專利名稱：柯薩奇病毒b免疫球蛋白抗體m酶免試劑盒及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術產(chǎn)品，具體涉及一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM試劑盒及制備方法。
柯薩奇病毒B1-6對易感人群具有高度的傳染性，兒童是最敏感的人群，病毒流行期兒童的感染率通常為10-20％家庭中所有敏感成員通常都被感染，因此，柯薩奇病毒B感染所致的相關疾病發(fā)病率較高，尤其柯薩奇病毒性心肌炎對兒童具有很大威脅和危害。臨床的早期診斷和治療有很重要意義。以往柯薩奇病毒B感染和致病的病原學確診法是病毒分離，但這種方法的標本采集和處理較復雜，病毒分離程序煩瑣，實驗時間很長，因此病毒分離技術的早期診斷優(yōu)勢不大。而血清中特異性IgM抗體是病毒復制和早期感染的主要標志。
本發(fā)明的目的在于克服以往方法的不足之處，研制一種靈敏度和特異性高的診斷試劑盒。
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM ELISA試劑盒，該試劑盒用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，兔抗人IgM聯(lián)接辣根過氧化物酶為檢測抗體，檢測血清中的COXB病毒B1-6混合型抗體IgM，并且試劑盒由下列組成預包被反應條 48孔酶標記液1瓶(3ml)樣品稀釋液1瓶(6ml)陽性對照1支(200μl)陰性對照 1支(200μl) 20倍濃洗滌液1瓶(13ml)底物緩沖液甲 1瓶(3ml)底物緩沖液乙1瓶(3ml)終止液1瓶(3ml)本發(fā)明的另一目的是提供了上述柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM和IgG ELISA試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟一、原材料及其規(guī)格(一)IgM試劑盒制備COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000酶標板華東理工大學ELISA測定CV(％)＜10％陽性對照診斷心肌炎患者血清，用本試劑盒測定A值＞0.8，放置-20℃?zhèn)溆谩?br> 陰性對照選正常人血清，用本試劑盒測定A值＜0.09，放置-20℃?zhèn)溆谩?br> 酶標抗體兔抗人IgM-HRP辣根過氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma進口酶標記兔抗人IgM，雙擴散1∶64。
小牛血清 杭州四季清廠生產(chǎn)。
其他試劑Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清廠生產(chǎn)Na2HPO4.12H2O A.RNaH2PO4.2H2OA.RNaCLA.RTweel-20化學純甘油化學純H2O2A.R檸檬酸.H2OA.RTMB熔點168℃EDTA A.RH2SO4A.RTris A.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規(guī)定細胞及動物要求(1)Hela細胞(ATCC CCL-2)(2)新西蘭大白兔2公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制備(1)COX B病毒1-6型毒種來源昆明生物所(2)Hela細胞來源中科院細胞所(3)細胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎培養(yǎng)劑中含牛血清10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細胞。
③細胞傳代將成片的細胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進行細胞消化，觀察細胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天。
(4)病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次。
②細胞感染病毒后，在37℃吸附1小時。
③補充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)。
④逐日觀察細胞至所有細胞產(chǎn)生細胞病變后，用無菌方法收獲病毒。
⑤微量平底板進行病毒濃度的滴定和病毒鑒定。
病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每個稀釋度加4孔，然后加入細胞50ul，設細胞對照，按Reed-Muench方法計算病毒的TCID50；病毒的鑒定應用免疫電鏡法；應用中和試驗方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25ul/孔，每個稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時。然后每孔內加Hela細胞50ul，同時設病毒陰性、陽性對照，逐日觀察細胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE；(5)抗原的制備、濃縮和純化①病毒滅活，②去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細胞碎片，③初步濃縮、提純用PEG方法進行提純，④病毒的進一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計進行蛋白含量的測定；三、兔抗人IgM(u)制備(1)人IgM(u)鏈的制備(2)50ml正常人血清，50％及33％飽和硫酸銨各鹽析1次，PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％。
(3)過Sephadex G200柱，PH8.0 0.2Nacl-0.1MTris緩沖液洗脫，分管收集，第一峰為19S IgM。
(4)雙擴散法鑒定IgM純度。
(5)10nM疏基乙醇4℃3h解離輕鏈，對PB透析24h。
(6)再過Sephadex G200柱，洗脫液同上，收集第一峰Ig(u)鏈。
(7)雙擴散鑒定u鏈特異性。
(8)光密度法測定Ig(u)濃度。
(9)1mg/ml u鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化。
(10)每只兔背部多點注射1mg u鏈抗原，2周-1個月1次，共5-8次，雙擴散效價達1∶64以上時采集血清。
(11)辛酸法純化抗血清IgG部分蛋白定量。四、酶標記抗體制備兔抗人IgM用過典酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)對PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價＞1∶1000(方陣滴定法測定)五、酶標記兔抗人IgM濃度測定采用方陣滴定法選擇酶標記抗體工作濃度為1∶1000六、預包被抗原板的制備(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入適量COXB病毒1-6混合型抗原，調整PH至9.5加入板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過夜后甩干。
(2)洗滌Tris2.42g重蒸水 1000ml加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復3次，以除去剩余抗原。
(3)封閉蔗糖 100g羊血清25ml0.1MPBS 1000ml加入板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃。
(4)陽性對照制備診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時，除菌過濾，用本試劑盒測定A值＞0.8備用，分裝。
(5)陰性對照的制備正常人血清用本試劑盒測定A值0-0.09用萬分之二硫柳汞防腐備用分裝。
(6)酶標記抗體配制30％小牛血清兔抗人IgM-HRP 50％0.15MPBS(稀釋度1∶1000) 20％甘油————→稀釋20倍分裝(7)酶標記抗體稀釋液小牛血清30ml0.15MPBS50ml甘油20ml20％Tween-202.5ml
調PH至7.2(8)底物液甲Na2HPO4.12H2O1.7g檸檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ul調PH至5.0(9)底物液乙EDTA 17.5mg檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)終止液濃H2SO410ml蒸餾水 80ml(11)20X洗滌液Tris 4.84g重蒸水 100ml七、半成品的檢定(1)已包被板的檢定測定陽性血清CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定①陰性對照和陽性對照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定試劑盒內設定陰性對照及陽性對照均+4℃-+8℃放置9個月，再用該試劑盒測定吸光度在正常范圍內。
②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定裝配前一星期將兔抗人IgM-HRP(1+100)(同一批兔抗人IgM-HRP檢測一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測定一次，并用兔抗人IgM-HRP置-20℃作對照，測得質控血清7天基本不變，則可以使用。
③特異性檢定用65份內控參比血清來檢測半成品，陰性參比血清允許出現(xiàn)陽性1份，陽性參比血清允許出現(xiàn)陰性1份。
陰性內控血清組成T1-3HAV抗體陽性血清，T4-6HCV抗體陽性血清T7-9HEV抗體陽性血清，T10-14HBV表面抗體陽性血清，T15-24CVB-IgM陰性血清，T25-27類風濕因子陽性血清，T28-30TB陽性血清，T31-33EBV陽性血清，T34-36CMV陽性血清，T37-39HVS陽性血清，T40-42Hpol陽性血清，T43-45TOXO陽性血清，45份特異性血清應允許1份為陽性。
陽性內控血清組成Y1-20 CVB-IgM陽性血清，20份陽性血清，應允許1份為陰性，其余19份應檢測為陽性。
(4)靈敏度血清①組成L1#按以下稀釋度稀釋1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀釋1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀釋1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標準L1#靈敏度應檢測到1∶64L2#靈敏度應檢測到1∶128L3#靈敏度應檢測到1∶32(5)精密性血清將同一樣品平行加樣10孔，其檢測值的變異系數(shù)小于15％(CV％＜15)。
(6)酶標抗體稀釋液，底物液經(jīng)過37℃細菌培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)無菌生長。八、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過濾器除菌過濾后超凈分裝。
(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，說明書，內標簽紙9張，外標貼紙1張，批號lot/EXP，48T/96T。九、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標簽，批號，規(guī)格(48T/96T)有無遺漏。
②藥盒內試劑瓶完整無滲漏，試劑瓶數(shù)和說明書無欠缺，標簽完整，有效期應清楚明晰。
③藥盒試劑(酶標抗體稀釋液，底物液甲，底物液乙，洗滌液)核對PH值及溶液是否澄清。
(2)穩(wěn)定性檢定完全同半成品檢定(3)特異性檢定完全同半成品檢定。
(4)靈敏度完全同半成品檢定。
(5)精密性完全同半成品檢定。
(6)抽樣合格后，留下5個試劑盒剩余入庫。
3個試劑盒4℃ 2個 隔一個月測定1次37℃1個 第一次隔三天測定1次，以后每星期測定1次，記錄數(shù)據(jù)，繪制圖表。
2個試劑盒留庫備查十、保存與有效期保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為8個月。
ELISA法檢測人血清中CVB1-6 IgM和CVB1-6 IgG試劑盒使用報告(上海中醫(yī)科大學附屬曙光醫(yī)院提供)一、材料1、“柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM(CVB1-6 IgM)檢測試劑盒”、“柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG(CVB1-6 IgG)檢測試劑盒”均由上海新新醫(yī)學生物工程公司提供。2、檢測樣品來自小兒、心內科及呼吸科等門診及住院病人血樣。二、方法根據(jù)試劑盒規(guī)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定病人血清中的CXB1-6IgM和CVB1-6IgG，試驗具體詳見試劑盒操作說明書。三、結果我們對1998年11月到2000年6月就診病人隨機抽樣443例臨床似診心肌炎、上呼吸道感染、心肌病、下呼吸道感、冠心病等類型進行實驗結果的分析調查，報告見表。
四、討論目前柯薩奇病毒B組已發(fā)現(xiàn)6型(CVB1-6)，它可引起各種疾病，該病毒感染人體后，可引起各種癥狀，從輕度的心臟癥狀或上呼吸道感染到重度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如心肌炎、心包炎、擴張性心肌病、肺炎、腦炎、腎炎、肝炎、糖尿病等。臨床上絕大多數(shù)病毒性心肌炎是由柯薩奇病毒和?？刹《?兩者都屬腸道病毒)感染引起。而柯薩奇B組病毒為人體患病毒性心肌炎的首位病原體。機體為了抵御柯薩奇B組病毒的感染，早期或在急性期會產(chǎn)生特異性CVB1-6IGM抗體。從實驗檢測結果的表中可看出臨床似診心肌炎146例中CVB1-6IgM陽性的有65例(65/146)占總數(shù)44.5％CVB！-6IgG陽性的有82例(82/146)占總數(shù)56.2％，除心肌炎外的其他病種297例中CVB IgM陽性56例(56/297)占總數(shù)18.9％，CVB1-6IgG陽性48例(48/297)占總數(shù)16.3％?？傊?，臨床確診心肌炎的病例出現(xiàn)CVB1-6IGM、IgG陽性率遠大于其他病種，所以我們通過以上實驗結果分析，體會到由上海新新醫(yī)學生物工程公司研制《柯薩奇病毒B1-6混合型IgM檢測試劑盒》、《柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG檢測試劑盒》能為臨床診斷病毒性心肌炎提供比較可靠的實驗室依據(jù)。
柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM檢測試劑盒，柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG檢測試劑盒臨床考核總結報告(由上海新新醫(yī)學生物工程公司提供)本公司研究和生產(chǎn)的“柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM及IgG試劑盒”于1998年3月至2000年6月期間委托第二軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院，上海第二醫(yī)科大學附屬新華醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院三家醫(yī)療單位作臨床應用和考核，現(xiàn)每家醫(yī)院均出具了詳細的臨床分析使用報告，本公司將此歸納總結如下；三家醫(yī)院共對1787份病例血清作了CVB1-6IgM抗體檢測，其中心肌炎612人，心律失常247人，上感823人，心肌病44人，下感29人，冠心病32人，各病種CVB1-6IgM和IgG抗體陽性率見下表病名 例數(shù) IgM(+) ％IgG(+) ％心肌炎 61229444.833955.4心律失常247 2811.3 4116.6上感82313416.3 9711.8心肌病 44 920.5 1534.1下感 29 517.2 724.1冠心病 32 721.9 928.175份傳染病性心肌炎相對比IgM陽性率分別為4％和69.1％IgG陽性率分別為4％和76.8％，統(tǒng)計處理差異非常顯著，P＜0.01提示CVB感染是病毒性心肌炎的主要原因，CVB1-6IgM和IgG抗體的檢測在病毒性心肌炎的診斷和治療上有重要應用價值。
另一組210例病毒性心肌炎年齡分布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，年齡越小，病毒性心肌炎的發(fā)病率越高，且IgM抗體的陽性率也越高，而IgG抗體的陽性率隨年齡的增長而增高，這提示，CVB感染后，年齡越小，病毒的潛伏期越短，發(fā)病越早。
上呼吸道感染中，CVB IgM和IgG的總體陽性率分別為16.3％和11.8％但將臨床癥狀和血清指標結合分析，發(fā)現(xiàn)單純呼吸道癥狀的上感中，IgM和IgG抗體的陽性率都只有0.92％，而呼吸道癥狀再伴有皮疹。胸痛或肌痛等癥狀時，IgM的陽性率升至27.9-46.75，IgG陽性率為16.3-33.3％，都與單純呼吸道癥狀的陽性率有顯著差異。因皮疹、胸痛、肌痛、咽峽炎等是CVB感染后的較特征性癥狀，故癥狀與抗體陽性率的一致說明本試劑盒的檢測結果較正確。
不同病因引起的心律失常患者中，CVB抗體的陽性率有所差異，主要表現(xiàn)在由急性感染引起的心律失常，其CVB IgM和IgG抗體陽性率明顯高于其它病因的心律失常抗體陽性率，這對進一步研究CVB感染與心律失常的發(fā)病關系有一定指導作用，也使CVB1-6IgM和IgG成為明確感染性心律失常病因的一項輔助檢測指標。
本應用中檢測了44例心肌病患者中的該項指標，IgM和IgG抗體陽性率分別為20.5％和34.1％從一份分類統(tǒng)計數(shù)據(jù)中可以看出，原發(fā)性心肌病的IgM和IgG抗體均高于特異性心肌病，這對進一步研究原發(fā)性心肌病的病因和致病機理提供了信息。
曙光醫(yī)院的應用中還檢測了29例下感(肺炎)和32例冠心病，這二類抗體也都有一定的陽性率，這提示肺炎和冠心病也與CVB感染有關，值得進一步加以關注。
三家醫(yī)藥經(jīng)較長時間和大病例數(shù)的應用后，一致認為我們研制的CVB1-6IgM和IgG檢測試劑盒質量可靠，操作簡便，試劑穩(wěn)定性好，測定結果正確，該試劑盒對病毒性心肌炎的診斷和合理治療有特別的應用價值，對感染性心律失常和上感，心肌病的病因分析也能起到很大的作用，各病種及分類測定值與臨床診斷結果一致，醫(yī)院應用結果滿意。
柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM及IgG試劑盒使用報告(由第二軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院提供)1998年3月至2000年6月期間，本院臨床實驗室對診斷為心肌炎、心律失常和上感的三種疾病共830例，同時作COXB1-6IgM和IgG抗體檢測，旨在對這三種疾病與柯薩奇病毒感染間的關系作一探討，檢測用試劑盒由上海新新醫(yī)學生物工程公司提供，檢測步驟嚴格按試劑盒說明書進行，標本來源為本院小兒、心內和呼吸科門診及住院病人血清。檢測總結果見表一表一三種疾病COXB1-6抗體陽性率病名 病例數(shù) IgM(+) ％IgG(+) ％心肌炎 25612850.014255.5心律失常 247 2811.3 4116.6上感 327 4012.2 27 8.3合計 83019623.621025.3表一中顯示，心肌炎中有大約一半的病例可能系由COX病毒1-6型感染所引起，另按病因分類，心肌炎有的是明確疾病的并發(fā)癥，如白核、結核、肝炎、腮腺炎等各種細胞或病毒感染后的心肌炎，這類心肌炎一般歸納為傳染病性心肌炎。而有的心肌炎。原發(fā)疾病很不明確，臨床擬診為病毒性心肌炎者多數(shù)屬這一類，我們將上述心肌炎按這二類病因分析統(tǒng)計，結果如下表二 心肌炎病因與COXB1-6抗體的關系病因病例數(shù) IgM(+) ％IgG(+) ％傳染病性心肌炎75 3 4.0 3 4.0擬診病毒性心肌炎 18112569.113976.8表二說明，疾病明確的并發(fā)癥性心肌炎，COXB1-6抗體陽性率很低，而在無明確疾病引起的病毒性心肌炎中，COXB1-6抗體的陽性率很高，提示COX病毒感染是病毒性心肌炎的主要原因，COXB！-6IiM和IgG抗體的檢測在病毒性心肌炎的診斷和治療上有重要應用價值。
表一的247例心律失?；颊咧?，COXB1-6IgM和IgG的陽性率分別只有11.3％和16.6％，但我們將心律失常按其病因分類后，可見器質性心臟病，藥物，甲亢等引起的心律失常，其COCB1-6病毒感染與心律失常中，該抗體的陽性率分別高達25％和38.2％(表3)，說明COXB1-6病毒感染與心律失常也有較大關系，也已成為感染性心律失常的檢測指標。
表三心律失常病因COXB1-6抗體的關系病名例數(shù)IgM(+)％IgG(+) ％器質性心臟病 742 2.73 4.1藥物 211 4.82 9.5甲亢 382 5.34 10.5急性感染 761925 297.9其它 384 10.5 3 38.2合計 247 2811.3 4116.6上感一般由流感病毒或合胞病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、?？刹《尽⒐跔畈《镜纫?，故COXB1-6IgM和IgG的抗體陽性率在上感的檢測中一般不會太高，正如表一所示，其抗體陽性率分別只有12.2和8.3％，但我們結合上感的各種癥狀，分別統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)上感中只有一般呼吸道癥狀的，COXB1-6抗體陽性率則十分低，而呼吸道癥狀同時伴有皮疹、胸痛、肌痛等癥時，該抗體的陽性率就明顯增高(表四)，因此，對上感中出現(xiàn)皮疹和肌痛的病例作血清COXB1-6抗體檢測，對明確COX病毒性上感的診斷有很大的作用。因皮診、胸痛、肌痛和咽峽炎等是CVB感染后的較特征性癥狀，故癥狀與抗體陽性率的一致說明本試劑盒的檢測結果較正確。
表四 上感癥狀與COXB1-6抗體的關系癥狀 病例數(shù) IgM(+) ％ IgG(+) ％呼吸道癥狀 218 20.922 0.92呼吸道癥，皮疹 431227.97 16.3呼吸道癥，胸痛，肌痛361233.38 22.2呼吸道癥，皮疹，肌痛301446.7 10 33.3合計 3274012.2 278.3經(jīng)過較長時間和大病例數(shù)的應用，我們認為由上海新新醫(yī)學生物工程公司生產(chǎn)的COXB1-6IgM和IgG試劑盒對明確臨床病毒性心肌炎的診斷和采取正確的治療方案具有重要作用，在感染性心律失常和上感的病因分析方面也有很高的應用價值，試劑穩(wěn)定性好，操作簡便，結果判定可靠。三種疾病的分類測定值與臨床診斷結果一致，并且心肌炎中COXB1-6IgM陽性率低于IgG陽性率，而上感中IgM陽性率高于IgG，這又顯示了疾病的潛伏期長短與IgM，IgG抗體的消長規(guī)律一致，因此，我們認為該試劑盒的檢測結果正確，使用滿意。
柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgM及IgG檢測試劑盒應用報告(由上海第二醫(yī)科大學附屬新華醫(yī)院提供)柯薩基病毒于1948年在美國柯薩基地區(qū)分離不得名，屬小RNA病毒，分A、B兩組，B組病毒簡稱CVB在人類病毒性心肌炎、上呼吸道感染等疾病中占有重要地位。用“柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgM檢測試劑盒”和“柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgG檢測試劑盒”來檢測和監(jiān)視相關病人血清中的柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgM、IgG對臨床防治和研究CVB性心肌炎，上感等有實際意義。
資料和方法一、臨床資料我們對1998年10月至2000年5月間的本院病毒性心肌炎、上呼吸道感染、心肌病共514例的檢測結果進行分析。
二、檢測用試劑盒由上海新新醫(yī)學生物工程公司提供，系間接ELISA方法，具體按試劑盒說明書操作。
結果一、臨床診斷為病毒性心肌炎者共210例，其中CVB1-6IgM陽性101例，陽性率為48.1％，CVB1-6IgG陽性115例，陽性率54.8％，CVB1-6IgM和IgG共同陽性的81例，占38.6％，至少一項指標陽性者共135例，陽性率為64.3％。按年齡分布統(tǒng)計，陽性率見下表年齡病例 IgM(+)％IgG(+) ％＜5 81 44 54.3 3948.15-1565 33 50.8 3553.816-25 38 15 39.5 2360.526以上 26 9 34.6 1869.221010148.1 115 54.8測定統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，年齡越小，IgM抗體陽性率越高，但IgG抗體的陽性率隨年齡增長而增高，這提示，CVB感染患者后，年齡越小，病毒的潛伏期越短，發(fā)病越早。
二、臨床表現(xiàn)為上呼吸道感染者共278例，CVB1-6IgM陽性55例，陽性率19.8％IgG陽性44％，陽性率15.8％，IgM和IgG均陽性的有40例，占14.4％，至少一項指標陽性的共59例，陽性率為21.25。
三、臨床診斷為心肌病者26例，其中原發(fā)性心肌病18例，特異性心肌病8例，明確的原發(fā)病因有糖尿病，甲亢、類風濕等，分類統(tǒng)計IgM和IgG抗體陽性率見下表例數(shù) IgM(+) ％ IgG(+) ％原發(fā)性心肌病 18 3 16.77 38.9特異性心肌病 8 1 12.52 25合計 26 4 15.49 34.6二種心肌病均是IgG抗體陽性率高于IgM，示心肌病的發(fā)病時間均較長。目前對原發(fā)性心肌病因還未研究清楚，一般認為家族性，圍產(chǎn)期、克山病等有關，但本檢測中原發(fā)性心肌病的CVB1-6IgG(+)率達到38.9％，這為該病的病因和致病機理研究提供了信息，本試劑盒為成為該領域研究和診治的有效工具。
試劑盒的使用評價由上海新新醫(yī)學生物工程公司研制并提供的ELISA檢測人血清柯薩基病B1-6混合型抗體IgM，IgG的試劑盒，靈敏、特異、穩(wěn)定性好，操作簡便，二年多來試劑盒未出現(xiàn)明顯質量問題，為我們的科研和臨床檢驗作出了貢獻，由于柯薩基病毒不是特異性的致病因子，因此，本項研究中未能對該試劑盒的靈敏度和特異性作具體考核，但二年來應用的總體感覺，試劑盒較穩(wěn)定，測定結果較符合理論值。目前，病毒性心肌炎發(fā)病率較高，因病毒分離培養(yǎng)技術復雜，需時很長，顯然不能滿足早期診斷需要，而本試劑盒操作簡便、快速、測定結果正確，在柯薩基病毒性心肌炎的診斷方面具有獨特的作用。檢測結果也表明，上感和心肌病的發(fā)病可能也與柯薩基感染有關系，況且，上感與病毒性心肌炎間也有某種聯(lián)系，它們間又均可呈現(xiàn)CVB1-6抗體陽性反應，因此，該試劑盒對進一步研究心肌炎，上感和心肌病等疾病，闡明它們的發(fā)病機理，對這些疾病的早期診斷和治療都具有較高的應用價值。
本申請的柯薩奇病毒B1-6混合型抗體混合型抗體混合型IgMELISA試劑盒。其檢測方法簡便快速，收費低廉，靈敏度和特異性均較高，它是柯薩奇病毒B感染疾病早期診斷和鑒別診斷的可靠病因學指標，臨床應用價值較高，有較明顯的社會和經(jīng)濟效益。
實例1、檢測COXB1-6IgM抗體試劑盒制備一、主要原材料1.Hela細胞 中科院細胞所2.Na2HPO4.12H2O 上海新華化工廠3.Nacl 上海試劑一廠4.Kcl江蘇常熟化工廠5.Cacl2 江蘇常熟化工廠6.葡萄糖 成都化學試劑廠7.EDTA 上海試劑一廠8.水解乳蛋白 上海試劑二廠9.谷氨酸 上海試劑二廠10.谷氨酰胺 上?；瘜W試劑分裝廠11.L賴氨酸 上海生化所12.L精氨酸L組氨酸L蛋氨酸 上海試劑二廠13.小牛血清 杭州四季青生物材料工程公司14.胰蛋白酶 美國Sigma公司15.氯化銫美國Sigma公司16.辣根過氧化物酶美國Sigma公司17.TMB 上海東風試劑廠18.高碘酸鈉 上?；瘜W試劑分裝廠19.硼氨化鉀 上海試劑一廠20.酶標板華東理工大學新分離技術研究室二、COXB1-6包被病毒抗原的制備1、COX B病毒1-6型毒種來源昆明生物所2、Hela細胞來源中科院細胞所3、細胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎培養(yǎng)劑中含牛血清 10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細胞；③細胞傳代將成片的細胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進行細胞消化，觀察細胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天；4、病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②細胞感染病毒后，在37℃吸附1小時；③補充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)；④逐日觀察細胞至所有細胞產(chǎn)生細胞病變后，用無菌方法收獲病毒；⑤微量平底板進行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每個稀釋度加4孔，然后加入細胞50ul，設細胞對照，按Reed-Muench方法計算病毒的TCID50，本法培養(yǎng)病毒效價為TCID50＞10-5；病毒的鑒定a.應用免疫電鏡法；b.應用中和試驗方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25ul/孔，每個稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時。然后每孔內加Hela細胞50ul，同時設病毒陰性、陽性對照，逐日觀察細胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE；三、抗原的制備、濃縮和純化1、病毒滅活；2、去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細胞碎片；3、初步濃縮、提純用PEG方法進行提純；4、病毒的進一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計進行蛋白含量的測定；5、包被聚苯乙烯微孔板測定包被濃度和活性，1mg/ml病毒的包被濃度為1∶1000；四、兔抗人IgM(u)抗體的制備1、人IgM(r)鏈的制備。①30m1人臍帶混合血清，50％及33％硫酸銨飽和度各鹽析1次，PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％；②過sephadex G200柱PH8.0 0.2MNaCl-0.1MTrs緩沖液洗脫，分管收集，第二峰為IgG。③雙擴散法鑒定IgG純度。④10mM巰基乙醇4℃3h解離輕鏈，對PBB透析24h。⑤再過sephadex G200柱，洗脫液同上，收集第一峰IgG(r)鏈。⑥雙擴散鑒定r鏈特異性。⑦光密度法測定Ig(u)濃度。2、抗r鏈特異性抗體的制備。①1mg/ml r鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化。②每只羊背部多點注射3mg r鏈抗原，2周-1個月1次，共5-8次，雙擴效價達1∶64以上時采集血清。③辛酸法純化抗血清IgG部份，蛋白定量。五、兔抗人IgM(u)酶標記物的制備1、稱5mg辣根過氧化物酶加0.5ml蒸餾水，再加0.5ml 60mM過碘酸鈉液氧化15’4℃中；2、加0.16M 乙二醇0.5ml中止氧化，4℃30’；3、加10mg/ml羊抗人IgG(r)0.5ml，裝袋對碳酸鈉緩沖液透析過夜；4、加5mg/ml硼氫化鉀0.2ml，4℃3h再裝透析袋對PH7.2 0.01M PBS透析24h，換液4-5次；5、取出羊抗人IgG(r)-HRP作活性和效價測定，配成1mg/ml濃度時的工作效價為1∶2000；六、陰，陽性對照血清配制。
從病毒攻擊的細胞保護試驗篩選陰性和陽性對照血清，并將陽性血清定值。1、Hela細胞培養(yǎng)如2.3.3；2、用Hank’s液將病毒懸液稀釋為100TCD50/0.1ml，每管中加0.5ml；3、各份人血清用Hank’s液作原倍，1∶2，1∶4，1∶16稀釋，在上述管中每管加0.5ml，充分搖勻混合；4、放37℃水中作用1h；5、取出后接種細胞瓶，每管0.2ml，每稀釋度接種4瓶，每瓶中補充維持液至總量為1ml；6、放37℃溫箱培10天；7、以出現(xiàn)++以上細胞病變的培養(yǎng)瓶計算50％血清中和終點(以能保護50％組織培養(yǎng)細胞不產(chǎn)生病變的血清稀釋度作為終點)；8、收集原倍血清尚出現(xiàn)100％細胞病變的血清繼續(xù)做病毒滴度為100，10，2TCP50/0.1ml的病毒攻擊細胞保護試驗，原倍血清對2TCD50/0.1ml病毒攻擊出現(xiàn)100％細胞病變的血清定為陰性血清，而將1∶8以上稀釋度血清對100TCD50/0.1ml病毒攻擊呈現(xiàn)50％細胞病變的血清定為陽性血清。對2TCD50/0.1ml病毒攻擊出現(xiàn)50％細胞病變的血清抗體效價定為1單位/0.1ml；七、底物液配制甲液1、各稱磷酸氫二鈉18.4克，檸檬酸5克，PM50mg放入容量瓶中，加雙蒸水至1000ml，攪拌溶解后再加30％雙氧水400ul；2、過濾除菌后分裝小瓶；乙液1、稱EDTA150mg加入1000ml雙蒸水中，加熱溶解；2、上液冷卻后加檸檬酸1.05克，再加用二甲亞砜溶解的TMB250mg。3、分裝入黑色小瓶中備用；八、COXB1-6IgM抗體檢測方法的建立。1、病毒抗原的包被用20mmTris-Hcl液稀釋COXB1-6病毒抗原為1∶1000濃度，各反應微孔中加0.1置4℃中24h，棄去上清液，拍干；2、取出已包被條孔，插入支架上，用膠布固定，以防脫落；3、各孔中滴加2滴(100ul)樣品稀釋液，然后分別加待檢血清5ul，同時做陽性對照1孔，陰性對照1孔(各加50ul)，空白對照1孔(孔含樣品稀釋液2滴)；4、置37℃溫箱中反應60分鐘后，甩去孔內液體先在草紙上拍2-3下，然后用洗滌液洗5次，每次條孔加滿洗滌液后停留30秒種，每次甩去洗滌液后都要在草紙上拍干，以便洗滌徹底。(10倍濃洗滌液1ml+9ml蒸餾水即為工作洗滌液)；5、各孔加酶標記液1滴(50ul)，置37℃中反應60分鐘；6、同上徹底洗滌拍干；7、各孔滴加底物緩沖液甲、乙各1滴，置37℃中反應10-15分鐘再每孔滴加終止液1滴，置酶標儀中450nm波長讀數(shù)；8、結果判定陰性對照A值×2.5＝臨界值，凡待檢標本孔A值大于臨界值即為陽性。陰性對照小于0.08按0.08計算；九、靈敏度，特異性和精密度試驗1、靈敏度測定將細胞中和實驗中滴定為效價64u/0.1ml( 640u/ml)，16u/0.1ml(160u/ml)及2u/0.1ml(20u/ml)的3份陽性血清用樣品稀釋液作不同濃度的稀釋后，按實驗操作方法作靈敏度測定，結果如下方法靈敏度測定檢測 抗體效價u/ml血清 640 320 160 80 40 30 20 15 10 52.5陽性血清1 ＞2* ＞2 1.89 1.48 0.96 0.54 0.36 0.24 0.13 0.09 0.10陽性血清2＞2 ＞2 1.74 1.28 0.97 0.65 0.40 0.23 0.14陽性血清30.42 0.27 0.15 0.10 0.09*A450值陰性血清測定值1 2 3 4 5 60.07 0.10 0.11 0.06 0.09 0.13A陰性平均值為0.093，陽性臨界值＝0.093×2.5＝0.233則本檢測方法對3份陽性血清的檢測靈敏度分別為15u/ml，5u/ml和15u/ml，平均為11.7u/ml2、特異性測定將細胞中和實驗中判為陰性的血清20份按實驗操作方法測定，結果如下待檢血清測定值12 3 4 5 6 7 8 9 100.06 0.14 0.09 0.10 0.11 0.10 0.13 0.07 0.06 0.12111213141516171810200.05 0.09 0.12 0.11 0.09 0.07 0.09 0.13 0.12 0.10用6份小牛血清液按實驗操作方法測定的A值分別為0.09 0.12 0.10 0.11 0.05 0.08平均值為0.092 陽性臨界值＝0.092×2.5＝0.23則上面20份細胞中和實驗陰性血清用本ELISA法測定也全部陰性，特異性100％。3、精密度測定取實驗吸光度分別為高中低A值的3份陽性血清做精密度試驗，批內試驗為每份血清同時做10個復孔，批間試驗為每份血清間隔2-3天，實驗1次，共測定6次，結果如下批內試驗12345678910XS CV(％)1 1.38 1.40 1.35 1.36 1.41 1.37 1.40 1.39 1.36 1.41 1.383 0.022 1.62 0.86 0.76 0.76 0.78 0.81 0.83 0.80 0.79 0.84 0.87 0.81 0.039 4.83 0.26 0.28 0.26 0.27 0.27 0.31 0.25 0.30 0.27 0.24 0.271 0.021 7.7平均批內CV＝4.7％批間試驗1.23456XS CV1 1.39 1.50 1.30 1.40 1.42 1.25 1.38 0.089 6.42 0.84 0.72 0.75 0.91 0.83 0.71 0.79 0.079 103 0.25 0.30 0.27 0.24 0.23 0.30 0.265 0.030 11.3平均批間CV＝9.2％十、穩(wěn)定性試驗1、三批試劑盒于2-8℃保存的穩(wěn)定性試驗檢驗報告一第980519批試劑盒 制備日期1998年5月12日有效期 1998年11月19日
檢驗報告二第980603批試劑盒制備日期1998年5月29日有效期1998年12月3日
檢驗報告三第980615批試劑盒制備日期1998年6月8日有效期1998年12月15日
2、三批試劑盒置37℃溫箱中保存的穩(wěn)定性試驗。
第980519批試劑盒
第980603批試劑盒
第980615批試劑盒
權利要求
1.一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM試劑盒，其特征在于該試劑盒用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，兔抗人IgM聯(lián)接辣根過氧化物酶為檢測抗體，檢測血清中的COXB病毒B1-6混合型抗體IgM，并且試劑盒由下列組成預包被反應條 48孔酶標記液 1瓶(3ml)樣品稀釋液1瓶(6ml)陽性對照 1支(200l)陰性對照 1支(200μl) 20倍濃洗滌液1瓶(13ml)底物緩沖液甲 1瓶(3ml)底物緩沖液乙 1瓶(3ml)終止液1瓶(3ml)
2.一種如權利要求1所述的一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟一、原材料及其規(guī)格(一)IgM試劑盒制備COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000酶標板華東理工大學ELISA測定CV(％)＜10％陽性對照診斷心肌炎患者血清，用本試劑盒測定A值＞0.8，放置-20℃?zhèn)溆?；陰性對照選正常人血清，用本試劑盒測定A值＜0.09，放置-20℃?zhèn)溆?；酶標抗體兔抗人IgM-HRP辣根過氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma進口酶標記兔抗人IgM，雙擴散1∶64；小牛血清 杭州四季清廠生產(chǎn)；其他試劑Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清廠生產(chǎn)Na2HPO4.12H2O A.RNaH2PO4.2H2O A.RNaCL A.RTweel-20 化學純甘油 化學純H2O2A.R檸檬酸.H2O A.RTMB 熔點168℃EDTA A.RH2SO4A.RTris A.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規(guī)定細胞及動物要求(1)Hela細胞(ATCC CCL-2)(2)新西蘭大白兔 2公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制備(1)COX B病毒1-6型毒種來源昆明生物所(2)Hela細胞來源中科院細胞所(3)細胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎培養(yǎng)劑中含牛血清10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細胞；③細胞傳代將成片的細胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進行細胞消化，觀察細胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天；(4)病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②細胞感染病毒后，在37℃吸附1小時；③補充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)；④逐日觀察細胞至所有細胞產(chǎn)生細胞病變后，用無菌方法收獲病毒；⑤微量平底板進行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每個稀釋度加4孔，然后加入細胞50ul，設細胞對照，按Reed-Muench方法計算病毒的TCID50；病毒的鑒定應用免疫電鏡法；應用中和試驗方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25ul/孔，每個稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時。然后每孔內加Hela細胞50ul，同時設病毒陰性、陽性對照，逐日觀察細胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE；(5)抗原的制備、濃縮和純化①病毒滅活，②去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細胞碎片，③初步濃縮、提純用PEG方法進行提純，④病毒的進一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計進行蛋白含量的測定；三、兔抗人IgM(u)制備(1)人IgM(u)鏈的制備(2)50ml正常人血清，50％及33％飽和硫酸銨各鹽析1次，PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％；(3)過Sephadex G200柱，PH8.0 0.2Nacl-0.1MTris緩沖液洗脫，分管收集，第一峰為19S IgM；(4)雙擴散法鑒定IgM純度；(5)10mM疏基乙醇4℃3h解離輕鏈，對PB透析24h；(6)再過Sephadex G200柱，洗脫液同上，收集第一峰Ig(u)鏈；(7)雙擴散鑒定u鏈特異性；(8)光密度法測定Ig(u)濃度；(9)1mg/ml u鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化；(10)每只兔背部多點注射1mg u鏈抗原，2周-1個月1次，共5-8次，雙擴散效價達1∶64以上時采集血清；(11)辛酸法純化抗血清IgG部分蛋白定量；四、酶標記抗體制備兔抗人IgM用過典酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)對PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價＞1∶1000(方陣滴定法測定)五、酶標記兔抗人IgM濃度測定采用方陣滴定法選擇酶標記抗體工作濃度為1∶1000六、預包被抗原板的制備(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水500ml加入適量COXB病毒1-6混合型抗原，調整PH至9.5加入板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過夜后甩干。(2)洗滌Tris 2.42g重蒸水1000ml加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復3次，以除去剩余抗原。(3)封閉蔗糖 100g羊血清25ml0.1MPBS 1000ml加入板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃；(4)陽性對照制備診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時，除菌過濾，用本試劑盒測定A值＞0.8備用，分裝；(5)陰性對照的制備正常人血清用本試劑盒測定A值0-0.09用萬分之二硫柳汞防腐備用分裝；(6)酶標記抗體配制30％小牛血清兔抗人IgM-HRP 50％0.15MPBS(稀釋度1∶1000) 20％甘油————→稀釋20倍分裝(7)酶標記抗體稀釋液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml調PH至7.2(8)底物液甲Na2HPO4.12H2O 1.7g檸檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200ul重蒸水100ul調PH至5.0(9)底物液乙EDTA 17.5mg檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)終止液濃H2SO410ml蒸餾水80ml(11)20X洗滌液Tris 4.84g重蒸水 100ml七、半成品的檢定(1)已包被板的檢定測定陽性血清CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定①陰性對照和陽性對照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定試劑盒內設定陰性對照及陽性對照均+4℃-+8℃放置9個月，再用該試劑盒測定吸光度在正常范圍內；②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定裝配前一星期將兔抗人IgM-HRP(1+100)(同一批兔抗人IgM-HRP檢測一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測定一次，并用兔抗人IgM-HRP置-20℃作對照，測得質控血清7天基本不變，則可以使用；③特異性檢定用65份內控參比血清來檢測半成品，陰性參比血清允許出現(xiàn)陽性1份，陽性參比血清允許出現(xiàn)陰性1份；陰性內控血清組成T1-3HAV抗體陽性血清，T4-6HCV抗體陽性血清T7-9HEV抗體陽性血清，T10-14HBV表面抗體陽性血清，T15-24CVB-IgM陰性血清，T25-27類風濕因子陽性血清，T28-30TB陽性血清，T31-33EBV陽性血清，T34-36CMV陽性血清，T37-39HVS陽性血清，T40-42Hpol陽性血清，T43-45TOXO陽性血清，45份特異性血清應允許1份為陽性；陽性內控血清組成Y1-20 CVB-IgM陽性血清，20份陽性血清，應允許1份為陰性，其余19份應檢測為陽性；(4)靈敏度血清①組成L1#按以下稀釋度稀釋1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀釋1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀釋1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標準L1#靈敏度應檢測到1∶64L2#靈敏度應檢測到1∶128L3#靈敏度應檢測到1∶32(5)精密性血清將同一樣品平行加樣10孔，其檢測值的變異系數(shù)小于15％(CV％＜15)；(6)酶標抗體稀釋液，底物液經(jīng)過37℃細菌培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)無菌生長；八、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過濾器除菌過濾后超凈分裝；(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，說明書，內標簽紙9張，外標貼紙1張，批號lot/EXP，48T/96T；九、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標簽，批號，規(guī)格(48T/96T)有無遺漏；②藥盒內試劑瓶完整無滲漏，試劑瓶數(shù)和說明書無欠缺，標簽完整，有效期應清楚明晰；③藥盒試劑(酶標抗體稀釋液，底物液甲，底物液乙，洗滌液)核對PH值及溶液是否澄清；(2)穩(wěn)定性檢定完全同半成品檢定(3)特異性檢定完全同半成品檢定(4)靈敏度完全同半成品檢定(5)精密性完全同半成品檢定(6)抽樣合格后，留下5個試劑盒剩余入庫3個試劑盒4℃ 2個 隔一個月測定1次37℃1個 第一次隔三天測定1次，以后每星期測定1次，記錄數(shù)據(jù)，繪制圖表；2個試劑盒留庫備查十、保存與有效期保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為8個月。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒B1—6混合型抗體IgM ELISA試劑盒。該試劑盒可用于因柯薩奇病毒B感染致病的早期診斷,檢測方法簡便快速、成本低廉、靈敏度和特異性高,有較高的臨床應用價值。本發(fā)明提供了制備方法。
文檔編號G01N33/569GK1341858SQ0012509
公開日2002年3月27日 申請日期2000年9月7日 優(yōu)先權日2000年9月7日
發(fā)明者杜鳳鳴 申請人:杜鳳鳴