本發(fā)明屬于分析化學的色譜分析領(lǐng)域，具體涉及一種孔徑可調(diào)的大孔核殼固定相的制備。

背景技術(shù)：

核殼顆粒的制備技術(shù)最早由horvath[horvath,c.g.；preiss,b.a.；lipsky,s.r.anal.chem.1967,39,1422-1428]和kirkland[kirkland,j.j.anal.chem.1969,41,218-220]兩人提出。最初的核殼顆粒的粒徑為50μm左右，表面覆蓋了一層厚度約1μm的殼層。這種顆粒的最大缺點是柱容量偏低。10年前，kirkland制備出了新一代的核殼顆粒，其商品名稱為halo[destefano,j.j.；langlois,t.j.；kirkland,j.j.j.chromatogr.sci.2008,46,254-260]。該顆粒粒徑為2.7μm，殼層厚度則約為0.5μm。對比傳統(tǒng)的核殼顆粒，其柱容明顯增加。更為突出的是，該類型顆粒由于具有較短的傳質(zhì)距離和更為均一的顆粒粒徑分布，因而取得了極高的分離柱效。填充新一代核殼顆粒的分離柱的柱效約為填充了同樣粒徑的多孔顆粒柱的1倍。因而，發(fā)展更多方法制備新型核殼顆粒成為了目前色譜固定相制備領(lǐng)域最受關(guān)注的研究課題。

通常，核殼顆粒采用層層組裝法制備。采用該方法制備核殼顆粒的最大缺點是工藝復雜且耗時。根據(jù)報道，制備厚度為0.5μm的殼層需要40-50步制備工序。為了克服這個缺點，chen等人開發(fā)了一種凝聚法制備核殼顆粒的方法。該法僅需2-3步即可獲得多孔殼層[chen,w.；jiang,k.；mack,a.；sachok,b.；zhu,x.；barber,w.e.；wang,x.j.chromatogr.a2015,1414,147-57]。該方法的主要缺點是制備過程中會生成小顆粒及出現(xiàn)顆粒團聚現(xiàn)象，因而需要額外的顆粒篩分過程。

顆?？讖酱笮∈怯绊懮V分離效率的一個重要指標。顆粒孔徑過小，樣品分子無法進入孔道內(nèi)部與固定相作用，因而分離效率低。目前市售的核殼顆粒的孔徑多為9-12nm。這個孔徑大小可以對小分子化合物實現(xiàn)高效的分離，但對分離蛋白質(zhì)，特別是生物大分子，這個孔徑偏小。然而，目前報道的幾種制備核殼顆粒的主要方法均無法實現(xiàn)對殼層孔徑進行簡單有效的調(diào)控，需要采用后處理方法對制備得到的核殼顆粒進行擴孔。目前，商品顆粒主要采用堿腐蝕的方法來增大孔徑，該方法雖然可以實現(xiàn)顆?？讖教岣叩?0nm以上，但該法在操作過程中會導致部分顆粒出現(xiàn)粘連，很容易出現(xiàn)顆粒團聚，造成柱效的下降。此外，堿溶解法也會導致殼層機械強度下降。因此，開發(fā)新的簡單的孔徑控制方法對提升核殼顆粒的分析范圍至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)無法有效控制顆粒孔徑、層層組裝法工藝復雜、堿溶解法擴孔導致顆粒粘連及柱效和機械強度下降的技術(shù)問題，本專利提供了一種基于兩相法、自由調(diào)控顆?？讖胶鸵徊椒磻?yīng)的孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法，其特征在于包括下列具體步驟：

(1)將sio2無孔顆粒、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、尿素和異丙醇按質(zhì)量比5:5:3:3.6混合，然后加入30倍sio2無孔顆粒質(zhì)量的水中，室溫下攪拌0.5h。

(2)量取與步驟(1)中水同體積的有機溶劑，再按有機溶劑和正硅酸四乙酯體積30:1的比例將正硅酸四乙酯加入有機溶劑中，將此混合液攪拌狀態(tài)下加入步驟(1)的溶液中，攪拌速度控制在200rpm，保持攪拌狀態(tài)，70℃下反應(yīng)16h。

(3)將所得顆粒用乙醇溶液和水分別離心清洗。接著將顆粒放入100℃烘箱干燥5h，然后放入馬弗爐中于550℃下煅燒4h。

優(yōu)選的，所述有機溶劑為苯、甲苯、混二甲苯、均三甲苯、環(huán)己烷、十三烷，n,n-二甲基苯胺或其它不溶解于水且相對極性大小小于0.2的有機溶劑。

優(yōu)選的，所述孔徑可調(diào)的核殼固定相的孔徑為3-37nm。

優(yōu)選的，1所述孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法，包括下列步驟：

(1)將0.5gsio2無孔顆粒，0.5g十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，0.3g尿素，0.46ml異丙醇加入15mlh2o中，室溫下攪拌0.5h。

(2)將15ml苯和0.5ml正硅酸四乙酯在攪拌下加入步驟(1)溶液中，攪拌速度控制在200rpm，保持攪拌狀態(tài)，在70℃下反應(yīng)16h。

(3)將所得顆粒用乙醇溶液和水分別離心清洗。接著將顆粒放入100℃烘箱干燥5h，然后放入馬弗爐中于550℃下煅燒4h。

本發(fā)明還提供一種利用上述方法所制備的孔徑可調(diào)的核殼固定相，通過下列步驟制備而成：

(1)將sio2無孔顆粒、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、尿素和異丙醇按質(zhì)量比5:5:3:3.6混合，然后加入30倍sio2無孔顆粒質(zhì)量的水中，室溫下攪拌0.5h。

(2)量取與步驟(1)中水同體積的有機溶劑，再按有機溶劑和正硅酸四乙酯體積30:1的比例將正硅酸四乙酯加入有機溶劑中，將此混合液攪拌狀態(tài)下加入步驟(1)的溶液中，攪拌速度控制在200rpm，保持攪拌狀態(tài)，70℃下反應(yīng)16h。

(3)將所得顆粒用乙醇溶液和水分別離心清洗。接著將顆粒放入100℃烘箱干燥5h，然后放入馬弗爐中于550℃下煅燒4h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：(1)本發(fā)明基于兩相法，通過一步反應(yīng)，改變了傳統(tǒng)核殼固定相采用后處理法擴孔的方法，直接在核殼固定相的制備過程中，對于相對極性小于0.2的有機溶劑，只要通過選擇不同相對極性的有機溶劑作為油相，就可實現(xiàn)對顆?？讖降挠行д{(diào)控。(2)通過選擇不同相對極性的有機溶劑作為油相，一步法可控合成孔徑大小可調(diào)(3-37nm)的核殼固定相，大大節(jié)省了工藝步驟，采用液相色譜分析法實現(xiàn)了對中性和堿性樣品、多肽和小分子量的蛋白質(zhì)、以及大分子量蛋白質(zhì)的有效分離，該發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是實施例1所制得的核殼固定相的tem照片。

圖2是實施例1所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖3是實施例1所制得的核殼固定相分離一組中性和堿性樣品的色譜圖。

圖4是實施例1所制得的核殼固定相分離一組多肽和小分子量蛋白質(zhì)的色譜圖。

圖5是實施例1所制得的核殼固定相分離一組大分子量蛋白質(zhì)的色譜圖。

圖6是實施例1所制得的核殼固定相經(jīng)70mpa高壓處理后的顆粒的sem照片。

圖7是實施例2所制得的核殼固定相的tem照片。

圖8是實施例2所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖9是實施例3所制得的核殼固定相的tem照片。

圖10是實施例3所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖11是實施例4所制得的核殼固定相的tem照片。

圖12是實施例4所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖13是實施例5所制得的核殼固定相的tem照片。

圖14是實施例5所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖15是實施例6所制得的核殼固定相的tem照片。

圖16是實施例6所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖17是實施例7所制得的核殼固定相的tem照片。

圖18是實施例7所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

圖19是實施例8所制得的核殼固定相的tem照片。

圖20是實施例8所制得的核殼固定相的孔徑分布圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步具體說明。

實施例1

孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法：將0.5gsio2無孔顆粒，0.5g十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，0.3g尿素，0.46ml異丙醇加入15mlh2o中，室溫下攪拌0.5h。之后，將15ml有機溶劑苯(相對極性0.111)和0.5ml正硅酸四乙酯在攪拌下加入上述溶液中，溶液的攪拌速度控制在200rpm，保持攪拌狀態(tài)，在70℃下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后將所得顆粒用乙醇溶液和水分別離心清洗。接著將顆粒放入100℃烘箱干燥5h，然后放入馬弗爐中于550℃下煅燒4h。

將煅燒后的產(chǎn)品采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖1為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約200nm。圖2為制備得到的核殼固定相氮氣吸附法測定結(jié)果。測得孔徑d＝37nm，比表面積s＝61m²g^-1。

將制備得到的核殼固定相衍生c18，再采用勻漿法將核殼固定相填充入內(nèi)徑4.6mm，長度為10cm的不銹鋼管柱中。采用液相色譜分離模式分離一組中性和堿性樣品，分離結(jié)果如圖3，分離條件為：流速，1.0mlmin^-1；流動相，acn/h2o＝55/45(v/v)；進樣量，1μl；檢測波長254nm；分離溫度，25℃。出峰順序及相應(yīng)色譜柱效1.茶堿(27163塔板數(shù)m^-1)，2.尼泊金甲酯(44056塔板數(shù)m^-1)，3.尼泊金乙酯(55671塔板數(shù)m^-1)，4.鄰硝基苯胺(57391塔板數(shù)m^-1)，5.尼泊金丙酯(65420塔板數(shù)m^-1)，6.尼泊金丁酯(88179塔板數(shù)m^-1)，7.溴苯(188373塔板數(shù)m^-1)，8.鄰二氯苯(204890塔板數(shù)m^-1)，9.萘(146116塔板數(shù)m^-1)，10.間二氯苯(207600塔板數(shù)m^-1)，11.對二氯苯(219633塔板數(shù)m^-1)，12.聯(lián)苯(243074塔板數(shù)m^-1)，13.二甲基萘(245923塔板數(shù)m^-1)，14.芴(264531塔板數(shù)m^-1)。該色譜柱柱效遠高于普通全多孔顆粒填充柱的柱效，也高于采用層層組裝法獲得的核殼顆粒的柱效，這表明特殊的放射狀殼層結(jié)構(gòu)可以顯著的提高色譜分離柱效。

將制所得核殼固定相衍生c18，再采用勻漿法將核殼固定相填充入內(nèi)徑4.6mm，長度為10cm的不銹鋼管柱中，采用液相色譜分離模式分離一組多肽和小分子量的蛋白質(zhì)，分離結(jié)果如圖4，分離條件為：流速，1.0mlmin^-1；流動相a，10％acn-0.1％三氟乙酸；流動相b，acn/h2o/三氟乙酸＝70/30/0.1(v/v)；梯度分離，5min內(nèi)從25％b升至60％b；進樣量，1μl；檢測波長220nm；分離溫度，30℃。出峰順序1.甲硫啡肽(111450理論塔板數(shù)m^-1)，2.牛胰島素(144979理論塔板數(shù)m^-1))，3.細胞色素c(183334理論塔板數(shù)m^-1))，4.溶菌酶(197037理論塔板數(shù)m^-1))。以上分離結(jié)果表明具有大孔結(jié)構(gòu)的核殼固定相對于多肽和小分子量的蛋白質(zhì)這一類分子量不是很大的樣品仍然具有極高的分離柱效。

為了進一步考察所制得核殼固定相對大分子物質(zhì)的分離效果，將所制得的核殼固定相衍生c18，再采用勻漿法將核殼固定相填充入內(nèi)徑4.6mm，長度為10cm的不銹鋼管柱中，采用液相色譜分離模式對一組大分子量的蛋白質(zhì)進行分離，分離結(jié)果如圖5，分離條件：流速，1.0mlmin^-1；流動相a，10％acn-0.1％三氟乙酸；流動相b，acn/h2o/三氟乙酸＝75/25/0.1(v/v)；梯度分離，8min內(nèi)從36％b升至60％b；進樣量，1μl；檢測波長280nm；分離溫度，30℃。出峰順序1.α-糜蛋白酶(25kda)，2.過氧化氫酶(60kda)，3.烯醇酶(47kda)，4.碳酸酐酶(29kda)，5.淀粉酶(200kda)。從圖中可以看到，所有5種大分子量的蛋白質(zhì)均可在7min內(nèi)實現(xiàn)快速基線分離，充分證明了具有大孔結(jié)構(gòu)的核殼固定相的超高分離能力。

將采用本實施例制備得到的核殼固定相衍生c18，再采用勻漿法將核殼固定相填充入內(nèi)徑4.6mm，長度為10cm的不銹鋼管柱中，填充壓力為70mpa。填充后取少量核殼固定相采用掃描電鏡觀察(圖6)，未發(fā)現(xiàn)殼層破損及脫落現(xiàn)象，說明采用該方法制備得到的核殼固定相具有良好的機械穩(wěn)定性。

實施例2

采用n,n-二甲基苯胺(相對極性0.179)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1的孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的產(chǎn)品采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖7為制備得到的核殼固定相的tem照片。圖8為所制得的核殼固定相的氮氣吸附法測定結(jié)果，測得孔徑d＝3nm，比表面積s＝157m²g^-1。

實施例3

采用十三烷(相對極性0.005)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的產(chǎn)品采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖9為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約200nm。圖10為核殼固定相氮氣吸附法測定結(jié)果。測得孔徑d＝5.5nm，比表面積s＝140m²g^-1。

實施例4

采用環(huán)己烷(相對極性0.006)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的顆粒采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖11為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約160nm。圖12為制備得到的核殼固定相的氮氣吸附法測定結(jié)果。測得孔徑d＝7.1nm，比表面積s＝121m²g^-1。

實施例5

采用混二甲苯(相對極性0.070)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的顆粒采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖13為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約150nm。圖14為制備得到的核殼固定相的氮氣吸附法測定結(jié)果，測得孔徑d＝18nm，比表面積s＝95m²g^-1。

實施例6

采用對二甲苯(相對極性0.074)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的顆粒采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖15為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約200nm。圖16為制備得到的核殼固定相的氮氣吸附法測定結(jié)果。測得孔徑d＝20nm，比表面積s＝85m²g^-1。

實施例7

采用均三甲苯(相對極性0.091)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的顆粒采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖17為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約220nm。圖18為制備得到的核殼固定相的氮氣吸附法測定結(jié)果，測得孔徑d＝23nm，比表面積s＝107m²g^-1。

實施例8

采用甲苯(相對極性0.099)作為有機溶劑，其他制備步驟同實施例1孔徑可調(diào)的核殼固定相的制備方法。將制得的顆粒采用tem測試其結(jié)構(gòu)，采用氮氣吸附法測試其孔徑和比表面積。圖19為制備得到的核殼固定相的tem照片。從圖中可以看到制備得到的顆粒具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，修飾獲得的殼層具有特殊的放射狀結(jié)構(gòu)，殼層厚度約300nm。圖20為制備得到的核殼固定相的氮氣吸附法測定結(jié)果，測得孔徑d＝30nm，比表面積s＝140m²g^-1。

實際上，本發(fā)明中油相的選擇不僅限于以上實施例中用到的苯、甲苯、混二甲苯、均三甲苯、環(huán)己烷、十三烷和n,n-二甲基苯胺，其它不溶解于水且相對極性大小小于0.2的有機溶劑均適用于本技術(shù)方案。

上述實施例所制備的孔徑可調(diào)的核殼固定相孔徑可調(diào)、機械強度好、制備工藝簡單、孔徑范圍寬，能夠采用液相色譜分析法，實現(xiàn)對中性和堿性樣品、多肽和小分子量的蛋白質(zhì)、以及大分子量蛋白質(zhì)等多種分子有效分離，具有潛在的應(yīng)用價值，是一種理想的核殼固定相。

最后所應(yīng)說明的是，以上具體實施方式僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。