專利名稱：生物燃料生產(chǎn)的優(yōu)化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的公開的實施方式處于用于生物燃料生產(chǎn)的系統(tǒng)和方法的領域，特別是利 用微藻生產(chǎn)生物燃料的系統(tǒng)和方法。背景近來，石油的價格顯著地波動，達到了記錄性的高度，以及產(chǎn)生了戲劇性的向下回 落。部分地，當前的價格升高反映了政治和供應鏈的不確定性。對便宜的石油供應品的可 獲得性的關注產(chǎn)生了不斷成熟的認識，工業(yè)化國家的能源獨立性具有關鍵的戰(zhàn)略重要性。 現(xiàn)在一般還公認的是，來自化石燃料燃燒的CO2的釋放實質上促進了全球變暖和氣候變化。 作為這些關注的結果，碳中性的生物燃料的國內生產(chǎn)變?yōu)閷M口的化石燃料消費的越來越 吸引人的備選方案。在1970年代晚期和1990年代期間，美國能源部門的國家可再生能源實驗室 (NREL)評估了從各種水生和陸地光合生物生產(chǎn)生物燃料的經(jīng)濟可行性(Sheehan et al.， 1998)。來自微藻的生物燃料生產(chǎn)被確定為具有所篩選的任何生物體的最大的產(chǎn)量/英畝 潛力。估計微藻生物燃料生產(chǎn)是最好的陸地生物燃料生產(chǎn)系統(tǒng)的8到24倍。雖然很有前 景，仍然需要在來自微藻的生物燃料生產(chǎn)中提供再更大效率的組合物、系統(tǒng)和方法。發(fā)明概述現(xiàn)有技術的這種和其他未滿足需求由以下更詳細地描述的示范性的組合物、系統(tǒng) 和方法滿足了。在一個方面，本發(fā)明的實施方式利用了機械和和化學工程化策略來實現(xiàn)來自含油 生物體的生物燃料生產(chǎn)中的再更高的效率。這些提高的效率可以通過應用在此公開的靶向 的和良好設計的化學和機械工程方法以實現(xiàn)非破壞性提取過程(NDEP)來實現(xiàn)。因此，在此提供的是從含油生物體的油提取的方法，包括混合步驟，其包括混合含有含油生物體的培養(yǎng)物的至少一部分和從所述含油生物 體提取油的溶劑來獲得溶劑-生物體混合物；提取步驟，其包括將所述溶劑_生物體混合物導入分配室，來獲得含有活的提取 的生物體的提取的水性部分和溶劑_油部分；以及再循環(huán)步驟，其中至少一部分所述活的提取的生物體再循環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。在一個實施方式中，所述方法進一步包含蒸餾所述溶劑_油部分來獲得可用的油 的步驟。在另一個實施方式中，所述方法進一步包括步驟蒸餾所述溶劑_油部分來獲得 可用的油和回收的溶劑；再循環(huán)至少一部分所述回收的溶劑用于在所述混合步驟中使用。在另一個實施方式中，進行所述方法，從而所述含油生物體經(jīng)歷混合與油提取的至少兩個獨立的循環(huán)。在某些實施方式中，所述含油生物體是藻類。在其他實施方式中，所述含油生物體是含油酵母。在又其他實施方式中，所述含油生物體是含油真菌。在某些實施方式中，所述方法中使用的溶劑包括一種或更多種C4-C16烴類。在某 些實施方式中，所述溶劑包括CIO、ClU C12、C13、C14、C15或C16烴類。在一個實施方式 中，所述溶劑是Isopar。所述方法中使用的含油生物體可以遺傳工程化來增強脂質生產(chǎn)。在某些實施方式中，所述含油生物體在油提取之前先濃縮。在某些實例中，在所述混合步驟的至少一部分期間使用超聲處理。超聲處理可以 在約20kHz和lMHz、20-100kHz、20-60Khz、30-50Khz之間或在40Khz的頻率下進行。在可 選擇的實施方式中，所述混合步驟可以借助于機械混合(例如，攪動)來另外地促進。在再 其他的實施方式中，超聲處理和機械混合可以組合地使用。在另一個方面，在此提供的是從含油藻類的油提取的方法，包括混合含有所述藻 類的培養(yǎng)物的至少一部分和從所述藻類提取油的溶劑來獲得溶劑_藻類混合物；將所述溶 劑_藻類混合物導入分配室來獲得含有活的提取的藻類的提取的水性部分和溶劑_油部 分；以及將所述活的提取的藻類的至少一部分再循環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。還在此提供的是來自光合含油生物體的油提取的方法，包括混合含有所述光合 含油生物體的培養(yǎng)物的至少一部分和從所述生物體提取油的溶劑來獲得溶劑_生物體混 合物；將所述溶劑_生物體混合物導入分配室來獲得含有活的提取的生物體的提取的水性 部分和溶劑_油部分；以及將所述活的提取的生物體的一部分再循環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。在某些實施方式中，所述方法進一步包括步驟提供波長移動染料，所述染料適合 于提高所述培養(yǎng)系統(tǒng)中所述光合藻類可獲得的可用光子的數(shù)量。所述波長移動染料可以摻 入到顆粒中，或薄膜中。在某些實施方式中，所述方法進一步包括步驟提供菲涅耳透鏡，其適合于當光源 以傾斜的角度接受時提高所述光合藻類可獲得的光子的數(shù)量。在某些實施方式中，所述方法進一步包括步驟蒸餾所述溶劑_油部分來獲得可 用的油。在此公開的所有方法和過程可以以連續(xù)的方式進行。在某些實施方式中，包括了用于進行所公開的方法的裝置。在此公開的組合物、系統(tǒng)和方法的示范性的實施方式可以單獨地或以不同的組合 使用，來提高來自微藻的脂質生產(chǎn)和油提取。在此公開的實施方式可以通過提高太陽能利 用效率、細胞培養(yǎng)物密度以及利用新的脂質收獲技術來從活的培養(yǎng)物非破壞性地收獲油， 來提高脂質生產(chǎn)。附圖的簡要描述當參考附圖時，將得到本發(fā)明的示范性的實施方式的更好的理解，在附圖中附

圖1是顯示烷烴溶劑處理對原殼小球藻細胞的生存性的影響的圖形。附圖2是顯示有或者沒有超聲處理的烷烴溶劑處理對從活細胞的脂質(總脂肪酸 (FA))提取的影響的圖形。
附圖3示意性地顯示了可以使用用于從藻類非破壞性提取油的示范性的設備。附圖4是用于從藻類非破壞性提取油的示范性的系統(tǒng)和方法的圖表。附圖5包括數(shù)據(jù)，顯示了與癸烷提取結合的不同水平的超聲處理對綠藻原殼小球 藻的生存力的影響。附圖6是展現(xiàn)了溶劑提取可以每日地進行以回收更多油或中性脂質的曲線。附圖7重復溶劑提取產(chǎn)生更多的油。對比分批(僅第3天)提取的培養(yǎng)物，總生 物質和每日的非破壞性提取的中性脂質的概述。附圖8顯示了微擬球藻屬的生長在非破壞性脂質提取的多個周期后不受損害。附圖9展現(xiàn)了與超聲處理結合的溶劑(癸烷)暴露對微擬球藻屬物種的生存力的影響。附圖10是展現(xiàn)了在不同的非破壞性提取過程下微擬球藻屬物種的生長的曲線。附圖11是顯示了在用由超聲處理步驟促進的各種溶劑的提取之后，微擬球藻屬 物種的不同生長速度的曲線。附圖12為葉綠素b和獲光復合體的還原測試的轉化質粒的設計。質粒過量表達 葉綠素b還原酶，其將把葉綠素b轉化回葉綠素a(質粒1)，或是RNAi構建體，來降低葉綠 素a氧化酶的活性(CA0，質粒2-5)，葉綠素a氧化酶從葉綠素a合成葉綠素b。附圖13在顯示了葉綠素b含量降低的轉基因生物體中轉化頻率和葉綠素a/b比 例的改變。附圖14是獲光復合體對葉綠素熒光的提高和衰減的貢獻的葉綠素動力學分析的 說明。附圖15顯示了與獲光復合體的減少相一致的、具有更慢的葉綠素熒光提高動力 學和更低的最大葉綠素熒光水平的轉基因藻類。利用附圖12中的質粒構建體4制造轉化 體，所述構建體將降低葉綠素a氧化酶的表達，所述酶從葉綠素a制造葉綠素b。附圖16是顯示限制光合效率的因素的表格。附圖17是展現(xiàn)了 400和600nm之間的可見光的主要窗口不被葉綠素有效吸收的圖表。附圖18顯示了對于提高光合機制可收獲的光子數(shù)量有用的一系列示范性的染 料·附圖19說明了對于提高光捕獲有用的技術之一。在此示意地顯示了菲涅耳透鏡 的益處。詳細說明除非另外定義，此處使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明屬于的技術領域的 普通技術人員通常所理解的相同的含義。雖然類似于或等同于在此描述的那些的方法和材 料可以被用于示范性的實施方式的實踐或測試，以下描述了適合的方法和材料。在此提及 的所有公開物、專利申請、專利和其他參考文獻通過引用將它們完整地合并。在沖突的情況 下，當前的說明書，包括定義，是支配性的。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的，而不意 圖是限制性的。在此使用的，“擠出(milk) ”和“非破壞性提取”被用于描述一種過程，其中生物體 用溶劑處理來除去脂質而不引起培養(yǎng)物的生存力的顯著損失。非破壞性提取或“基本上不殺死”生物體的提取，是指提取與活提取的生物體再循環(huán)/再回流到培養(yǎng)系統(tǒng)中用于再生長 或另外的脂質和生物質生產(chǎn)的循環(huán)，是指一種概念，生物體將存活至少一個提取循環(huán)，但是 可以在隨后的提取循環(huán)時被破壞?！芭囵B(yǎng)系統(tǒng)”廣義地指對培養(yǎng)生物體有用的任何系統(tǒng)。這些可以是水池、溝渠、生物 反應器、塑料袋、試管、發(fā)酵器、搖瓶、氣升柱，等等?！翱捎玫挠汀笔侵高m合于生物燃料的生產(chǎn)的油。這樣的油可以或可以不完全沒有溶 劑或來自生物體的其他共同提取物。在此使用的，“連續(xù)”提取過程是一種過程，其中混合/提取/再循環(huán)步驟以最小的 操作員投入連續(xù)地進行延長的時間，但是預期的是根據(jù)維持或最大化提取生產(chǎn)力的需要以 一定間隔運行和停止?！吧锵嗳莸娜軇笔且环N溶劑，其可以接觸生物體和被所述生物體耐受而沒有生 存力的顯著損失。生物相容的溶劑一般將具有大于5的辛醇值(“l(fā)og Poct”，辛醇-水 分配系數(shù)的對數(shù)參見 Frenz J, Largeau C, Casadevall E, Kollerup F, Daugulis AJ (1988)Hydrocarbon recovery and biocompatibility of solvents for extraction of cultures of Botryococcus braunii. Biotech Bioeng 34:755-762。一般地，log P 值與溶劑生物相容性良好地相關，因為具有低于4的log Po的溶劑是有毒的，log Po大 于5的溶劑是生物相容的(對于這種規(guī)則Dodecmone是一個例外)。具有4_5的范圍內的 log Po的溶劑可能是有毒的(癸醇、二戊基醚)或無毒的(己烷、庚烷)，因而僅基于這個 參數(shù)不能建立絕對的截斷。部分地，這可能反映了在計算log Po中的某些錯誤，這些溶劑 的更精確的值可以預計與生物相容性更好地相關。示范性的溶劑包括1，12-十二烷二酸 二乙醚、正己烷、正庚烷、正辛烷、正十二烷、乙酸十二烷酯、癸烷、二己醚、isopar、l-十二烷 醇、1-辛醇、丁氧基乙氧基ehteane、3-辛酮、環(huán)狀石蠟、varsol、異鏈烷烴、支鏈烷烴、油醇、 dihecylether、2_ 十二燒。“超聲處理”的過程是用高能聲音或聲學輻射處理樣品，所述高能聲音或聲學輻射 在此稱為“超聲(ultrasound)”或“超聲學(ultrasonics)”。超聲處理在本領域中用于各 種目的來使用，包括破壞分子的聚集以分離它們或使它們滲透。利用新的化學和機械工程化策略，本發(fā)明的示范性的實施方式是針對提高可從藻 類收獲的富含能源的脂質(例如，三?；视?的產(chǎn)量。雖然如下所述的許多示范性的實 施方式分別是有用的，當前系統(tǒng)的示范性的組合、系統(tǒng)和方法可以令人稱贊地工作來優(yōu)化 成本和產(chǎn)量。在此公開的系統(tǒng)和方法可以利用一大系列的含油生物體，包括藻類、酵母和真菌。許多藻類的物種可以以可接受的結果使用。以下藻類物種包括，無限制地硅藻 M (Bacillariophyceae)(Chlorophyceae) > Mii^ (Cyanophyceae) > Hii^ (Xanthophyceae)、金藻綱(Chrysophyceae)、小球藻屬(Chlorella)、Crypthecodinium、 Schizocytrium、微擬球藻屬(Nannochloropsis)、Ulkenia、杜氏藻屬(Dunaliella)、 小環(huán)藻屬(Cyclotella)、舟形藻屬(Navicula)、菱形藻屬(Nitzschia)、小環(huán)藻屬 (Cyclotella)、褐指藻屬(Phaeodactylum)禾口 Thaustochytrids0適合的酵母包括，但不限于，紅酵母屬(Rhodotorula)、酵母屬(Saccharomyces) 禾口 Apiotrichum 菌株。
可接受的真菌物種包括，但不限于，被孢霉屬(Mortierella)菌株。至少一種示范性的實施方式利用了原殼小球藻(Chlorella protothecoides)。 原殼小球藻可能是特別適合的，因為它以高培養(yǎng)細胞密度生長，一般為大多數(shù)藻類的10倍 (Xu et al. ,2006 ；Miao and Wu，2006)。當在理想條件下異養(yǎng)地生長時，對原殼小球藻記錄 了高達35gfV/L的創(chuàng)紀錄的生物質產(chǎn)量。原殼小球藻能夠將它的生物質的至少55%積累 為脂質，是大多數(shù)藻類株系達不到的值。原殼小球藻可以在葡萄糖或玉米甜味劑水解產(chǎn)物 (CSH)上異養(yǎng)地生長。異養(yǎng)的生長提高了脂質含量，可以降低對太陽能的直接依賴性。原殼 小球藻產(chǎn)生的生物柴油的能量密度與基于石油的柴油相當(Xu et al.，2006 ；Miaoand Wu, 2006)。原殼小球藻屬產(chǎn)生的生物柴油的冷濾溫度低于柴油燃料的(Xu et al. ,2006 ；Miao and Wu，2006)。小球藻屬以及其他微藻物種具有被遺傳工程化的的潛力，它們已經(jīng)利用 煙道氣作為富集的C02的來源在大規(guī)模光生物反應器中成功地生長(Brown，1996 ；Doucha and Livansky,2006 ；Kadam,1997 ；Keffler and Kleinheinz, 2002, Chow and Tung,1999 ； Dawson et al.，1997 ；El-Sheekh，1999 ；Chen et al.，2001)。從藻類培養(yǎng)物擠出油而不損害所述藻類與生物燃料生產(chǎn)相關的主要成本之一是從大體積的培養(yǎng)基收獲生物燃料 (Becker, 1994) 0從藻類收獲、破裂、干燥和提取油占據(jù)了生產(chǎn)生物柴油的成本的40-60%， 對培養(yǎng)物補充提出了額外要求。存在著對非破壞性的、低成本的油提取技術的需求。某些微藻具有脂質生產(chǎn)的高潛力。當異養(yǎng)地生長時，細胞的大約15-55%是脂 質。然而，即使脂質含量很高，如果不能收獲脂質而基本上不損害微藻，則微藻生物質的 45-85% (非脂質生物質)將需要再生以產(chǎn)生其他有用的脂質。因此，此處描述的是從含油生物體非破壞性提取油的方法，其包括混合含有含油 生物體的培養(yǎng)物的至少一部分和從所述含油生物體提取油的溶劑來獲得溶劑_生物體混 合物；將所述溶劑_生物體混合物導入分配室來獲得含有活的提取的生物體的提取的水性 部分和溶劑-油部分；以及再循環(huán)步驟，其中所述活的提取的生物體的至少一部分被再循 環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。在與奶牛場操作某些方面類似的示范性的系統(tǒng)中，所述系統(tǒng)容許從含油 生物體采集可用的油而基本上不破壞或損害所述生物體。提取過程的實施方式包括溶劑提 取和超聲處理來實現(xiàn)所述生物體的“烴類擠出”。在可用的油的提取之后，所述生物體可以 開始積累脂質的新的過程。該示范性的過程容許有效的采集，而同時保持培養(yǎng)的生物體的 一部分的生存力。這保存了能量和材料，不然所述能量和材料是再生活的生物體所需要的。有益地，“擠出”過程可能實際地有益于藻類。混合烷烴與活的培養(yǎng)物還顯示了將 培養(yǎng)物生長時間從一周延長到超過五周。這種效果可能與從藻類分泌的毒性廢產(chǎn)物分配到 培養(yǎng)基的疏水性部分相關(Richmond，2004)。對于藻類來說，通過離心收獲細胞(生物質=0. 的培養(yǎng)物體積)的通貨膨脹調 整后的成本在2006年估計是$2. 40/kg(Becker, 1994)。假定總生物質的55%的脂質產(chǎn)量， 從藻類產(chǎn)生一加侖油的離心法的成本估計是$18。通過絮凝或浮集法收獲僅僅是稍稍地便 宜一點($14. 60/加侖)。然而，通過生長更為稠密的藻類培養(yǎng)物，這些成本的一部分可以降 低。假定培養(yǎng)物密度和收獲藻類的成本之間的線性關系，從具有三倍高密度的培養(yǎng)物收獲 藻類(例如，缺乏LHC復合物的那些)的成本將是$4. 80/加侖產(chǎn)生的油，仍然遠高于當今 的市場，其中生產(chǎn)汽油的粗制油的成本是$1.60/加侖。為了來自藻類的生物燃料生產(chǎn)與粗油生產(chǎn)成本競爭，收獲價格需要進一步降低至1/3。近來，已經(jīng)展現(xiàn)的是，極度疏水性的分子，例如β -胡蘿卜素，可以利用不溶混的、 生物相容的烷烴從活的藻類和細菌培養(yǎng)物連續(xù)地提取。這些烷烴一般具有10和16個原 子之間的碳鏈長度(Hejazi et al. ,2002 ；Hejazi and Wi jffels, 2004 ；Hejazi et al.， 2004)。藻類培養(yǎng)物與烷烴的連續(xù)混合容許胡蘿卜素的不間斷的提取。重要地，提取的 類胡蘿卜素來自類胡蘿卜素貯存泡囊而非葉綠體。結果，烷烴提取對長期(50天然后停止) 培養(yǎng)物生長沒有不利影響(Hejazi et al. ,2002 ；Hejazi and Wi jffels, 2004 ；Hejazi et al.，2004)。在此公開的某些示范性的實施方式利用“烴類擠出”作為從藻類連續(xù)收獲油的低 成本手段。在某些實施方式中，在此描述的過程不需要離心，具有非常高的脂質產(chǎn)量，并且 值得注意地，提取過程對藻類是基本上無害的(甚至可能是有益的)。烴類擠出可以消除一 般用于從藻類提取油的離心/絮凝和破壞性溶劑(甲醇)或機械破碎步驟的需要。參考附圖1，為了確定脂質是否可以安全地從活的藻類培養(yǎng)物中取出，我們用己 烷、癸烷和更長鏈的烴類提取了空氣生長的原殼小球藻培養(yǎng)物，確定溶劑提取是否除去脂 質和對細胞生存力有影響。出乎意料地，如附圖1所示，活細胞與ClO到C16烷烴孵育5分 鐘對細胞生存力沒有影響。參考附圖2，對數(shù)生長期培養(yǎng)物用各種烷烴處理5分鐘，加或減兩秒超聲處理。溶 劑提取的脂質被皂化，利用C17內標準通過LC-MS分析對游離脂肪酸定量。值得注意地，當 補充有兩秒超聲處理時，總細胞脂肪酸的10%在對溶劑的五分鐘暴露期間提取。重要地，短 的超聲處理增強了脂質提取達75%。當一起觀察時，附圖1和附圖2，利用有機溶劑從活細胞提取油的結果，展現(xiàn)了非 破壞性的提取工作。根據(jù)利用尼羅紅的細胞三?；视偷拈g接定量，空氣生長的細胞中存 在的幾乎100%的三?；视驮诎橛谐曁幚淼?分鐘提取期間被癸烷提取(附圖2)。潛 在地，短鏈或支鏈烷烴也可以從葡萄糖中生長的高含油(40%的生物質)藻類細胞有效地 提取油。溶劑提取時間和溫度可以優(yōu)化，來實現(xiàn)從微藻的最有效的油提取。雖然明確地不受理論的限制，超聲處理被認為通過將培養(yǎng)物液滴破壞成更小的顆 粒、容許對藻類的更大的溶劑暴露，改善了油提取。不具有破壞效果的微生物的超聲照射已 經(jīng)顯示了在低頻率下是劑量依賴性的。隨著頻率提高，更久的照射被微生物耐受(Tiehm， 2001)。我們利用了在不同的超聲波暴露時間下最佳的頻率范圍(20kHz到IMHz)和強度， 來優(yōu)化油的提取而不損害細胞的生存力。然而，應理解的是，各種其他頻率、強度和暴露時 間也可以產(chǎn)生可接受的提取效率。本發(fā)明的示范性的實施方式釋放油而基本上不殺死細胞。不具有破壞效果的微生 物的超聲照射已經(jīng)顯示了在低頻率下是劑量依賴性的。隨著頻率提高，更久的照射被微生 物耐受?？梢岳迷诓煌某暡ū┞稌r間下最佳的頻率范圍(20kHz到60khz)和強度，來 優(yōu)化油的提取而不損害細胞的生存力。然而，應當理解的是，各種其他頻率、強度和暴露時 間也可以產(chǎn)生可接受的提取效率,包括20kHz和IMHz之間、20_100kHz、20_60Khz、30-50Khz 或在40Khz下的頻率。已知的是，細胞大小、細胞形狀、細胞壁組成和生理狀態(tài)都影響超聲 與細胞的相互作用(Wase and Patel, 1985 ；Ahmed and Russell，1975)。在某些實施方式中，利用溶劑和超聲處理的組合，達到了幾乎100%的油(細胞中總脂肪酸的10% )提取效率。結果展現(xiàn)了，以實質上降低的成本，從活的培養(yǎng)物連續(xù)和非破 壞性提取油可以利用生物相容的溶劑來實現(xiàn)。除了已經(jīng)描述的可用的脂質之外，植物品種例如藻類也已知產(chǎn)生重要的疏水性的 芳香族化合物。某些芳香族化合物例如萘和甲苯是燃料產(chǎn)品中重要的組成部分。有益地， 如上所述的溶劑提取技術可以用于提取早先描述的許多這些芳香族化合物以及其他有用 的油。這些化學物質將不是利用如上所述的依靠離心和干燥方法的當前提取技術可以提取 的。雖然藻類提取是許多示范性的實施方式的焦點，生長和再循環(huán)提取過程也可以用 于其他重要的含油生物體。例如，生物體例如酵母和真菌也可以經(jīng)受這種純化過程。在操作中，細胞可以在培養(yǎng)系統(tǒng)中生長，可以連續(xù)地泵送到混合室，在此它們可以 與生物相容的溶劑混合，和在早先確定的對維持細胞生存力和最大化油提取最佳的條件下 超聲處理。細胞/溶劑混合物然后可以泵送到相-分離室以容許細胞(下部的相)從溶劑 (上部的相)中分配。在細胞和溶劑已經(jīng)分配之后，細胞可以再循環(huán)回到細胞生長儲池。含 油的溶劑(上部的相)可以被蒸餾(癸烷沸點溫度 174°C )，脂質部分將通過GC-MS來定 量和表征。蒸餾的溶劑將再循環(huán)回到藻類提取室并再利用。溶劑的小部分預計被分配到水 相中。由于我們將用空氣或富含CO2的空氣為細胞充氣，我們可以氣體排出溶劑的某些部 分。為了確定這種損失的數(shù)量，氣體排放可以被采集并利用冷凍采集器冷卻來凝縮和定量 任何氣體排出的溶劑。一旦系統(tǒng)被優(yōu)化，操作系統(tǒng)消耗的能量可以利用瓦特計來定量。在 此公開的示范性的實施方式中油的溶劑提取可能是高效的和低成本的。圖3顯示了基于連續(xù)流動溶劑的油提取系統(tǒng)的示意模型，其補充了本發(fā)明關于基 于溶劑的油提取的公開內容。在一個示范性的實施方式中，所述過程可以包括1.將藻類 噴霧到長柱的頂部以打破液滴大小，用于與上部的溶劑相最大地混合。2.提取器的上部 可以含有足夠的溶劑(深度)以容許在藻類的沉淀期間有足夠的時間用于完全的油提取。 3.超聲發(fā)生器元件可以在溶劑相中提供以加速和改善油的溶劑提取。4.空氣可以間歇地 注入到藻類相中，以增強混合和從藻類相中除去殘余的溶劑?？赡苡幸娴氖窃诔曁幚砥?間停止空氣注入以增強油提取。5.可以提供管道用于分別去除溶劑和藻類相。象附圖3中顯示的柱可以單獨地或并行地工作。當溶劑在一個柱中油飽和時，則 它可以被關閉，同時交換溶劑來回收油，并送至蒸餾器以除去溶劑相。與此同時，藻類可以 泵送到其它柱中。附圖4說明了連續(xù)流動的、基于溶劑的油提取的另一個示范性的系統(tǒng)和方法。如 在第1點中所示的，生物體例如光合藻類可以在露天的水池(100)中生長，在此培養(yǎng)物可以 暴露于太陽輻射。如在第2點所示的，一部分培養(yǎng)物可以與溶劑混合。優(yōu)選的，機械混合和 /或超聲處理之一，可以用于改善溶劑與生物體的混合(第3點)。超聲處理應當經(jīng)受預定 量的時間以最大化脂質提取和最小化微生物細胞破壞。在備選方案中，超聲處理可以在培 養(yǎng)物暴露于溶劑之前發(fā)生。細胞/溶劑混合物然后可以導入到相-分離或分配室(200)以 容許細胞(下部的相)從溶劑(上部的相)中分配(參見第4點)。如在第4/5點中所示 的，脫油的細胞和水然后可以沉積到槽罐的底部，活的細胞然后可以導回水池開始新的過 程(第9點)。通過相分離采集的溶劑和油然后可以在分離堰(第6點)上方流過進入溶 劑和油室(300)。如在第7點所展現(xiàn)的，溶劑和油可以導入蒸餾單元(400)(此時油濃度對于有效的分離是足夠高的)。在第8點，在油被除去之后，清潔的溶劑可以泵回溶劑罐中用 于再循環(huán)?；蛟趥溥x方案中，清潔的溶劑可以再循環(huán)用于在第2點與細胞培養(yǎng)物混合(由 第10點展現(xiàn)的)。附圖5展示了實驗的結果，其展現(xiàn)了超聲處理和癸烷提取對綠藻原殼小球藻的生 存力的影響。畫面A顯示了利用功率5和7的超聲達30秒的超聲處理和1 1的藻類 癸烷體積比之后濃縮的原殼小球藻生存力的降低。降低被計算為log(No/N)，其中No是藻 類/mL的起始的計數(shù)，N是處理后的計數(shù)。畫面B顯示了藻類癸烷比例對細胞死亡的影 響。附圖6圖形地顯示了實驗的結果，其展現(xiàn)了可以進行重復的溶劑提取來優(yōu)化富含 能源的分子的產(chǎn)量。在這個實驗中，進行了使用50%接種物的重復溶劑提取。數(shù)據(jù)展現(xiàn)了， 活的細胞(原殼小球藻)的溶劑提取除去了三?；视?表示為脂肪酸當量)，以及油提 取可以在每日的基礎上進行以回收更多的油或中性脂質。細胞中的總脂質(中性的和極性 的)由每個組的中間的柱條表示。在兩次序貫提取之后提取的總的中性脂質(油)等于總 細胞生物質的20%或總細胞脂質(中性的和極性的)的40%。觀察到生長速度方面的降 低，然而，是在多次溶劑提取之后。在附圖7中，顯示了數(shù)據(jù)，其展現(xiàn)了重復的溶劑提取產(chǎn)生更多的油。數(shù)據(jù)代表了總 生物質，和對比分批(僅第三天)提取的培養(yǎng)物每日的非破壞性提取的中性脂質的概述。結 果展現(xiàn)了在序貫的溶劑提取后總生物質的提高到2. 4倍，以及對比相同齡的分批處理提取 的藻類的33%提高，從每日提取的藻類提取的總的油中41%的提高。這些結果表明，溶劑 提取降低了生長抑制，以及降低了生產(chǎn)油的培養(yǎng)物留存時間。這些結果表明，在水池中產(chǎn)生 等體積的油的有效留存時間，非破壞性提取的藻類為分批生長的破壞性提取的藻類的近乎 1/3。附圖8含有數(shù)據(jù)，其顯示了微擬球藻屬的生長在非破壞性脂質提取的多個周期后 不受損害。這些結果展現(xiàn)了微擬球藻屬物種與原殼小球藻相比對溶劑提取更有抗性。實驗 顯示了在如附圖2描述的溶劑提取之后的出芽速率(grow out rate)。在四次溶劑提取之 后，在生長速度方面沒有障礙。N=起始生長速度，無溶劑提取，從第0天開始；m =在一次 溶劑提取后的生長速度，從第1天開始力1% =非溶劑提取的細胞的生長速度，從第2天開 始；N2 = 24小時后溶劑提取第二次的細胞的生長速度，第2天；N3 = 24小時后溶劑提取 第三次的細胞的生長速度，從第3天開始；N4 = 24小時后溶劑提取第四次的細胞的生長速 度，從第4天開始。上述實施方式是示范性的。設備和操作的廣泛系列可以用于實現(xiàn)基于溶劑的油提 取。例如，藻類培養(yǎng)物和溶劑可以使之作為逆流流動來流動。做為選擇，氣泡房對于混合可 能是有用的。利用螺旋樣室來促成藻類和溶劑的混合的其他設計也可以用于有效的混合。
實施例為了促進對本發(fā)明的更完整的了解，以下提供了許多實施例。然而，本發(fā)明的范圍 不應限于在這些實施例中公開的具體的實施方式，其僅用于例示的目的。實施例1(附圖9)癸烷和超聲波處理對微擬球藻屬的影響相同的IOOml微擬球藻屬物種培養(yǎng)物(η = 2)的可變的部分(0、10%、25%和50% )與癸烷初步(箭頭)混合(15分鐘)并暴露于超聲場(2秒；40kHz水浴)，傾倒溶 劑，然后生長(F/2，23°C，24 0的10(^11101，100印111，33 仏1001^在 5001^燒瓶中)。進 一步的，還完成了在對數(shù)期和平穩(wěn)期的可變時間的處理(箭頭)。該附圖顯示了與未處理相 比，一定水平的暴露可以正面地影響生長速度和產(chǎn)生的藻類生物質。進一步的，穩(wěn)定期培養(yǎng) 物一般比對數(shù)期培養(yǎng)物更耐受溶劑-聲波處理，然而相比于特定的生理學生命期，這種影 響可能與更高的細胞濃度更為相關。實施例2 (附圖10)癸燒/聲波提取對微擬球藻屬的延長的生長的影響在模擬的露天生長條件(30ppt，26-37°C，14 10的1000umol，F(xiàn)/2)下，裝備有混 合器和PH控制的( 7. 2)CO2氣體輸入的微擬球藻屬物種的12升水族箱，其25%的培養(yǎng) 物體積每日取出，用癸烷(15分鐘)和聲波(2秒)能量可變地(0-25%的全部分)提取脂 質，傾倒溶劑，然后返回培養(yǎng)物，同時除去剩余的未處理的部分(0-25% )，干燥并用己烷提 取。附圖顯示了對處理的每日暴露是可耐受的，具有更高初始細胞濃度的培養(yǎng)物進行得更 好(正面的生長)，提高癸烷/超聲波暴露的水平達到每天培養(yǎng)物體積的25%增加了生長 速度和產(chǎn)生的培養(yǎng)物生物質。實施例3 (附圖11)用經(jīng)濟的溶劑提取微擬球藻屬物種(100mL，26°C，SOumol，F(xiàn)/2)的相同的培養(yǎng)物(η = 2)用經(jīng)濟的替 代性提取溶劑(Varsol 1 (環(huán)狀的石蠟)、Isopar L (石蠟)，通過Univar獲得的EXXON產(chǎn) 品)的起始暴露(15分鐘)和超聲波能量(2秒，40kHz)處理，然后生長144小時。附圖顯 示了暴露于isopar L和varsol 1的藻類保持了幾乎與未處理的對照相同的生長速度，表 明了它們在非破壞性提取過程中的可用性。實施例4 酵母材料的非破壞性溶劑提取過程Red Star 〒■白勺 舌胃(酉良胃―(Saccharomyces cerevisiae))酵母提取月示葡萄糖培養(yǎng)基(ATCC#1245)Isopar L(Univar 的 EXXON)過程和結果一克干酵母添加到200ml的酵母提取月示葡萄糖培養(yǎng)基(YEPD)并在室溫下200rpm 搖動孵育過夜。IOmL這種培養(yǎng)物添加到150mL的YEPD中，如上述的生長。然后，20ml這種 過夜的酵母繼代培養(yǎng)物與20ml的Isopar L組合并渦旋。然后，在250mL錐形燒瓶中良好混 合的樣品簡短地超聲，并轉移到50mL試管來促進溶劑分離。在提取之前，ImL的過夜培養(yǎng)物 添加到15mmX100mm試管的8mLYEPD中，孵育過夜。在溶劑暴露之后ImL添加到15mmX100mm 試管中的8mL YEPD中，孵育過夜。暴露前和暴露后的培養(yǎng)物在750nM處的光學密度(A75tl) 在過夜孵育之后測量。溶劑暴露前的培養(yǎng)物的A75tl 1. 66 ；1. 67。溶劑暴露后的培養(yǎng)物的OD 1. 83 ；1. 88。溶劑暴露之前和之后的相似的~5(|表明，與非破壞性提取過程類似的溶劑暴露 不減低酵母的生長能力。實施例5 各種藻類對溶劑穩(wěn)定性的物種篩選類似于實施例4，表1含有的數(shù)據(jù)顯示了溶劑提取在其他菌株中具有類似的效果。表1 實施例6 除去乳劑的后處理雖然能夠加速從細胞的脂質提取，當暴露于超聲波能量或強力的混合時，水溶液 中的溶劑常常形成非常穩(wěn)定的乳劑。水溶液的這種混濁(乳劑)是由即使在很長的沉降時 間之后不容易聚結的霧化的溶劑產(chǎn)生的。本領域技術人員利用一些方法來加速溶劑從水性 部分的分離。這些包括使用微過濾(例如，硼硅酸鹽微纖維)、超聲駐波、聚結介質、水力旋 流器、添加絮凝劑(例如，鋁)或氣體浮集法。這些方法在速度和效率方面不同，但是將從 水溶液中選擇性地除去痕量溶劑，容許它的重俘獲，并防止?jié)撛诘南到y(tǒng)損耗。例如，通過在 350nm處通過Icm光程的光透過的降低來定量的，通過乳劑的微過濾，有效地聚結溶劑，在 水中溶劑的乳劑(0. 03% ) JA 75%澄清到100%光透過。實施例7 微擬球藻屬油從溶劑的蒸傭溶劑(Isopar L)和提取的溶質(微擬球藻屬藻類油)的提取混合物從非破壞性 提取過程試驗系統(tǒng)(NDEP)的流出溶劑罐中移出。然后測量Isopar L和藻類油混合物的體 積。然后，這種混合物置于圓底燒瓶中，附著到Buchi 210/215旋轉蒸發(fā)器(Rotovap)上。 冷的自來水通過冷凝器，蒸餾瓶的油浴設置在140°C。一旦油浴達到140°C，對整個系統(tǒng)抽 85mbar的真空。在Rotovap內高溫和低壓的意圖是利用Isopar L和藻類油之間的蒸氣壓差異。當蒸餾開始時，氣體的Isopar L穿過儀器到冷凝器，然后回到液態(tài)，采集在接受瓶中。 雖然起始的蒸餾參數(shù)(140°C和85mbar)足以開始Isopar L從蒸餾瓶的蒸發(fā)，這些條件不滿 足Isopar L從藻類油中的完全蒸餾。這可能是由于Isopar L作為混合溶劑相對于單組分 的性質。當蒸餾開始變慢時，通過冷凝的缺乏所觀察到的，Rotovap中的真空度按5毫巴增 加量來提高，直到蒸餾再次開始。每當注意到蒸餾停止或減慢時，重復這種提高真空度的操 作，直到達到35mbar的極限真空度。在實驗的結束時，測量在接受瓶中回收的Isopar L的 體積，以及保留在蒸餾瓶內的藻類油的體積。實施例8 從提取介質回收脂質藻類的某些株中含有的脂質具有作為運輸燃料和其他能量應用的價值。這些脂質 必需生長、收獲，然后純化/濃縮以具有經(jīng)濟價值。在純化和提取過程之前，可能必需的是 調節(jié)所述藻類以改善提取效率。這種過程是高度可變的，將類似于油料種子調節(jié)，其在US 專利申請US2008/0269513中描述了。這種循環(huán)中的關鍵是純化和濃縮步驟。幾種不同的 方法適合于從本發(fā)明使用的溶劑中移除提取的脂質。吸附劑被用于從溶劑中有效地移除脂質，所述吸附劑利用表面現(xiàn)象來結合提取的 脂質，然后在希望的時候進行處理來釋放脂質。吸附劑可以是活性碳、礬土、硅膠、分子篩， 等等。脂質通過壓力和/或溫度循環(huán)來除去，吸附劑再次用于進一步的提取。脂質還可以使用利用溫度和壓力的流體/混合處理來提取。這種技術依靠提取溶 劑和要純化的脂質的物理性質的相對差異。這種的商業(yè)上的實例包括結晶、溶質排除和三 元提取。脂質和候選溶劑(例如，癸烷、十二烷、ISOPAR、VarS0l)具有廣泛的可混性范圍的 事實，容許使用部分飽和的提取流體使之成為用于純化的可行的途徑。反滲透和半透膜常常用于根據(jù)溶解度或實際的分子大小來分離化學物質。這些容 許溶劑或脂質穿過它們，優(yōu)先地引起溶劑和溶質的有效的分離。這些技術類似于用于液體 和氣體的，在關于天然氣的純化的美國專利申請20080141714中更詳細地描述了。在此設 想用于生物相容的溶劑和提取的脂質的分離的系統(tǒng)在功能上和設備要求上是類似的。在期望分離時，蒸汽壓縮蒸餾可以用于任何兩種成分的液體混合物。這種系統(tǒng)通 過使用蒸汽壓縮和多個熱交換器實現(xiàn)了高效率(低成本)。這種方法在美國專利4，539，076 中詳細地描述了。真空蒸餾可以在循環(huán)中與蒸汽壓縮蒸餾組合使用，在此希望實現(xiàn)在降低的溫度下 的分離，從而降低要分離的一種或更多種成分的熱降解。這種技術是良好地確立的，在文獻 中廣泛地描述了。任何上述純化方法可以組合，來以分步的方式進行溶劑和溶質(藻類油)的更完 全的分離。 通過提高光合效率增強脂質產(chǎn)量 限制光合效率和因此的作物或生物質生產(chǎn)力的主要因素是葉綠素不能吸收超過 50%的在地球表面存在的可用太陽能(附圖18)。在400和600nm之間的可見光的主要窗 口不被葉綠素吸收(附圖19)。為了克服這種限制，某些光合生物(藍細菌和紅藻)合成了 其他的光采集輔助色素，包括類胡蘿卜素和藻膽蛋白，它們采集400到600nm之間的光。這 些色素將吸收的能量通過共振能量傳遞機制轉移到葉綠素。植物和大多數(shù)真核藻類，除了 紅藻之外，缺乏這些輔助色素，不能有效地吸收400-600nm之間的光線。
示范性的實施方式通過吸收通常不用的光(例如，400-600nm之間的光)，并將這 種能量在更為可用的波長(例如，650-680nm之間)下發(fā)射，解決了光采集方面的這種局限 性。優(yōu)選的光發(fā)射將主要在葉綠素吸收光譜的紅色區(qū)域。雖然葉綠素在光譜的藍色和紅色 部分吸收光線，是與紅色中的激發(fā)相應的最低激發(fā)態(tài)驅動了光合作用中的光化學。因而，由 于與染料和它們的熒光發(fā)射之間的能量轉移相關的振動和非輻射過程的小的能量損失不 會顯著地影響系統(tǒng)的效率。具有重疊的激發(fā)和熒光發(fā)射光譜的一系列染料(如通過附圖18中顯示的實例染 料所例示的)可以以足夠高的濃度包埋到薄膜中，以優(yōu)化大多數(shù)藍光(例如Alexa 488)和 紅光(例如，Alexa 660)吸收色素之間的能量轉移。光線可以由最低能量熒光染料(例如， Alexa660)發(fā)射，這種光線的發(fā)射將與葉綠素的紅色吸收光譜(620-690nm)匹配。光合生物 可采集的光子數(shù)量的提高，特別是不會使光合機制飽和的光強度的提高，將提高光合作用 和生物質產(chǎn)量。這些薄膜可以置于植物上或生物反應器中，來增強光合光采集效率。此外， 染料可以摻入菲涅耳透鏡中，菲涅耳透鏡將環(huán)境光聚焦到培養(yǎng)物上。被工程化以具有光合 作用最適的更高光飽和度的生物體(例如，通過葉綠素a/b光采集復合物的消除)可能顯 示利用這種技術在光合效率方面的最大改善。在某些示范性的實施方式中，波長移動染料可以摻入到顆粒中，所述顆?？梢詰?浮在生長培養(yǎng)基中。這具有在所有的方向上重新發(fā)射被藻類捕獲的波長移動的光線的優(yōu) 點。相比之下，具有波長移動染料的生物反應器覆蓋物由于再輻射回大氣，可能損失50%的 波長移動的光。顆?？梢灾瞥设F磁性的，從而它們可以在溶劑提取之前容易地從培養(yǎng)物中 提取。實施例為了促進對本發(fā)明的更完整的了解，以下提供了許多實施例。然而，本發(fā)明的范圍 不應限于在這些實施例中公開的具體的實施方式，其僅用于例示的目的。實施例9:包埋在聚碳酸酯中的UV吸收染料調節(jié)用于藻類生長的光質量的效果具有包埋的染料(高藍色#_3680，Bayer Material Science LLC)的聚碳酸酯可 以用于過濾含有在光能自養(yǎng)培養(yǎng)基中生長的藻類的燒瓶上的天然日光。這種染料將葉綠素 不吸收的紫外光(300-400nm)移動到可被藻類中的葉綠素更有效地用于光合作用的藍色 范圍中。實施例10 在溶液中的UV吸收染料調節(jié)用于藻類生長的光質量的效果做為選擇，波長移動濾器不是染料包埋的聚碳酸酯，而是溶于緩沖液中的和在由 有機玻璃制成的儲池中含有的熒光染料(例如Alexa Fluor 647,Molecular Probes)。在 這種情況下，染料將黃色和桔色光線(以及更小的程度上，綠色光線)移動到葉綠素最有效 地吸收的紅光的范圍。儲池的邊緣被密封，從而僅到達培養(yǎng)物的光線穿過染料溶液。實施例11 在存在用光移動染料包被的磁件顆粒的情況下的藻類牛長在另一個實施方式中，染料可以摻入到磁性顆粒中(或表面上)。例如，Alexa Fluor 647的琥珀酰亞胺基酯形式可以經(jīng)由氨甲酰鍵綴合到小的順磁性珠子。珠子然后添 加到藻類的培養(yǎng)燒瓶中。培養(yǎng)物可以在全向燈光(即，不在光箱中)中生長，通過搖動或攪 動來混合。珠子可以在收回樣品之前從藻類培養(yǎng)物中磁性地抽出。以上描述的染料允許培養(yǎng)物與波長移動染料吸收光合作用不有效利用的光線波長并發(fā)射葉綠素最有效吸收的藍色或紅色波長的能力成比例地更快生長。培養(yǎng)物應當大力 地充分混合或曝氣以防止CO2限制。在某些實例中，光強度應當保持接近200mmol n^sec—1， 以最大化生長而不使光合設備飽和和蓋過波長移動染料的作用。光可用性將直接受到太陽的位置和角度的影響。光合生物不能捕獲從傾斜角度射 入的光線的那么多的能量。然而，示范性的實施方式利用工程化的溶液克服了低光通量，其 可以提高光生物反應器中的光通量水平。附圖19說明了可以用于增強光通量的一種方法。 在附圖19中，當光源以傾斜的角度接受時，利用菲涅耳透鏡來增強光的采集。其他設備，例 如，聚光鏡，也可以用于在缺乏LHC復合物的藻類中增強光通量水平。實施例12 將熒光染料附著到磁件珠子用于光頻移動實驗的方法吸收400到600nm范圍的光線的熒光染料對塑料珠子或塑料包被的順磁性珠子的 附著，通過捕獲不良利用的光波長，并且在對藻類光合作用理想的650到690nm區(qū)域中重新 發(fā)射熒光的所述珠子，將改善藻類細胞的光合效率。然后，這些珠子在使用后收回，從而人 們可以再利用或再循環(huán)。如果珠子相當大，它們可以被濾出，然而過濾不是有效率的過程， 需要堵塞的濾器的周期性置換，將比小的珠子具有更高的遮蔽效應。通過使用順磁性的珠 子，珠子可以用永久磁性材料或電磁體高效率地從液態(tài)中回收。類似的分選過程是一些分 子生物學技術中常見的，包括核酸捕獲、體外展示、免疫沉淀和His標簽化的蛋白質純化。具有修飾的表面基團的順磁性珠子的幾個來源是可容易地獲得的。 Dynabeads(Invitrogen)是很好的實例，因為它們在大小和形狀上均一，提供了多種表面修 飾，三種大小范圍(1、2.8和4.5μπι)，并以用于工業(yè)應用的批量來提供。它們提供了具有 環(huán)氧_、胺_、甲苯磺?；鵢、和羧酸_表面基團的疏水性或親水性表面特征。每種表面修飾 具有它自己的配體特異性和偶聯(lián)緩沖液。對于相關的表面修飾和反應性配體參見下文的 表格。另外，它們提供了具有可與SH-反應試劑例如NHS-酯使用的末端胺基(Dynabeads Μ-270胺)的珠子。表2. 在表2中；Invitrogen的表面修飾的順磁性珠子(Dynabeads )和相關的化學 作用。縮寫PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；EDCI，1-乙基-3-(3-二乙基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸 鹽；MES，2- (N-嗎啉代)乙烷磺酸；NHS，(N-羥基-琥珀酰亞胺基)_酯；
為了將配體(修飾的熒光染料)結合到珠子上，珠子在它們相應的儲存緩沖液中 洗滌。這個步驟之后是在含有它們的相應活化試劑的偶聯(lián)緩沖液中活化(如果需要)最多 30分鐘。珠子然后在偶聯(lián)緩沖液中洗滌幾次，然后與在它們的相應偶聯(lián)緩沖液中懸浮到合 適濃度和體積的染料混合。染料/珠子混合物然后孵育幾小時，頻繁翻轉在室溫下過夜。珠 子然后磁性地從偶聯(lián)緩沖液分離，用沒有染料的新鮮的偶聯(lián)緩沖液洗滌幾次。取決于染料 的要求，這隨后在合適的儲存緩沖液中再洗滌一次。珠子的其他包被可以通過簡單洗滌和在期望的溶液中孵育來實現(xiàn)。例如，可能需 要的是用疏水性層包被熒光標記的珠子來防止染料的氧化。這可以通過在疏水性溶液例如 rain-coat 或Dow’ s Hypod 聚烯烴中孵育珠子來實現(xiàn)。這些是液化的乳劑，其容許材 料被噴霧或浸入到懸浮液中用于均勻的包被。在珠子用疏水性溶液包被之后，它們可以再 次洗滌并干燥保存，或在室溫下在暗處在合適的緩沖液中長時間保存。人們可以使用用琥珀酰亞胺基酯(Molecular Probes cat. #A20000)預活化的 Alexa 488熒光染料。這種染料(3 μ g)與107珠子混合到1_2X IO9珠子每mL的終濃度。 Dynabeads M-270胺需要根據(jù)廠家指導的預洗滌。簡要地，其通過旋渦或快速吸移重懸浮， 然后轉移到反應容器。用磁鐵將珠子采集到器皿的一側，除去液體。添加反應緩沖液(具 有0. 15M NaCUpH 7. 4的0. IM磷酸鈉緩沖液)，珠子再次渦旋或快速地吸移。利用磁鐵從 珠子中分離緩沖液，倒出緩沖液。洗滌的珠子調整為正確的體積，從而，當與Alexa 488NHS 酯混合時，它們是1-2X109珠子每mL。在室溫下器皿的緩慢的傾斜運動以維持混合，孵育 30分鐘。在這種孵育之后，置于磁鐵上來從標記的珠子分離未反應的染料，丟棄緩沖溶液。 在室溫下在0. 05M Tris pH 7中洗滌包被的珠子至少15分鐘，來淬滅未反應的NHS，再一 次使用緩慢的傾斜混合動作。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或等效的緩沖液中洗滌四次。重懸 浮在具有少量表面活性劑，例如NP-40以防止結塊的緩沖液中。這些可以在低溫保存待用。 長期保存應當有防腐劑添加，例如0. 02%的疊氮化鈉。適合于這一點的另一種染料是Alexa 660 染料(Molecular probescat. A20007), 其吸收光合作用中無用的其他區(qū)域，但是在對葉綠素吸收有用的的區(qū)域中發(fā)射。作為NHS 酯也是如此，并且可以如上對Alexa 488所述的來反應。實施例13 生產(chǎn)非磁性的珠子的方法混合清澈的聚合材料所需的設備由具有注射口用于氣體添加劑導入的單個或兩 個螺旋多夾套擠壓機組成。在擠壓通過單個或多個端口壓模之后，延伸的鏈注入到水浴中， 在此它們被冷卻。鏈大小由可變速度的皮帶控制，所述皮帶起到鏈牽引器和造粒機進料器 的作用。硬化的團塊將有適當?shù)谋壤膬煞N(或更多種)有機染料包埋到聚合物中，氣體 將被控制來實現(xiàn)期望的漂浮性。在前端需要進料斗，計量螺桿將染料給料入計量的聚合物流中，在此它們將預混 合并給料到擠壓機中。氣體朝向擠壓機的末端注入到擠壓機中，在此聚合物和染料融化并 均勻化。這種加工設備類似于位于Glaskow KY的稱為Alcan的Alcoa子公司的。它們用 炭黑加工未用過的聚苯乙烯，在雙螺桿擠壓機中重新研磨不合規(guī)格的產(chǎn)品和其他添加劑并 注射異戊烷。延伸的海綿狀的板連續(xù)地給料，來空氣冷卻并層疊。最終產(chǎn)物是用于可擦除 的記號呈示的重量輕的白板。
公開物以下參考文獻和在此引用但未列于此的其他參考文獻，以提供示范性的過程和補 充在此闡述的內容的其他細節(jié)的程度，通過完全引用專門地合并在此?！?Ahmed FI and Russell C(1975).Synergism between ultrasonic waves and hydrogen peroxide in the killing of micro-organisms. J Appl Bacteriol 39，31—40·· Becker EW(1994)Microalgae biotechnology and microbiology. Cambridge Univ. Press. New York，NY.· Brown LM(1996)Uptake of carbon dioxide from flue gas by microalgae. Energy Conversion and Management 37 1363-1367. 36· Doucha, J.，and Livansky, K. (2006). Productivity, C02/02 exchange and hydraulics in outdoor open high density microalgal(Ch/ore//a sp.) photobioreactors operated in a middle and southern European climate. Journal of Applied Phycology 18,811-826.· Hejasi, M. A. and Wijffels, R. H. (2004). Milking of microalgae. Trends in Biotechnology,22，189-194.· Hejasi，M. A.，de LamarIiere, C.，Rocha，J. M. S.，Vermue, Μ.，Tramper, J.，and Wijffels, R. H. (2002). Biotechnology and Bioengineering 79，29-36.· Hejasi, M. A. ， Holwerda, E. ， and Wijffels, R. H. (2004). Milking microalga Dunaliella salina for beta-carotene production in two-phase bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 85，475-481.· Kadam, K. L. (1997). Power plant flue gas as a source of C02 for microalgae cultivation :Economic impact of different process options.Energy Conversion and Management 38，S505-S510.-Melecchi MISiPeres VFiDariva CiZini CAiAbad FCiMartinez MM and Caramao EB(2006). Optimization of the sonication extraction method of Hibiscus Tiliaceus L. flowers. Ultrason Sonochem 13，242—250.· Miao，X.，and Wu, Q. (2006). Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil，Bioresource Technology 97,841-846.· Richmond A(2004)Handbook of microalgal culture biotechnology and applied phycology. Blackwell Publishing，Ames，la.· Sheehan, J.，Dunahay，Τ.，Benemann, J.，and Roessler，P. (1998). A look back at the U. S. Department of Energy ' s aquatic species program-biodiesel from algae. National Renewable Energy Laboratory, Golden，Colorado.· Tiehm A(2001)Combination of Ultrasonic and Biological Pollutant Degradation.In Advances in Sonochemistry :U1trasound in Environmental Protection Vol. 6，Mason T J and Tiehm A，Eds.，JAI Press :Stamford，CT，25—58.· Toma M，Vinatoru M，Paniwnyk L and Mason TJ(2001)Inyestigation of theeffects of ultrasound on vegetal tissues during solvent extraction. Ultrason Sonochem 8，137—142.
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權利要求
一種從含油生物體提取油的方法，包括混合含有含油生物體的至少一部分培養(yǎng)物和從含油生物體提取油的溶劑來獲得溶劑 生物體混合物；將所述溶劑 生物體混合物導入分配室中來獲得含有活的提取的生物體的提取的水性部分和溶劑 油部分；以及將所述活的提取的生物體再循環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。
2.權利要求1的方法，其中所述方法進一步包括步驟 蒸餾所述溶劑_油部分來獲得可用的油。
3.權利要求1的方法，其中所述方法進一步包括步驟蒸餾所述溶劑_油部分來獲得可用的油和回收的溶劑；以及將所述回收的溶劑的至少 一部分再循環(huán)用于所述混合步驟中。
4.權利要求1的方法，其中所述含油生物體經(jīng)歷混合和再循環(huán)的至少兩個獨立的周期。
5.權利要求1的方法，其中所述含油生物體是藻類。
6.權利要求5的方法，其中所述藻類選自以下構成的組硅藻綱株、綠藻綱、藍藻綱、黃藻綱、金藻綱、小球藻屬、Crypthecodinium, Schizocytrium、微擬球藻屬、Ulkenia,小環(huán)藻屬、舟形藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、褐指藻屬 禾口 Thaustochytrids0
7.權利要求1的方法，其中所述含油生物體是含油酵母。
8.權利要求7中的方法，其中所述酵母選自由紅酵母屬、酵母屬和Apiotrichum菌株構 成的組。
9.權利要求1的方法，其中所述含油生物體是含油真菌。
10.權利要求9中的方法，其中所述真菌包括被孢霉屬菌株。
11.權利要求1的方法，其中所述溶劑選自由C4-C16烴類構成的組。
12.權利要求1的方法，其中所述溶劑選自由C10-C16烴類構成的組。
13.權利要求1的方法，其中所述含油生物體被遺傳工程化來增強脂質生產(chǎn)。
14.權利要求1的方法，其中所述含油生物體在混合步驟之前被濃縮。
15.權利要求1的方法，其中在混合步驟的至少一部分期間使用超聲處理。
16.權利要求15的方法，其中所述超聲處理在20kHz和IMHz之間的頻率下進行。
17.權利要求15的方法，其中所述超聲處理在20kHz和IOOkHz之間的頻率下進行。
18.權利要求15的方法，其中所述超聲處理在40kHz的頻率下進行。
19.權利要求1的方法，其中所述混合步驟由超聲處理和機械混合的至少一種來促進。
20.一種從含油藻類提取油的方法，包括混合含有所述藻類的培養(yǎng)物的至少一部分和從所述藻類提取油的溶劑來獲得溶 劑_藻類混合物；將所述溶劑_藻類混合物導入分配室中來獲得含有活的提取的藻類的提取的水性部 分和溶劑_油部分；和將所述活的提取的藻類再循環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。
21.一種從光合含油生物體提取油的方法，包括混合含有光合含油生物體的培養(yǎng)物的至少一部分和從所述生物體提取油的溶劑來獲得溶劑_生物體混合物；將所述溶劑_生物體混合物導入分配室來獲得含有活的提取的 生物體的提取的水性部分和溶劑_油部分；和將所述活的提取的生物體再循環(huán)到培養(yǎng)系統(tǒng)中。
22.權利要求21的方法，其中所述方法進一步包括步驟提供波長移動染料，所述染料適合于提高所述培養(yǎng)系統(tǒng)中所述光合藻類可獲得的可用 光子的數(shù)量。
23.權利要求22的方法，其中所述波長移動染料被摻入到顆粒中。
24.權利要求22的方法，其中所述波長移動染料被摻入到薄膜中。
25.權利要求21的方法，其中所述方法進一步包括步驟提供菲涅耳透鏡，其適合于當光源以傾斜的角度接受時提高所述光合藻類可獲得的光 子的數(shù)量。
26.權利要求25的方法，其中所述波長移動染料被摻入到菲涅耳透鏡中。
27.權利要求21的方法，其中所述方法進一步包括步驟 蒸餾所述溶劑_油部分來獲得可用的油。
28.權利要求1或21的方法，其中所述方法是連續(xù)的。
29.用于進行權利要求1-28的任一項的方法的裝置。
全文摘要
本發(fā)明的實施方式包括利用機械和化學工程化策略來實現(xiàn)含油生物體的生物燃料生產(chǎn)中再更大的效率的裝置、組合物和方法。這些提高的效率可以通過應用在此公開的靶向的和良好設計的化學和機械工程方法以實現(xiàn)非破壞性提取過程(NDEP)來實現(xiàn)。
文檔編號C10L1/30GK101932714SQ200880126110
公開日2010年12月29日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權日2007年12月4日
發(fā)明者R·T·塞爾 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會