一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料的制備和生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以Fe3O4為核，以天然生物高分子多糖或檸檬酸為殼的一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備及其從蛋清中一步法快速分離純化溶菌酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]溶菌酶(LyS0Zyme，EC 3.2.1.17)是一種專門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，具有殺菌和破壁的作用，是一種有效的抗菌劑。溶菌酶應(yīng)用范圍較為廣泛，在食品、醫(yī)藥、生物以及飼料工業(yè)等領(lǐng)域均發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，溶菌酶是一種非常緊俏的生物活性物質(zhì)。
[0003]迄今，實(shí)際應(yīng)用的已經(jīng)商品化的大多為雞蛋蛋清溶菌酶，它也是構(gòu)效了解最清楚的溶菌酶之一，因此雞蛋蛋清是分離純化溶菌酶的主要原料。目前，已報(bào)道的溶菌酶的分離純化方法主要有鹽析法、結(jié)晶法、超濾法、樹(shù)脂吸附法等。如孫維軍等(參見(jiàn)CN 101768577A)從禽蛋中提取溶菌酶時(shí)，采用酶法提取、分離、冷凍、離心、超濾得到溶菌酶。郭順堂等(參見(jiàn)CN 101619308A)從雞蛋蛋清中提取溶菌酶時(shí)，則采用了均質(zhì)、離子交換層析，超濾等步驟獲得了溶菌酶。王蘇南(參見(jiàn)CN 1844379 A)在從蛋清中分離純化溶菌酶時(shí)采用了蛋清先用樹(shù)脂吸附，之后鹽水浸泡，結(jié)晶，一次壓濾，溶解，二次壓濾，超濾及三次壓濾等步驟才獲得了較高活性的溶菌酶。以上純化方法均較為復(fù)雜，操作繁瑣，在多次工藝處理過(guò)程易造成蛋清中的蛋白質(zhì)變性；另外，所使用的超濾法生產(chǎn)成本較高，需要特殊昂貴的設(shè)備，同時(shí)蛋清也必須用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10倍及以上，使蛋清蛋白質(zhì)難以回收利用；盡管離子交換層析法目前在溶菌酶的分離純化上應(yīng)用較為廣泛，然而由于其設(shè)備復(fù)雜，操作步驟繁瑣，后處理容易造成環(huán)境污染，同時(shí)在提取過(guò)程中引入了硫酸銨，產(chǎn)品不適用于食品醫(yī)藥行業(yè)，因此使其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用受到一定的限制。
[0004]尋找新的溶菌酶分離純化技術(shù)，以降低生產(chǎn)成本，精簡(jiǎn)操作工序，提高溶菌酶產(chǎn)品的純度及活性，就成為許多科研工作者正待解決的課題。以磁性納米顆粒為吸附載體對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化是一項(xiàng)新興的分離純化技術(shù)，通過(guò)對(duì)磁性納米顆粒的表面修飾改性，特定地分離純化目標(biāo)物質(zhì)，在外加磁場(chǎng)的作用下，從復(fù)雜的體系中實(shí)現(xiàn)快速分離。與傳統(tǒng)方法相比，磁性納米分離技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、高效富集、高回收率等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]蛋清中溶菌酶由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，由于其中含有較多的堿性氨基酸殘基，所以其等電點(diǎn)高達(dá)10.8左右，是蛋清中唯一的堿性酶。而溶菌酶常溫下在中性鹽溶液中具有較高天然活性，在中性條件下溶菌酶帶正電，因此可以利用靜電相互作用力分離純化蛋清中的溶菌酶。本專利就是利用蛋清中溶菌酶這一獨(dú)特性質(zhì)，結(jié)合了傳統(tǒng)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和磁性納米分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明選擇Fe3O4為磁核，主要是因?yàn)镕e 304磁性納米顆粒毒性較低，制備方法簡(jiǎn)單，當(dāng)粒徑小于30 nm時(shí)，則表現(xiàn)出超順磁性，即在外加磁場(chǎng)作用下具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性，當(dāng)撤離磁場(chǎng)時(shí)，磁性迅速消失，剩磁為零，不會(huì)被永久磁化。本發(fā)明采用超聲波輔助的化學(xué)共沉淀法制備合成了形貌規(guī)整，粒徑均一的超順磁性納米復(fù)合顆粒，并將其應(yīng)用于蛋清中溶菌酶的一步法快速分離純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題在于克服傳統(tǒng)溶菌酶分離純化方法的不足之處，提供一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備及其應(yīng)用于蛋清中溶菌酶的快速分離純化方法，制備的顆粒形貌規(guī)整、粒徑均一、磁響應(yīng)性強(qiáng)，表面功能基團(tuán)豐富，具有良好的生物相容性和水分散性。采用所制備的磁性納米復(fù)合顆粒分離純化雞蛋蛋清中的溶菌酶，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，生產(chǎn)周期短，分離效率高，分離得到的溶菌酶具有較高的活性，同時(shí)工藝易于放大進(jìn)行大規(guī)?；a(chǎn)溶菌酶，解決了傳統(tǒng)溶菌酶分離工藝復(fù)雜、步驟繁多等問(wèn)題。
[0008]本發(fā)明提供的一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備方法及其應(yīng)用，具體實(shí)施方案如下:
1、磁性納米復(fù)合顆粒的制備
采用超聲波輔助的化學(xué)共沉淀法合成，化學(xué)反應(yīng)方程式為:
Fe2"+ 2Fe3++8 NH3.H2O = Fe3O4 I +8NH 4++4H20一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:
將可溶性Fe2+和Fe 3+鹽溶解在體積比為1:1?10:1純水和無(wú)水乙醇的混合溶液中，向其中加入表面活性劑，并通氮?dú)?0 min，整個(gè)反應(yīng)均在超聲波體系中(F=28KHz)進(jìn)行；之后將溫度升高到40?70°C后緩慢滴加堿液到反應(yīng)體系中，最終使pH值達(dá)到10?11，反應(yīng)30 min后繼續(xù)向體系中加入一定量的表面殼體材料，之后將溫度升高到70?90°C反應(yīng)I?6h，終止反應(yīng)，之后在外加磁場(chǎng)的作用下分離磁性顆粒，并且用去離子水清洗數(shù)次至中性，并進(jìn)行干燥處理，即可得磁性納米復(fù)合顆粒粉末，簡(jiǎn)寫(xiě)為MNPs。
[0009]其中所述的可溶性的Fe2+化合物是四水氯化亞鐵或七水硫酸亞鐵；可溶性的Fe 3+化合物是六水氯化鐵；其中Fe2+與Fe3+的摩爾比為1:2?2:1，總鐵離子濃度為0.03?0.5M。
[0010]其中所述的堿液選用氨水或氫氧化鈉中的任何一種或其混合物。
[0011]其中所述的水和無(wú)水乙醇的體積比為1:1?10:1。
[0012]其中所述的表面活性劑選用聚乙二醇6000、十二烷基苯磺酸鈉和十六烷基三甲基溴化銨中的任何一種。
[0013]其中所述的表面殼體材料為殼聚糖、羧甲基殼聚糖、硫酸軟骨素鈉或者檸檬酸中的任何一種。
[0014]上述方法制備的MNPs形貌規(guī)整，粒徑均一，表面功能基團(tuán)豐富，具有超順磁性，同時(shí)在水溶液中具有良好的分散性和生物相容性，可用于蛋清中溶菌酶的分離純化。磁性納米復(fù)合顆粒是在外加磁場(chǎng)的作用下得以分離，因此最后所得的磁性納米復(fù)合顆粒中沒(méi)有游離的未被吸附和反應(yīng)完全的化學(xué)組分。
[0015]、磁性納米復(fù)合顆粒應(yīng)用于蛋清中溶菌酶的快速分離純化
(I)新鮮蛋清原液的制備
蛋黃、蛋清分離，之后將新鮮蛋清與磷酸鹽緩沖溶液(20 mM，pH 7.0?10.0)按體積比1:1?1:3的比例進(jìn)行稀釋，然后在冰水浴中連續(xù)攪拌反應(yīng)6h，攪拌產(chǎn)生的白色絮狀沉淀在4°C以10，OOOrpm冷凍離心30min，除去不溶性沉淀；所得上清液作為溶菌酶的分離純化的蛋清原液。
[0016](2)采用磁性納米復(fù)合顆粒從蛋清原液中分離純化溶菌酶
將MNPs加入到蛋清原液中，在O?37°C條件下，攪拌(100?400 rpm)反應(yīng)30?180min，使蛋清中的溶菌酶特定地吸附在MNPs表面，在外加磁場(chǎng)的作用下將吸附有溶菌酶的MNPs從蛋清溶液中分離出來(lái)，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用洗脫液進(jìn)行洗脫，收集溶菌酶的洗脫液，洗脫液保存在4°C冰箱中。溶菌酶洗脫液采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度分析。分離膠濃度:12%;濃縮膠濃度:6%。最后將溶菌酶洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，并測(cè)定其活性保留。
[0017]其中所述的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0?10.0)對(duì)新鮮蛋清進(jìn)行稀釋。
[0018]其中所述的磁性納米復(fù)合顆粒與蛋清溶液的反應(yīng)時(shí)間為30?180 min。
[0019]其中所述的洗脫液選用磷酸鹽緩沖溶液(pH=9，20 mM，0.5 M氯化鈉)，磷酸鹽緩沖溶液(pH=9，20 mM, IM氯化鈉)，醋酸(0.1M)和鹽酸(0.1M)中的任何一種。
[0020]其中所述的吸附反應(yīng)溫度為O?37 °C。
[0021]其中所述的機(jī)械攪拌的轉(zhuǎn)速為100?400 rpm范圍內(nèi)。
[0022]溶菌酶活力單位定義:在25 V的Lyz最適反應(yīng)條件下，Lyz與溶壁微球菌的反應(yīng)溶液體系在450 nm波長(zhǎng)下，一分鐘內(nèi)吸光度每下降0.001為一個(gè)活力單位。
[0023]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備及其應(yīng)用于蛋清中溶菌酶的快速分離純化方法，制備的磁性納米復(fù)合顆粒用于蛋清中溶菌酶的高效分離純化，大大提高了提取效率，同時(shí)最大程度地保持了溶菌酶的活性。建立在此磁性納米復(fù)合顆?；A(chǔ)上的蛋清中溶菌酶的純化方法無(wú)論是溶菌酶的純度還是活性保留都不遜于傳統(tǒng)方法。
[0024]本發(fā)明提供的一種磁性納米復(fù)合顆粒的制備及其應(yīng)用于蛋清中溶菌酶的快速分離純化方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)操作簡(jiǎn)單，分離純化周期較短:本分離純化工藝采用磁性納米復(fù)合顆粒從蛋清溶液中分離純化溶菌酶，從吸附、清洗到洗脫整個(gè)過(guò)程在2?3 h內(nèi)完成。
[0025](2)溶菌酶的特異性吸附好，利于高純度溶菌酶的制備:在設(shè)定的分離純化條件下(特定的PH值和鹽濃度)，磁性納米復(fù)合顆粒通過(guò)靜電相互作用能特異性地分離純化蛋清中的溶菌酶。
[0026](3)反應(yīng)條件溫和，高酶活保留:本分離純化工藝是在水溶液及室溫條件下進(jìn)行，溶菌酶保留了較高的酶活，同時(shí)也不會(huì)引起蛋清中的其他蛋白質(zhì)組分的變性。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述:
實(shí)施例1