù)上述結(jié)果，選取實施例一制備的樹脂吸附劑樣品SP1，用于高膽紅素血漿的吸附效果評價。將上述SP1樹脂吸附劑樣品嚴格消毒后，用生理鹽水濕潤并裝填于30ml吸附柱內(nèi)，將約300ml高膽紅素血漿在37℃下進行循環(huán)灌流吸附4小時(流速約3ml/分鐘)。灌流吸附試驗后血漿中的總膽紅素濃度從389.61±53.65μmol/L下降至149.92±19.26μmol/L，吸附率為62.2％，直接膽紅素濃度從142.85±64.20μmol/L下降至56.57±30.98μmol/L，吸附率為60.4％，間接膽紅素濃度從246.76±89.45μmol/L下降至81.92±88.30μmol/L，吸附率為67.1％。試驗前后，血漿內(nèi)總蛋白、白蛋白以及球蛋白水平變化率均在5％以下，受到樹脂吸附劑的影響不大。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁1 2 3