本發(fā)明涉及官能化納米膜、該官能化納米膜的制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

透射電鏡術(shù)(tem)是用于分子和分子聚集體的結(jié)構(gòu)表征，尤其是用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的有力方法。為了通過tem確定樣品的結(jié)構(gòu)，將其沉積在足夠薄的使電子透明的膜上。負(fù)染色的生物樣品的tem被廣泛用于篩選樣品以及獲取初步信息。為使生物樣品在電子束的輻射損害中保持穩(wěn)定，往往在低溫下(冷凍tem)將它們包埋在非常薄的玻璃冰薄膜中。

傳統(tǒng)的無定形碳膜經(jīng)常被用作玻璃化的樣品的冷凍tem的支持膜，其厚度為10-15nm。更薄的碳膜機(jī)械性能不穩(wěn)定。更糟糕的是，該無定形碳膜的導(dǎo)電性隨著溫度的下降而下降。這對(duì)在液態(tài)氮或液態(tài)氦的溫度下研究樣品的冷凍tem來說尤其重要，以致薄的碳膜變得完全電絕緣。由于這些不良的電子和機(jī)械性能，在這些溫度下的樣品圖像遭受到非彈性散射、靜電充電和光束引起的運(yùn)動(dòng)的損害，嚴(yán)重限制了可達(dá)到的分辨率(r.henderson,ultramicroscopy1992,46,1)。盡管已開發(fā)出直接電子探測(cè)器，以實(shí)現(xiàn)對(duì)光束引起的運(yùn)動(dòng)的校正，但樣品仍然是最關(guān)鍵的部分。

另外，在常規(guī)的支持膜上的樣品沉淀是相對(duì)沒有選擇性地進(jìn)行的，因此，在研究前，必須對(duì)樣品進(jìn)行富集/純化。對(duì)于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的情況，樣品的富集/純化常常因?yàn)榈捅磉_(dá)率以及純化足夠量的用于冷凍tem的材料存在困難而受阻。如果在樣品制備中必須使用洗滌劑，例如在溶解膜蛋白的單粒子冷凍tem中就存在這種情況，洗滌劑可導(dǎo)致蛋白膜由于減小的表面張力而從有孔的碳膜的孔上脫離，該事實(shí)使問題更為嚴(yán)重。

除無定形碳以外的一些新的最先進(jìn)的支持膜材料在現(xiàn)有技術(shù)的領(lǐng)域中已被知曉。其中，原始石墨烯和石墨烯氧化層已被嘗試作為無機(jī)和生物樣品的tem的支持膜材料(j.c.meyeretal.,nature2008,454,319；r.s.pantelicetal.,j.struct.biol.2011,174,234；r.s.pantelicetal.,solidstatecommun.2012,152,1375；r.s.pantelicetal.,j.struct.biol.2010,170,152)。而石墨烯氧化層為親水的，因此比原始石墨烯更有利于含水生物樣品的制備，但是，石墨烯氧化層僅表現(xiàn)出非常低的導(dǎo)電性，尤其在低溫下。另一方面，原始石墨烯非常疏水，阻礙了其作為冰包埋生物樣品的冷凍tem的支持膜的用途以及其化學(xué)官能化。

另外一個(gè)嚴(yán)重的問題是蛋白質(zhì)與支持膜的非特異性結(jié)合。抑制這種非特異性結(jié)合的非常確定的方法是形成例如由低聚乙二醇(oeg)單元組成的生物排斥性的水凝膠層。這些單元可以通過不同的接枝策略被附著在表面上。在目前的研究工作中，薄的碳納米膜已被蛋白排斥性的聚乙二醇層官能化了(n.etal.,acsappl.mat.interf.2013,5,5129)。

為選擇性地將樣品結(jié)合在這種生物排斥性層上，可以引入選擇性分子標(biāo)記。為此，通常使用具有氨基或者羧酸基團(tuán)的oeg分子來進(jìn)一步官能化水凝膠表面。

通過選擇性分子標(biāo)記使樣品與tem支持膜選擇性結(jié)合的嘗試僅有少數(shù)。目前，蛋白質(zhì)已被結(jié)合在脂質(zhì)層、用親和基團(tuán)官能化的2d蛋白晶體或者抗體，這些脂質(zhì)層、用親和基團(tuán)官能化的2d蛋白晶體或者抗體又被物理吸附到常規(guī)的碳支持膜上(d.f.kellyetal.,j.mol.biol.2008,382,423；g.sharmaetal.,j.struct.biol.2013,181,190；b.g.hanetal.,j.struct.biol.2012,180,249；y.guimeietal.,j.struct.biol.2014,187,1)。這種方法的缺點(diǎn)在于：脂質(zhì)層和2d蛋白晶體對(duì)洗滌劑的敏感性使它們與例如洗滌劑-溶解膜蛋白的結(jié)構(gòu)分析不相容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供官能化納米膜，克服現(xiàn)有技術(shù)中，尤其是目前的生物tem的支持膜中的缺陷。特別地，本發(fā)明還將提供可被用作新型支持膜的官能化納米膜，促進(jìn)和加快通過tem對(duì)生物樣品的高分辨率的結(jié)構(gòu)分析，并能夠從原始混合物中直接和選擇性地分離標(biāo)記的生物分子，從而使樣品可以通過負(fù)染色tem進(jìn)行研究或者直接通過冷凍tem進(jìn)行玻璃化和研究。

進(jìn)一步，本發(fā)明還將提供可釋放冷凍tem的全部潛力的官能化納米膜，這意味著將提供超薄和高度均勻的官能化納米膜，其盡量減小了測(cè)量過程中電子的非彈性散射，具有導(dǎo)電性，并具有用于選擇性結(jié)合生物分子樣品以簡(jiǎn)化樣品制備的特異性生物識(shí)別位點(diǎn)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備官能化納米膜的制備方法。

本發(fā)明的第一個(gè)目的通過官能化納米膜實(shí)現(xiàn)。該官能化納米膜包括：

a)包括納米材料的第一層；

b)包括生物排斥性材料的第二層，該第二層被附著在該第一層的至少一個(gè)面上；以及

c)親和基團(tuán)，其附著在該第二層。

此處所使用的術(shù)語(yǔ)“生物排斥性材料”意味著排斥生物分子，如氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、多糖和/或核酸，的材料或化合物。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“官能化”應(yīng)被理解為納米材料、生物排斥性材料和/或親和基團(tuán)各自的功能基團(tuán)之間的化學(xué)鍵，如共價(jià)鍵、配位鍵、氫鍵、離子或分散(范德華)鍵的形成，優(yōu)選為共價(jià)鍵的形成。

術(shù)語(yǔ)“親和基團(tuán)”意思是與特定的樣品選擇性地結(jié)合的分子殘基或化學(xué)基團(tuán)。這種特定的(生物)識(shí)別動(dòng)機(jī)可導(dǎo)致官能化納米膜和各樣品之間更高程度的親和力。

優(yōu)選地，該第一層由納米材料組成。

優(yōu)選地，該納米材料用作機(jī)械支持。

更優(yōu)選地，該納米材料為納米膜。

優(yōu)選地，該第一層的納米材料選自碳納米膜、石墨烯、石墨烯氧化物、無定形碳膜和硅納米膜、氮化硅或二氧化硅。

本發(fā)明中，“碳納米膜”由厚度小于100nm，優(yōu)選為小于10nm，并優(yōu)選為從有機(jī)前體所形成的納米膜組成。該有機(jī)前體優(yōu)選為包括低分子芳香族化合物，如苯基、聯(lián)苯、三聯(lián)苯、萘、蒽、聯(lián)吡啶、三聯(lián)吡啶、噻吩、二噻吩、三聯(lián)噻吩、吡咯及其組合。該有機(jī)前體優(yōu)選為具有如羥基、氨基或酯基的端基，表現(xiàn)為可能發(fā)生碳納米膜被生物排斥性材料官能化的官能團(tuán)。優(yōu)選地，“碳納米膜”是通過交聯(lián)作用從該有機(jī)前體的自組裝單層(sams)形成的納米膜。

本申請(qǐng)中，作為“硅，氮化硅或二氧化硅的納米膜”，優(yōu)選使用市售的，例如由simpore生產(chǎn)的膜作為tem的支持材料。這些膜具有反應(yīng)性si-oh基團(tuán)，在其上可能發(fā)生生物排斥性材料的共價(jià)結(jié)合。

優(yōu)選地，該無定形碳膜的厚度范圍為3-30nm，優(yōu)選為5-15nm。

更優(yōu)選為，硅、氮化硅和氧化硅的納米膜的厚度范圍為1-15nm，優(yōu)選為4-6nm，更優(yōu)選為5nm左右。

進(jìn)一步，碳納米膜的厚度范圍優(yōu)選為0.5-4nm，更優(yōu)選為0.6-3nm.

在一優(yōu)選實(shí)施例中，官能化碳納米膜的厚度范圍為3-25nm，更優(yōu)選為3-10nm。

更優(yōu)選地，該官能化納米膜材料在厚度和組成上是高度均勻的。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，該官能化納米膜為無支撐式的納米膜。

優(yōu)選地，該包含在第二層的生物排斥性材料至少部分設(shè)置在第二層的表面，優(yōu)選地大致組成第二層的外表面，也就是說，朝向第一層和第二層的交界面的表面。更為優(yōu)選地，第二層為大致由生物排斥性材料組成。

更優(yōu)選地，該生物排斥性材料由聚甘油(pg)、聚乙二醇(peg)、低聚乙二醇(oeg)、肽、蛋白質(zhì)、低聚碳水化合物或兩性離子聚合物組成。

更優(yōu)選地，該親和基團(tuán)為選自特異性識(shí)別對(duì)，優(yōu)選為螯合物/寡聚組氨酸、生物素/(鏈霉)親和素、或特異性dna/rna有義/反義對(duì)中的一種。

根據(jù)本發(fā)明，“特異識(shí)別對(duì)”由兩個(gè)分子基序組成，它們可以在包含幾種分子種類的競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中區(qū)分并彼此結(jié)合。該親和基團(tuán)僅由一個(gè)分子種類，如每個(gè)特定識(shí)別對(duì)的一個(gè)分子基序，組成。

根據(jù)本發(fā)明，“螯合物”為非常穩(wěn)定的復(fù)合物，由多齒配體組成，優(yōu)選為乙二胺四乙酸(edta)、n-氨三乙酸(nta)、或者其衍生物和陽(yáng)離子，如cu²⁺、ni²⁺、fe³⁺以及co²⁺，優(yōu)選為ni²⁺。

本發(fā)明的第二個(gè)目的通過一種制備創(chuàng)造性的官能化納米膜的方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟：

a)提供包括納米材料的第一層；

b)用生物排斥性材料使該第一層官能化，獲得包括該生物排斥性材料的第二層；以及

c)用親和基團(tuán)使該第二層官能化。

優(yōu)選地，步驟b)中的官能化通過接枝工藝進(jìn)行。

更優(yōu)選為，步驟c)中的官能化通過烷化、?；蛘攮h(huán)氧化合物開環(huán)作用進(jìn)行。

優(yōu)選地，由該納米材料組成的該第一層是被支持在tem網(wǎng)格上的納米材料。

本發(fā)明的第三個(gè)目的通過以下手段實(shí)現(xiàn)：將創(chuàng)造性的官能化納米膜作為支持膜，優(yōu)選作為在tem中的支持膜，更優(yōu)選作為在冷凍tem中的支持膜，用于生物分子的結(jié)構(gòu)分析。

更優(yōu)選地，該官能化納米膜被支持在tem網(wǎng)格上。

優(yōu)選地，本發(fā)明可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的tem網(wǎng)格，但更優(yōu)選的，使用純tem網(wǎng)格或者具有多孔碳的分層的tem網(wǎng)格或者具有多孔金的tem網(wǎng)格。

意外地，已發(fā)現(xiàn)該新型的超薄官能化納米膜可被作為用于生物分子的結(jié)構(gòu)分析的tem支持膜，并進(jìn)一步解決有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)中已知的tem樣品制備的問題。其中，該超薄以及高度均勻的官能化納米膜減小了測(cè)量過程中的電子的非彈性散射，從而改進(jìn)了數(shù)據(jù)收集。該官能化納米膜的用途允許標(biāo)記的生物分子直接從原始混合物中分離。因此，該樣品可直接通過冷凍tem被玻璃化和研究。該創(chuàng)造性的官能化納米膜通過可與標(biāo)記的生物分子特異性結(jié)合的親和基團(tuán)實(shí)現(xiàn)自我區(qū)分。另外，該生物排斥性中間層防止了原混合物中不需要的成份與膜的非特異性結(jié)合。進(jìn)一步地，該創(chuàng)造性的納米膜可在無支撐狀態(tài)也可被支撐在tem網(wǎng)格上使用。該新型的工程支持膜作為無支撐的納米膜具有機(jī)械穩(wěn)定性，從而使玻璃化樣品穩(wěn)定。

附圖說明

現(xiàn)通過附圖和詳細(xì)描述對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，可從中獲取進(jìn)一步的特征和優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)注意，以下闡述僅出于說明和描述的目的，而并非旨在窮舉或者將本發(fā)明限定在所公開的精確形式中。

圖1示意性地說明了設(shè)置在支持膜上的碳納米層的化學(xué)納米光刻；

圖2顯示了(a)具有pg作為生物排斥性材料以及edta衍生物作為親和基團(tuán)的官能化碳納米膜、(b)x-射線光電子能譜(xps)、以及(c)無支撐的官能化碳納米膜的低分辨率氦離子顯微鏡(him)圖像。

圖3顯示了使用官能化碳納米膜用于從細(xì)胞裂解物中原位分離/隔離合適標(biāo)記的生物分子的示意圖。

圖4為負(fù)染色的組氨酸標(biāo)記(his-tag)的生物分子特異性結(jié)合在pg和edta官能化的碳納米膜上的tem圖像。

圖5顯示為(a)轉(zhuǎn)移至石墨烯片的碳納米膜(cnm)以及(b)官能化cnm通過石墨烯條紋圖案化。

圖6顯示在安裝于網(wǎng)格上的官能化無定形碳膜上的負(fù)染色的組氨酸標(biāo)記的p.furiosus(嗜熱古細(xì)菌)的熱聚體的tem圖像。

具體實(shí)施方式

圖1顯示為設(shè)置在支持材料上的cnm通過電子輻射或者極端uv(euv)光的化學(xué)納米光刻。芳族的自組裝單層(sam)的電子輻射導(dǎo)致其橫向交聯(lián)((a.turchaninetal.,proc.surf.sci.2012,87,108；w.geyeretal.,appl.phys.lett.1999,75,2401；a.turchaninetal.,langmuir2009,25,7342)。該交聯(lián)將自組裝單層轉(zhuǎn)化為具有一個(gè)分子的厚度的機(jī)械穩(wěn)定的分子納米層，該一個(gè)分子的厚度可在0.5-3nm之間調(diào)整(a.turchaninetal.,acsnano2013,7,6489；us8,377,243b2)。在以硝基為端基的聯(lián)苯sams的化學(xué)納米光刻的情況下，可以在金上的4'-硝基-1,1'-聯(lián)苯-4-硫醇(nbpt)sam中產(chǎn)生交聯(lián)的以氨基為端基的區(qū)域。尤其是，硝基基團(tuán)被還分別還原成可被修飾成用于制備官能化納米膜的氨基基團(tuán)(us6,764,758b1)。

類似的芳族sams的交聯(lián)可以通過euv光獲得。另外，euv通過使用euv干涉光刻(euv-il)為納米圖案化的納米膜的制造開創(chuàng)了新的機(jī)會(huì)。euv-il結(jié)合了平行制作工藝和10nm以下的非常高的分辨率。從分辨率或者吞吐量方面講，euv-il的納米圖案化能力遠(yuǎn)超過光刻、電子束光刻和掃描探針光刻。euv-il可用于制作多種形狀的無支撐圖案化的納米膜。

無支撐的碳納米膜也可被化學(xué)官能化。在有的情況下，甚至可在碳納米膜的第二面上實(shí)現(xiàn)修飾。這些無支撐的雙面碳納米膜常被稱為“janus納米膜”。

圖2顯示為具有pg作為生物排斥性材料以及edta衍生物作為親和基團(tuán)的官能化碳納米膜。已經(jīng)顯示以氨基為端基的交聯(lián)表面不僅能通過接枝工藝表現(xiàn)出生物排斥性，而且可以通過?；饔帽恍揎?。優(yōu)選地，如edta的多齒配體，如edta，被用作能夠可逆地結(jié)合ni²⁺離子的親和基團(tuán)。圖2b顯示原始的官能化碳納米膜(頂部)、用ni²⁺離子孵育的該官能化納米膜(中間)、已經(jīng)用edta溶液去除ni²⁺離子的該官能化納米膜(底部)的xps。xps分析顯示該官能化碳納米膜可逆地結(jié)合ni²⁺離子，這意味著樣品可逆地吸附/脫附成為可能。進(jìn)一步，無支撐的pg和edta官能化納米膜從原始的金基底轉(zhuǎn)移至tem網(wǎng)格上。圖2c顯示為在tem網(wǎng)格上的無支撐的pg和edta官能化納米膜的him圖像。

該創(chuàng)造性的官能化納米膜可作為tem支持膜，通過生物識(shí)別反應(yīng)對(duì)生物分子在其表面進(jìn)行特異性固定。圖3顯示為該創(chuàng)造性的碳納米膜的使用構(gòu)思。僅通過將官能化納米膜浸沒于原料混合物，例如，細(xì)胞裂解物，就可實(shí)現(xiàn)生物分子的選擇性固定。該水凝膠中間層防止了細(xì)胞裂解物組分與納米膜的非特異性結(jié)合。最終組裝適用于通過冷凍tem進(jìn)行玻璃化及隨后的結(jié)構(gòu)分析。

圖4顯示為特異性結(jié)合在被pg和edta官能化的碳納米膜上的負(fù)染色的組氨酸標(biāo)記的生物分子的tem圖像。tem分析顯示，組氨酸標(biāo)記熱聚體分子結(jié)合在官能化碳納米膜上。圖4a顯示為附著在官能化碳納米膜上的負(fù)染色的組氨酸標(biāo)記的pyrococcusfuriosus(嗜熱古細(xì)菌)的熱聚體的tem圖像。圖4c顯示為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的tem圖譜。其顯示為在與未經(jīng)組氨酸標(biāo)記和負(fù)染色的熱聚體一起孵育后的官能化碳納米膜。除了暗色沉積物以外，未見熱聚體顆粒。

圖5顯示為可與石墨烯結(jié)合的官能化碳納米膜，以增強(qiáng)其導(dǎo)電性從而減少在tem測(cè)量時(shí)的樣品充電。圖5a顯示為官能化納米膜沉積在分別制備的石墨烯片上。由于毗鄰(如通過隧穿作用)，在碳納米膜上收集或者形成的電荷可輕易地轉(zhuǎn)移至高度導(dǎo)電的石墨烯片。圖5b中，在cnm的其余部分被功能化之前，例如通過延長(zhǎng)的電子局部處理，將部分碳納米膜轉(zhuǎn)換成石墨烯條紋。在生物分子的tem分析中，通過電接地的石墨烯條紋收集電荷。兩種策略都保持樣品電中性，并通過電荷/電荷相互作用減少散射效果。

圖6顯示在安裝于網(wǎng)格上的官能化無定形碳膜上的負(fù)染色的組氨酸標(biāo)記的p.furiosus(嗜熱古細(xì)菌)的熱聚體的tem圖像。

實(shí)施例

1)碳納米膜(cnm)的形成

在金上，通過由電子輻射引起的4'-硝基-1,1'-聯(lián)苯-4-硫醇(nbpt)sams的交聯(lián)制備cnms。為形成sams，使用在云母上的300nm厚的熱蒸發(fā)金膜。該基底在uv/臭氧清潔劑中清潔，用乙醇漂洗然后在氮?dú)饬髦写蹈伞？墒褂脙煞N方法生成sam。任一個(gè)基底在氮?dú)夥諊轮糜诿芊獾臒恐?，浸沒在～10mmol的由nbpt在脫氣、干燥的二甲基甲酰胺(dmf)中形成的溶液中72小時(shí)。之后，樣品被用dmf和乙醇漂洗，并用氮?dú)獯蹈伞；蛘撸诘陀?0^-5毫巴的真空中，使nbpt從努森池蒸發(fā)至金膜上。在高真空(<5×10^-7毫巴)下通過電子能量為100ev，劑量為50mc/cm²的電子流槍實(shí)現(xiàn)了與cnm的交聯(lián)和硝基基團(tuán)到氨基基團(tuán)的轉(zhuǎn)化。

2)第二層的形成(此處：為聚甘油)

處于在金-云母基底上的cnm被沉淀到盛有10％(w/w)的由縮水甘油在干燥的n-甲基吡咯烷酮(nmp)中形成的溶液的干燥且潔凈的聚四氟乙烯(ptfe)容器中。在ptfe容器緊密關(guān)閉后，在烘箱中將其加熱至150℃保持10小時(shí)。冷卻后，去除膜，用nmp、水、和丙酮清洗，然后在無塵環(huán)境中干燥。

3)用親和基團(tuán)(此處：為edta)將第二層官能化

將乙二胺四乙酸二鈉鹽(na2edta×2h2o，510mg)在干燥的二甲基甲酰胺(dmf，15ml)中分散，加入亞硫酰二氯(0.3ml)。在室溫下攪拌2小時(shí)后，加熱該混合物至80℃并維持45分鐘。冷卻后，該膜系統(tǒng)被立即浸入該反應(yīng)混合物中以50轉(zhuǎn)/分鐘的速率搖晃2小時(shí)。然后取出該膜，并用dmf、乙醇、水和丙酮清洗。在無塵環(huán)境中干燥該膜。

4)剝離膜系統(tǒng)并轉(zhuǎn)移至tem網(wǎng)格

使用溶解在氯苯或乙酸乙酯中的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)保護(hù)層將官能化的cnm轉(zhuǎn)移至tem網(wǎng)格上。該層用于在轉(zhuǎn)移過程中cnm的機(jī)械穩(wěn)定化。將總共厚度約為400nm的的兩層聚合物按順序旋涂在cnm上。首先，將一層低分子量pmma(50k)，然后是一層高分子量pmma(950k)以4000轉(zhuǎn)/分鐘的速率旋轉(zhuǎn)30秒，并在90℃的熱板上固化5分鐘。通過將多層樣品中的一個(gè)邊/角稍微浸入水中，底層云母載體與金/官能化的cnm/pmma結(jié)構(gòu)相分離，從而使該多層樣品最終(在分離后)漂浮在空氣/水界面上。進(jìn)一步，通過使用云母片將樣品從水面轉(zhuǎn)移至i2/ki/h2o蝕刻浴(1:4:10)中，使金膜在15分鐘內(nèi)溶解。然后將cnm轉(zhuǎn)移至純水中，以膜進(jìn)行徹底清潔去除碘污染。最后，cnm/pmma結(jié)構(gòu)由目標(biāo)基底tem網(wǎng)格捕獲，并且使用臨界點(diǎn)干燥器將pmma層溶解在丙酮中從而使無支撐部件的損傷最小化。

5)在官能化cnm上的生物樣品的電子顯微術(shù)(此處：基于edta/ni²⁺/his-標(biāo)記相互作用)

將tem格網(wǎng)上的官能化cnm與3μlnicl2(pbs緩沖液中含有1mg/ml的ni²⁺)孵育30秒，并用蒸餾水漂洗。隨后，將3μl蛋白質(zhì)溶液(源自嗜熱古細(xì)菌的his標(biāo)記的熱聚體，約0.2mg/ml)施加在官能化cnm上處理30秒，用蒸餾水漂洗并用1％鈾酰乙酸鹽溶液負(fù)染色。在feitecnaispirit透射電子顯微鏡中以120kv的加速電壓分析樣品。使用4k×4kccd攝像頭(gatan)拍攝圖像。

6)無定形碳膜的官能化

用氧等離子體處理金-云母基底上的連續(xù)的無定形碳膜。使用在2至10nm范圍內(nèi)的厚度確定的膜。已發(fā)現(xiàn)厚度在4至5nm的膜在機(jī)械穩(wěn)定性和透明度之間表現(xiàn)出有利的平衡。類似于cnms的官能化，將在金-云母基材上的等離子體處理的無定形碳膜沉積在裝有10％(w/w)的由縮水甘油在干燥的nmp中形成的溶液的干燥且清潔的ptfe容器中。在密封ptfe容器后，將其在烘箱中加熱至140℃，保持6-24小時(shí)。冷卻后，取出薄膜，在水中浸漬10分鐘，然后在氮?dú)饬髦懈稍?。舉例來說，通過將基底在含0.1％(w/w)edta單酸酐的無水dmf溶液中加熱至90℃，并保持1小時(shí)，使第二層用edta基團(tuán)官能化。通過改變edta單酸酐的濃度，可以改變表面的官能團(tuán)負(fù)載。將官能化的無定形碳膜按照方案(見實(shí)施例4)轉(zhuǎn)移到tem網(wǎng)格。舉例來說，將膜轉(zhuǎn)移到多孔碳涂層tem網(wǎng)格。類似地，可以實(shí)現(xiàn)向多孔金或多孔/花邊碳涂層或純tem網(wǎng)格的轉(zhuǎn)移。官能化的無定形碳膜可以連接到石墨烯(如圖5中的cnm所示)以增強(qiáng)導(dǎo)電性從而減少在tem測(cè)量中的樣品充電。

7)官能化無定形碳膜上生物樣品的電子顯微術(shù)(此處：基于edta/ni²⁺/his-標(biāo)記相互作用)

為了活化官能化無定形碳膜，3μl的1mm的naoh被加入，吸干，并被蒸餾水洗滌一次。隨后，加入3μl0.1％niso4溶液并放置30秒。樣品被用3μl蒸餾水洗滌兩次。將3μl樣品加入網(wǎng)格中并放置30秒。網(wǎng)格用濾紙吸干。將網(wǎng)格用3μl蒸餾水洗滌兩次，吸干水分，并用醋酸鈾酰染色。在feitecnaispirit透射電子顯微鏡中以120kv的加速電壓分析樣品。

上述說明書，權(quán)利要求書和附圖中公開的特征可以單獨(dú)地或以任何組合形式的用于以各種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。