專利名稱：：一種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及蛋白質(zhì)相互作用，具體涉及一種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)揭示了細(xì)胞的大部分生物學(xué)功能是通過(guò)多個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)介導(dǎo)的，雖然有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用，但是大部分的蛋白質(zhì)都是與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式來(lái)發(fā)揮作用的。細(xì)胞接受外源或是內(nèi)源的信號(hào)(生理的、病理的、以及藥物等)，通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)傳遞途徑，調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)，以保持其生物學(xué)特性和發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。在上述整個(gè)過(guò)程中，蛋白質(zhì)之間的相互作用都參與其間，并且隨著時(shí)間和空間的變化而變化(l)。由于細(xì)胞中蛋白質(zhì)的數(shù)量龐大，因此，在后基因組時(shí)代，要更好地理解細(xì)胞的生物學(xué)活性、理解某些藥物的作用機(jī)制，高通量的蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)就至關(guān)重要。蛋白質(zhì)相互作用的研究將有助于理解細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，對(duì)尋找和開(kāi)發(fā)相關(guān)的對(duì)疾病進(jìn)行有針對(duì)性治療的藥物和治療方法都十分重要。本領(lǐng)域公認(rèn)，較為理想的用于檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的方法，應(yīng)該具有特異性并能夠盡量的反映蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)下的相互作用，而且要高效，能適應(yīng)高通量檢測(cè)的需求。但是目前的有關(guān)檢測(cè)方法均難以滿足上述需求，它們的主要缺陷表現(xiàn)為起始細(xì)胞用量巨大，特異性不高，耗時(shí)費(fèi)力。親和純化技術(shù)主要基于特異性抗體或與靶蛋白融合的標(biāo)簽肽段來(lái)富集耙蛋白及相應(yīng)的相互作用蛋白，而在此基礎(chǔ)上發(fā)展的串聯(lián)親和純化(tandemaffinitypurification,TAP)技術(shù)則串行兩步的親和純化。該方法的優(yōu)點(diǎn)是l)不需要過(guò)多的背景知識(shí)就可以得到大量含靶蛋白的復(fù)合體，大量與靶蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)可鑒定出；2)蛋白表達(dá)及與復(fù)合物的結(jié)合都接近生理水平，是一種檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法；3)TAP采用兩步親和純化，提高了純化產(chǎn)物的特異性(2)。但TAP技術(shù)尚存在如下缺點(diǎn)l)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中天然表達(dá)的蛋白量很少，需要超大規(guī)模的培養(yǎng)細(xì)胞(一般達(dá)到109數(shù)量級(jí))才能獲得用于質(zhì)譜鑒定的蛋白量；2)多步洗滌的過(guò)程中弱的和瞬時(shí)的相互作用復(fù)合物會(huì)丟失；3)標(biāo)簽肽段過(guò)大，可能妨礙靶蛋白與其它蛋白的相互作用。為了在親和純化過(guò)程中獲得更多的靶蛋白，Burckstummer等更改了傳統(tǒng)的標(biāo)簽肽段，分別用蛋白G和鏈霉親合素結(jié)合肽(38個(gè)氨基酸)取代原來(lái)是雙標(biāo)簽(3)。該方法可使最初的細(xì)胞使用量減少至5X107，但該方法仍然沒(méi)有避免TAP技術(shù)的一些固有缺陷，如標(biāo)簽肽段過(guò)大，仍需多步洗滌純化等等。為了簡(jiǎn)化純化步驟，deBoer等建立了基于生物素-鏈霉親合素系統(tǒng)的一步親和純化方法(4)。此方法首先與靶蛋白融合了一個(gè)人工的可生物素化的小肽段標(biāo)簽(23個(gè)氨基酸)，該標(biāo)簽可被在細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物素化酶BirA生物素化，被生物素化的靶蛋白最終由鏈霉親合素微珠結(jié)合富集。由于生物素-鏈霉親合素之間的相互作用力是目前己知的最強(qiáng)的存在于自然界中的非共價(jià)作用力，比抗體和通常使用的其它親和標(biāo)簽肽段高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，所以利用該系統(tǒng)可一步特異性的純化耙蛋白及其相互作用蛋白。然而，建立在親和純化基礎(chǔ)上的技術(shù)仍然會(huì)得到一些非特異性結(jié)合的蛋白，因此如何將與靶蛋白特異性相互作用的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)同樣變得十分重要。穩(wěn)定同位素特征標(biāo)記生物質(zhì)譜可以很好的解決這個(gè)問(wèn)題。這一技術(shù)將不同質(zhì)量的穩(wěn)定同位素如碳13或氮"或氘作為在DNA和蛋白質(zhì)分子中特征質(zhì)量標(biāo)記引入生物質(zhì)譜領(lǐng)域(5)。在蛋白質(zhì)定量研究中，將穩(wěn)定同位素碳13或氮15標(biāo)記的某種氨基酸作為標(biāo)記載體加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，由此所產(chǎn)生的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)群體會(huì)在相應(yīng)氨基酸序列的位置包含這些比自然氨基酸更重的標(biāo)記載體，從而在質(zhì)譜上很容易被區(qū)分開(kāi)來(lái)，該技術(shù)被稱為氨基酸代謝標(biāo)記(aminoacid-codedmasstagging,AACT)技術(shù)(6，7)，或者SILAC(stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)技術(shù)(8)。在蛋白質(zhì)相互作用研究中，Chen等將AACT技術(shù)與一步親和純化技術(shù)結(jié)合起來(lái)，又發(fā)展了雙標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，即同時(shí)將靶蛋白用親和純化肽段標(biāo)簽(如FLAG、Myc等)和穩(wěn)定同位素標(biāo)記(9-11)，將標(biāo)記與未標(biāo)記的細(xì)胞等比例混合后提取總蛋白，靶蛋白及其復(fù)合物經(jīng)肽段標(biāo)簽的抗體親和純化后，質(zhì)譜鑒定，通過(guò)同位素標(biāo)記與否的肽質(zhì)量差異來(lái)確定特異性相互作用蛋白。利用該方法，Chen等進(jìn)行了一系列的蛋白質(zhì)相互作用研究，包括巨噬細(xì)胞中TLR信號(hào)通路關(guān)鍵接頭分子MyD88的相互作用蛋白(9，10)，以及DNA修復(fù)過(guò)程中組蛋白H2AX的相互作用蛋白(11)，發(fā)現(xiàn)了一些新的重要相互作用蛋白分子。但是，由于該方法使用基于抗體相互作用的親和純化肽段標(biāo)簽，因此仍需要大量的起始細(xì)胞(約109或更多)用來(lái)富集靶蛋白，從而制約了使用該方法進(jìn)行大規(guī)模高通量的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)，尤其是信號(hào)通路中低豐度蛋白質(zhì)的相互作用檢測(cè)與研究。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有下述文獻(xiàn)(分別被引用于上文中)。現(xiàn)有技術(shù)1.BerggardT,LinseS，JamesP.Methodsforthedetectionandanalysisofprotein-proteininteractions.Proteomics.2007，7:833-42.2.關(guān)薇，王建，賀福初.大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究方法進(jìn)展.生命科學(xué).2006，18:507-12.3.BurckstummerT,BennettKL，PreradovicA，SchutzeG，HantschelO,Superti-FurgaG,BauchA.Anefficienttandemaffinitypurificationprocedureforinteractionproteomicsinmammaliancells.NatMethods.2006,3:1013-9.4.deBoerE,RodriguezP，BonteE,KrijgsveldJ,KatsantoniE,HeckA,GrosveldF，Strouboulis丄Efficientbiotinylationandsingle-steppurificationoftaggedtranscriptionfactorsinmammaliancellsandtransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA.2003,100:7480-5.5.ChenX,SmithLM,BradburyEM.Site-specificmasstaggingwithstableisotopesinproteinsforaccurateandefficientproteinidentification.AnalChem.2000,72:1134-43.6.ZhuH，PanS,GuS，BradburyEM，ChenX.Aminoacidresiduespecificstableisotopelabelingforquantitativeproteomics.RapidCommunMassSpectrom.2002，16:2115-23.7.ChenX,Sunl_,YuY,XueY,YangP.Aminoacid-codedtaggingapproachesinquantitativeproteomics.ExpertRevProteomics.2007，4:25-37.8.OngSE，BlagoevB，KratchmarovaI,KristensenDB,SteenH，PandeyA,MannM.Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture,SII_AC,asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics.MolCellProteomics.2002,1:376-86.9.WangT，GuS，RonniT，DuYC,ChenX.Invivodual-taggingproteomicapproachinstudyingsignalingpathwaysinimmuneresponse.JProteomeRes.2005，4:941-9.10.WangT，ChuangTH，RonniT,CaiH,SunHQ,YinHL,ChenX.FlightlessIHomologNegativelyModulatestheTl_RPathway.JImmunol.2006，176:1355-1362.11.DuYC,GuS,ZhouJ,WangT，CaiH,MaclnnesMA，BradburyEM，ChenX.TheDynamicAlterationsofH2AXComplexduringDNARepairDetectedbyaProteomicApproachRevealtheCriticalRolesofCa2+/CalmodulinintheIonizingRadiation-inducedCellCycleArrest.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法。本發(fā)明利用高效瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)，改進(jìn)生物素-鏈霉親合素一步親和純化技術(shù)，應(yīng)用只15個(gè)氨基酸的標(biāo)簽，整合同位素標(biāo)記技術(shù)，建立了本發(fā)明蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法。本發(fā)明方法采用用量為107數(shù)量級(jí)的起始細(xì)胞，應(yīng)用于原代細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)，特異性和效率明顯高于現(xiàn)有技術(shù)方法，能鑒定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬時(shí)相互作用，同時(shí)檢測(cè)耗時(shí)和費(fèi)用也大為減少。本方法包括下述步驟1、構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體建立含有表達(dá)可生物素化的人工小肽段標(biāo)簽(由已知公開(kāi)文獻(xiàn)獲得-Beckett,D.，Kovaleva，E.&Schatz，P.J.(1999)ProteinSci.8，921-929，15個(gè)氨基酸，基因序列為TCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA)的通用質(zhì)粒載體(基于Invitrogen公司的pcDNA3.1DirectionalTOPO載體)，該載體有兩個(gè)亞型，分別用于將肽段標(biāo)簽連于靶蛋白的N端和C端，分別命名為pAP-N和pAP-C;構(gòu)建含生物素化酶BirA基因的真核質(zhì)粒表達(dá)載體(命名為pBirA，所述基因具有序列1的序列，由PubMed檢索獲得)；2、人工小肽段標(biāo)簽的可生物素化通過(guò)在細(xì)胞中共瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)生物素化酶BirA基因?qū)崿F(xiàn)與靶蛋白融合的肽段標(biāo)簽的生物素化；3、建立一步親和純化方法被生物素化的靶蛋白通過(guò)鏈霉親合素磁珠富集純化，所采用的儀器和試劑為德國(guó)美天旎公司的免疫磁珠分離系統(tǒng)，具體操作方法參照該公司提供的說(shuō)明書；4、整合AACT技術(shù)與一步親和純化方法將細(xì)胞穩(wěn)定同位素標(biāo)記(AACT技術(shù))，按文獻(xiàn)報(bào)道)與可生物素化肽段標(biāo)簽一步親和純化技術(shù)整合；5、蛋白質(zhì)酶解、質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和蛋白鑒定相關(guān)操作方法參照文獻(xiàn)報(bào)道(JProteomeRes.2005,4:941-9;MolCellProteomics.2006,5:1033-1044.)。本發(fā)明以研究293T細(xì)胞中的重要接頭蛋白14-3-3￡的相互作用蛋白作為實(shí)例，獲得最佳實(shí)驗(yàn)方案并建立了相應(yīng)的技術(shù)體系，能滿足高通量、高效蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)及研究的需求。具體實(shí)施例方式本發(fā)明以293T細(xì)胞中的重要接頭蛋白14-3-3e的相互作用蛋白作為實(shí)例，詳細(xì)闡述本發(fā)明方法及步驟。實(shí)施例11.構(gòu)建質(zhì)粒載體以含有表達(dá)可生物素化的人工小肽段標(biāo)簽的質(zhì)粒pAP-N為基礎(chǔ)，構(gòu)建同時(shí)含14-3-3e的質(zhì)粒PAP-N-1433。14-3-3e的基因序列插入pAP-N的Xbal和EcoRV酶切位點(diǎn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的中量提取采用lnvitrogen公司中抽試劑盒(貨號(hào)K210004)。2.細(xì)胞培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞(市購(gòu))為人的胚胎腎細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。穩(wěn)定細(xì)胞系于37'C、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其培養(yǎng)基為正常的或d3-Leu標(biāo)記的高糖DMEM。293T細(xì)胞用AACT技術(shù)標(biāo)記并培養(yǎng)在含10%透析胎牛血清、帶標(biāo)記氨基酸的DMEM培養(yǎng)液中淋為293T-d3)，同時(shí)未標(biāo)記的293T細(xì)胞則用含10%胎牛血清的普通DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(稱為293T-d0)。有關(guān)的AACT標(biāo)記技術(shù)可參閱現(xiàn)有技術(shù)(JProteomeRes.2005，4:941-9;MolCellProteomics.2006,5:1033-1044.)。3.以Lipofectamine2000脂質(zhì)體(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的流程參照Invitrogen公司脂質(zhì)體說(shuō)明書進(jìn)行(https:Z/catalog.invitrogen.com/index.cfmfuseaction=viewCatalog.viewProductDetails&productDescription=541)。本實(shí)施例在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中置等量的293T-d3和293T-dO細(xì)胞各3孔，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%左右，于細(xì)胞培養(yǎng)板中的3孔293T-d3細(xì)胞均轉(zhuǎn)染pAP-N-1433質(zhì)粒，而3孔293T-dO細(xì)胞則均共轉(zhuǎn)染pBirA和pAP-N-1433質(zhì)粒。4.提取細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，上述兩種細(xì)胞總共各用400微升裂解液(碧云天公司，Western及IP細(xì)胞裂解液，P0013),裂解細(xì)胞后獲得總蛋白，具體操作按裂解液說(shuō)明書。5.—步親和純化14-3-3e靶蛋白及復(fù)合物儀器和試劑使用德國(guó)美天旎公司的免疫磁珠分離系統(tǒng)，上述兩種400微升細(xì)胞裂解液分別和IOO微升鏈霉親合素磁珠結(jié)合反應(yīng)，具體的操作按公司說(shuō)明書提供的方法:(http:〃www.miltenyibiotec.com/en/PG—562—489—Display—technology,aspx禾口http:〃www.miltenyibiotec,com/download/datasheets/95/DS130-074-皿.pdf)。最后分別用IOO微升1XSDS蛋白上樣緩沖液分別洗出磁珠結(jié)合蛋白，混合兩者。6.蛋白分離得到的蛋白混合物在沸水中煮5分鐘，進(jìn)行常規(guī)的12W的SDS-PAGE膠電泳，至溴芬藍(lán)到達(dá)底部。7.蛋白質(zhì)酶解(膠內(nèi)酶解)1)水洗用前先用去離子水洗一下SDS-PAGE，浸泡幾十分鐘；2)切膠切成1平方毫米大小的膠粒，放入EP管中；3)脫色脫色液為50%ACN+50mMNH4HC03，50-100u1/次，振蕩洗滌2-3次，洗至顏色基本去掉；4)脫水先用50%ACN脫水，60-100u1/次，5min;然后用100%ACN再次脫水，脫水后膠粒會(huì)縮??；5)干燥將脫水后的膠粒用氮?dú)獯蹈苫?7'C烘至完全脫水，一般10分鐘以上；6)加酶原液(或儲(chǔ)備液)為100ng/u1,需稀釋8倍至12.5ng/y1Trypsin,10-20ul/次(酶20ul+140ul25/20mMNH4HC03),加完酶解液，放入4。C冰箱10-15min，以便酶被完全吸收，之后吸出多余酶液，再加入10-20u125/20mMNH4HC03，有時(shí)也可以用水，37'C酶解，振蕩過(guò)夜；7)提肽0.1%TFA+50%ACN,50u1，上清不吸出，超聲10min(超聲容器內(nèi)加冰)，離心后，收集上清于EP管中。再加50ul0.1%TFA+50%ACN，超聲10min，加冰，合并兩次的上清。8)凍干每個(gè)試管用膜封好，扎幾個(gè)孔，放入一8(TC，同時(shí)把冷凍干燥的架子也冷凍好，3-4小時(shí)后，放入低溫冷凍干燥機(jī)中凍干。將凍干好的樣品放入一80'C備用。上述有關(guān)操作還可參閱現(xiàn)有技術(shù)(JProteomeRes.2005，4:941-9;MolCellProteomics.2006，5:1033—1044.)。8.質(zhì)譜鑒定酶解的肽段進(jìn)行LC-MS/MS分離分析，具體操作是在配置有Finnigan動(dòng)態(tài)納噴霧源的LTQ-Orbitrap雜交質(zhì)譜(ThermoFinnigan,Bremen,Germany)。肽段混合物先用液相的流動(dòng)相溶解，然后上樣到一ZORBAX300SB-C18柱子(來(lái)自Agilent,4.6X250，5um)，流速為1.6ul/min，120min的梯度洗脫。流動(dòng)相A為含5%乙腈、0.1%甲酸的水相；流動(dòng)相B為含95%乙腈、0.1%甲酸的有機(jī)相。樣品用流動(dòng)相A溶解，肽段先用10W的流動(dòng)相B洗脫2.5min,然后采用一個(gè)線性梯度，于92.5min時(shí)流動(dòng)相B達(dá)到60%，在95.5min時(shí)，升至95%的流動(dòng)相B，保持在95%的流動(dòng)相中10min，然后在5min內(nèi)迅速將流動(dòng)相降為10X的流動(dòng)相B，使之平衡。LTQ-Orbitrap雜交質(zhì)譜按照依靠數(shù)據(jù)處理的模式進(jìn)行操作，采用前三個(gè)最強(qiáng)峰策略。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在一個(gè)掃描周期中，先在orbitr鄰中進(jìn)行質(zhì)荷比400-2000(m/z400-2000)的全質(zhì)量范圍掃描，質(zhì)量分辨率設(shè)為60000,然后在線性離子阱選取最強(qiáng)的3個(gè)母離子進(jìn)行串級(jí)掃描，單電荷離子在串級(jí)掃描時(shí)被剔除。9有關(guān)的操作還可參閱現(xiàn)有技術(shù)(JProteomeRes.2005，4:941-9;MolCellProteomics.2006，5:1033-1044.)。9.數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和蛋白鑒定使用TurboSequestV.27(rev.12)搜索引擎，將所得的所有的MS/MS質(zhì)譜進(jìn)行了人類數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，搜索參數(shù)設(shè)置如下胰酶特異性酶切，最大允許2個(gè)漏切位點(diǎn)；母離子的質(zhì)量誤差為10ppm，碎片離子的誤差為IDa;可變修飾為磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸(+79.9663)以及d3標(biāo)記的亮氨酸(+3.018)。所鑒定到的肽段用XCorr、肽的概率、deltaCn、肽質(zhì)量準(zhǔn)確度及不同的肽段數(shù)進(jìn)行過(guò)濾，XCorr設(shè)定為1.9、2.7、3.5，分別對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的2+、3+和4+母離子；deltaCn〉0.1;肽的概率〈0.001;肽的質(zhì)量準(zhǔn)確度〉0.01Da;兩條以上的肽段匹配一個(gè)蛋白。有關(guān)的操作還可參閱現(xiàn)有技術(shù)(JProteomeRes.2005,4:941-9;MolCellProteomics.2006，5:1033-1044.)。結(jié)果顯示，本發(fā)明以6孔板中總共6個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)量為起始，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞總共5X106，起始細(xì)胞量少，從細(xì)胞培養(yǎng)到得到相互作用復(fù)合物只需用3天時(shí)間，一次在293T細(xì)胞中共鑒定到297個(gè)14-3-3e的特異性相互作用蛋白。比較現(xiàn)有技術(shù)需用穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，從細(xì)胞培養(yǎng)到得相互作用復(fù)合物需用2個(gè)月左右的時(shí)間，本發(fā)明方法可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)及研究，具有高效、高特異性、省時(shí)省力省經(jīng)費(fèi)的優(yōu)勢(shì)。表1是293T細(xì)胞中檢測(cè)到的297個(gè)14-3-3e的特異性相互作用蛋白。表2是本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)方法的比較。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>673527.97IPI00149650.323398PPWD1766929.7IPI00215720.12332FMR1892349.12IPI00290439.16732SRPK1926671.44IPI00011253.36188RPS310228418.1IPI00006213.25108PCM111113885.4IP醒42487.284451KIAA18041227727.73IPI00021263.37534Y職Z1373004.98IPI00021786.15894RAF11465268.93IPI00020096.23831KLC11574560.49IPI00219330.23609ILF31659173.52IPI00012998.211052CPSF61790875.27IPI00396435.31665DHX151866080.77IPI00179713.610644IGF2BP21932874.17IPI00007188.5292SLC25A52011657.85IPI00008529.16181RPLP22129155.42IPI00000816.17531Y腿E2292433.83IPI00396370.58662EIF3B23129685.2IPI00022043.17248TSC124101933.6IP應(yīng)40楊.427044SND12534039.85IPI00219729.38402SLC25A112625804.39IPI00219685.551079NDUFA13271醒2.4IPI00449049.5142PARP12829785.91IPI00017334.15245PHB2915413.43IPI00029750.16229RPS243035777.4IPI00289907.784248FYTTD131178043.8IPI00220365.51981EIF4G13249734.93IPI00295387.551379CRLF33369697.31IPI00513803.310746麼3K23426210.74IP讓柳17.111051NUDT2135175328.8IPI00186194.49859CEP17036130027.8IPI00032355.39698P腿3750639.53IPI00030131.37112TMPO38109366.4IPI00003519.19343EFTUD23928322.64IPI00014472.1755C21orf24051236.25IPI00217963.33868KRT164146060.55IPI00440688.384271P0LDIP34279636.43IPI00019912.33295HSD17B44314777.81IPI00219153.46146RPL224463680.67IPI00658000.210643IGF2BP34589350.01IPI00014533.17343UBTF4685489.52IPI00171145.556907SPIRE147102296.8IPI00015952.11982EIF4G24832811.97IP翻07749.2374291NDUFS74917211.66IPI00221089.56207RPS1350166428.7IPI00470483.6284403WDR625175445.77IPI00216230.37112TMPO5232317.89IPI00216592,23183臓NPC53166063.5IPI00292753.726130GAPVD154201897.2IPI00036742.625962KIAA14295552187.46IPI00013068.13646EIF3E56100214.1IPI00220038.151593ARS257105277.8IPI00016910.18663EIF3C5846409.04IPI00011274.39987HNRPDL59200621.4IPI00028493.37249TSC260468786.9IPI00296337.25591PRKDC6113733.7IPI00012750.36230RPS256217953.49IPI00179330.66233RPS27A63109989.7IPI00291579.79493KIF236438822.09IPI00215965.23178HN證A16551362.63IPI00022793.43032HADHB6691780.62IPI00019380.14686NCBP167124266.8IPI00034049.15976UPF16816435.04IPI00221092.86217RPS166938410.28IPI00028888.13184腿PD7028064.83IPI00216318.57529YWHAB7127540.91IPI00328840.910189TH0C47220200.16IPI00019385.36748SSR47335954.72IPI00385562.19444QKI7471427.09IPI00168235.423020ASCC3L175217323.9IPI00169307.557584ARHGAP217665977.93IPI00220327.33848KRT17794405.53IPI00550212.423191CYFIP178109616.9IPI00012837.13799KIF5B7954371.77IPI00220808.15208PFKFB28053330.61IPI00216683.5995CDC25C8162091.76IPI00019359.33857KRT98276101.76IPI00010740.16421SFPQ83140324IPI00180154.36311ATXN284250599.3IPI00004472.165125WNK18561456.55IPI00013830.122938SNW18654197.35IPI00304596.34841NONO87108600.8IPI00104050.39967THRAP38865074.8IPI00045921.183858ATAD3B8910052.02IPI00026087.18815BANF19072190.92IPI00043678.385440D0CK79131304.59IPI00013485.36187RPS29263142.86IPI00000001.26780STAU19335071.97IPI00062206.110212DDX39固畫dvas3IdsN6ISC2§13UV3VIdsIoxg09d.lv9yx9寸xaa9VdSH6SSS￡^8990000Idl26,寸s寸ssKI卜9SSt.8zn9000Idl81,911331寸661￡"9S6I0S00Idl91.69098ISII寸8SSK9寸u0000IdlS6.9Z9090￡1卜S98S寸，0寸66SZOOIdlI,I8￡6S￡8SIS66IK09S0S000IdlZ0,6Z寸6S921SI6寸9r9寸SI2200Idl6.9S809寸ZI060691K19ISI00IdlI寸，IS06SSZI0Z9寸ZT06UI00Idl8S.寸9寸ZZ12IS8K108IS000Idl90,9900寸OSI9S08e:.9ZIUI00IdlZ『I寸9S611卜畫rs86薩0Idl9.90自1811sss.os卜SISOIdl寸s.g091911S609Ss.uzoi寸OOIdl卜『9寸szSII68S61.02I寸I000IdlZ0.06UI寸II1998r2I06g00Idl97等991SII6Z寸9KSS寸900IdlWASZSIII9，9Z800000ICJIS7800S6019￡6TK8寸0s000Idl8,gns80180￡29,99868200IdlI寸"1969901ITSS9SOIdl寸z.9980z901Z2S2Z『9u00I00Idl96.KII89寸OIIg99寸sr69s。0000Idl86,9卜6I寸sn6SrlI9ZOOOOIdl9979Z￡S2018TS0g00Idl卜S,S99SS101ISI92ds90000IdlKrzz寸卜寸001寸996￡,99890000Idl9Z,寸sz寸s969rs96200Idl寸，I6SSI寸6M9I/II城浮每0,6gcz-SOOI800s13887588.09IPI00329495.33983ABL皿13952018.33IPI00550821.279869FLJ1252914073070.13IPI00479786.38570KHSRP14191321.57IPI00002591.35298PI4KB142237944.9IPI00411452.3139818DOCK11143206674.9IPI00023461.24301MLLT414450944.43IPI00216049.13190腿PK145244350.9IPI00420014.223020ASCC3L114664032.33IPI00014068.110298PAK414773198.13IPI00215637.51654■3X14840425.87IPI00786982.1192111PGAM5149113599.7IPI00444452.34343MOVIO15019876.74IPI00001757.19939RBM8A15151415.1IPI00604786.2678ZFP36L215289291.19IPI00328306.89877ZC3H11A15359474.79IPI00009865.23858KRT1015469104.8IPI00017617.11655DDX515533949.52IPI00009425.151256TBC1D715683626.48IPI00009960.610989■T15739047.02IPI00164906.322907DHX30158145723IPI00026089.323451SF3B115944357.16IPI00017339.110262SF犯4160101495.6IPI00218342.104522MTHFD116194589.98IPI00551011.426999CYFIP216260424.38IPI00290770.37203CCT316359837.79IPI00069750.222827PUF6016462563.36IPI00303383.623373CRTC116516262.54IPI00026271.56208RPS1416631342.61IPI00014230.1708師P16764092.43IPI00027834.33191臓NPL168242827.1IPI00301263.2790CAD169158825.1IPI00329745.410128LRPPRC17032723.13IPI00398958.3387867LOC387867171100165IPI00221106.510992SF犯217288830.75IPI00017451.110291SF3A117337865.02IPI00641950.310399GNB2L117470854.35IPI00003865.13312HSPA817547034.76IPI00789008.12319FL0T2176299434.6IPI00782992.323524SRRM217769559.59IPI00018140.310492SYNCRIP17874256.91IPI00007084.210165SLC25A1317967882.56IPI00020578.2369ARAF180266765.7IPI00166010.623019CN0T118180222.1IPI00023785.610521DDX1718272959.52IPI00022107.357622LRFN118323656.44IPI00014938.384324CIP29184215907.6IPI00171134.555704CCDC88A185118996IPI00010088.19759HDAC418658812.32IPI00029764.110946SF3A318728385.2IPI00183920.2652595L0C65259518840516.86IPI00031836.34733DRG1189133119.3IPI00025057.1103ADAR19028050.71IPI00006980.151637C14orfl66191133684.7IPI00020729.18471IRS419265982.88IPI00141318.210970CKAP419353321.66IPI00174930.4653464SRGAP2P119469826.21IPI00465430.52547XRCC619570331.45IPI00301277.13305HSPA1L19645879.34IPI00016613.21457CSNK2A1197101052IPI00008240.24141膽S19858412.45IPI00150269.19128PRPF419961174.54IPI00472102.33329HSPD120035932.36IPI00160395.39454,ER3201104738.7IPI00001364.294104C21orf6620217249.04IPI00029744.16742SSBP1203117331.6IPI00039626.323196FAM120A20443035,2IPI00005198.23608ILF220561602.31IPI00377261.18939FUBP3206141643.2IPI00045423.156288PARD320718508.43IPI00514381.1534ATP6V1G220812341.42IPI00009922.381892C14orfl5620925526.43IPI00012340.18683SFRS921032122.71IPI00027569.1343069,PCL1211101160.2IPI00023555.1260310SBPL321246841.23IPI00009328.49775EIF4A321353322.68IPI00221354.12521FUS214106796.6IPI00167804.71148800SBPL621582379.86IPI00293655.31653DDX121673830.8IPI00375907.7200186CRTC221710796.64IPI00029266.16635SNRPE21831836.25IPI00164944.155103RALGPS221928473.77IPI00063245.18939FUBP322070009.18IPI00304925.53303HSPA1A221123434.1IPI00185919.323367LARP1222146380.7IPI00742905.11660DHX922327746.77IPI00018146.110971Y,22485530.05IPI00014344.11859DYRK1A22576074.75IPI00002349.257532NUFIP21522610356.48IPI00219291.49551ATP5J222738413.99IPI00294536.111171STRAP22852132.14IPI00012442.110146G3BP122954382,39IPI00030320.41656DDX6230206313.1IPI00021954.18729GBF123130190.56IPI00179138.323450SF3B323244962.38IPI00025815.223435TARDBP233110354.2IPI00292953.626064RAI1423462055.67IPI00019463.35610EIF2AK223577653.88IPI00290158.62011MARK223627727.81IPI00215884.46426SFRS123777024.49IPI00016250.69513FXR223884383.71IPI00303797.3673BRAF23996758.57IPI00015924.124144TFIP112408212.73IPI00215790.66169RPL3824129207.21IPI00030179.36129RPL724234756.34IPI00026689.4983CDC224328284.91IPI00220642.77532Y腿G24413273.37IPI00302850.46632S服PD1245119838.3IPI00026970.411198SUPT16H24670899.22IPI00012074.310236HNRNPR24788924.16IPI00479217.13192臓NPU24821621.07IPI00215719.66141RPL1824913518.22IPI00017963.16633SNRPD225065825.37IPI00021304.13849KRT225163417.24IPI00008557.510642IGF2BP125220239.65IPI00376798.36135RPL1125372733.09IPI00025874.26184■125462340.01IPI00009867.33852KRT525517684.13IPI00021266.1647099hCG—16001256180095.6IPI00220514.14763NF125718553.06IPI00247583.5729402LOC72940225847667.51IPI00003918.66124RPL425963932.53IPI00006181.18664EIF3D26017767.9IPI00306332.46152RPL24261241258.3IP腿83572.485440DOCK726282947.01IPI00031522.23030HADHA26345642.86IPI00003881.53185臓PF26438364.39IPI00021728.38894EIF2S226538197.41IPI00012066.25094PCBP226655174.95IPI00550689.351493C22orf2826746124.6IPI00025491.11973EIF4A126857185.75IP腿79964.55725PTBP1269295818.6IPI00083708.223215BAT2D127070738.26IPI00012726.48761PABPC4271165433.8IPI00300621.18871SYNJ227238901.1IPI00006754.110238WDR6827349198.42IPI00013881.63187臓PH1274137316.1IPI00218136.357530CGN27592193.73IPI00465294.2988CDC5L27634251.79IPI00008530.16175RPLP0277273424.6IPI00007928.410594PRPF827853619.17IPI00418471.67431VIM27913500.53IPI00018278.394239H2AFV28072706.76IPI00030910.14076CAPRIN128120829.8IPI00022276.328957MRPS2828228663IPI00021840.16194RPS628370626.04IPI00008524.126986PABPC128439121.96IPI00654777.28665EIF3F285100389.1IP蘭77437.551340C腿L1286510073.5IPI00289776.323077MYCBP228744933.99IPI00176706.184991RBM1728822577.56IPI00221088.56203RPS928967518.59IPI00375441.28880FUBP129011360.38IPI00453473.68359HIST1H4A29165922.5IPI00444262.34691NCL29224190.17IPI00216587.96202RPS8293123031.7IPI00395663.523294ANKS1A29426136.23IPI00015833.154927CHCHD329528201.02IPI00216319.37533YWHAH29648197.23IPI00008575.310657KHDRBS1297113303.8IPI00456359.111273ATXN2L表2本發(fā)明以往方法(以TAP為例)起始細(xì)胞量轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞總共5X1061X109得到蛋白復(fù)合物時(shí)間3天2月特異性很高低檢測(cè)到的相互作用蛋白幾百個(gè)一般幾十個(gè)17一種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法SEQUENCELISTING〈110〉復(fù)旦大學(xué)<120>—種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法<130>11<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>966<212〉腿<213>動(dòng)物<柳〉1atgaaggataacaccgtgcc3ctgaaattgattgccctgttagcg肪cggtg犯tttcsc60tctggcgagc3gttgggtg3aacgctgggafitgsgccgggcggctattaataaacacatt120cagacactgcgtgactggggcgttgatgtctttaccgttccgggtaaaggatacagcctg180cctgagcctatccagttacttaBtgct肌scagatattgggtcagctggatggcggtagt240gtagccgtgctgccagtgattgactccacgaatcagtaccttcttgatcgtatcgg卿g300cttaaatcgggcgatgcttgcattgcBg幼taccagcaggctggccgtggtcgccggggt360cggaaatggttttcgccttttggcgc犯acttatatttgtcgatgUctggcgtctggaa420caaggcccggcggcggcgattggttt幼gtctggttatcggtatcgtgatggcggaagta480ttacgcaagctgggtgcagataaagttcgtgtt幼atggcctaatgacctctatctgcag540gatcgc肌gctggcsggcattctggtggagctgactggcaaaactggcgatgcggcgcaa600atagtcattggagccgggatc幼catggcaatgcgccgtgttgaeig卿gtgtcgtt肪t660caggggtggatcacgctgcagg卿cggggatcaatctcgatcgtaatacgttggcggcc720atgct幼taicgtgaatteicgtgctgcgttggaactcttcgaac朋gaaggattggcacct780tatctgtcgcgctgggaaaagctggataatttteittaatcgcccagtgaaacttatcatt840ggtgat犯agaaatatttggcatttcacgcgg幼tagacaaacagggggctttattactt900gagcaggatggaat&ataaaaccctggatgggcggtgaaatatccctgcgtagtgcagaa卿96權(quán)利要求1、一種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法，其特征是采用用量為107數(shù)量級(jí)的起始細(xì)胞，檢測(cè)原代細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用，包括下述步驟1)構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體建立含有表達(dá)可生物素化的15個(gè)氨基酸的人工小肽段標(biāo)簽的通用質(zhì)粒載體，構(gòu)建含生物素化酶BirA基因的真核質(zhì)粒表達(dá)載體；2)人工小肽段標(biāo)簽的可生物素化通過(guò)在細(xì)胞中共瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)生物素化酶BirA基因?qū)崿F(xiàn)與靶蛋白融合的肽段標(biāo)簽的生物素化；3)建立一步親和純化方法被生物素化的靶蛋白通過(guò)鏈霉親合素磁珠富集純化；4)整合氨基酸代謝標(biāo)記技術(shù)與一步親和純化方法將細(xì)胞穩(wěn)定同位素標(biāo)記與可生物素化肽段標(biāo)簽一步親和純化技術(shù)整合；5)蛋白質(zhì)酶解、質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和蛋白鑒定。2、按權(quán)利要求1所述的高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步驟1)的15個(gè)氨基酸其序列為TCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA。3、按權(quán)利要求1所述的高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步驟1)的通用質(zhì)粒載體基于pcDNA3.1DirectionalTOPO載體，所述載體有兩個(gè)亞型，分別用于將肽段標(biāo)簽連于靶蛋白的N端和C端，分別命名為pAP-N和pAP-C。4、按權(quán)利要求1所述的高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步驟1)的BirA基因具有序列1的序列。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種高效檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法。本發(fā)明利用高效瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)，改進(jìn)生物素-鏈霉親合素一步親和純化技術(shù)，應(yīng)用只15個(gè)氨基酸的標(biāo)簽，整合同位素標(biāo)記技術(shù)，建立了蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法。本方法采用用量為10⁷數(shù)量級(jí)的起始細(xì)胞，應(yīng)用于原代細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)，特異性和效率明顯高于現(xiàn)有技術(shù)，能鑒定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬時(shí)相互作用，同時(shí)檢測(cè)耗時(shí)和費(fèi)用也大為減少。本發(fā)明有助于理解細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，對(duì)開(kāi)發(fā)相關(guān)的對(duì)疾病有針對(duì)性治療的藥物及治療方法具有重要參考價(jià)值。文檔編號(hào)G01N33/15GK101581727SQ200810037359公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2008年5月13日優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日發(fā)明者賀宇飛,先陳申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)