專利名稱：整體染色和包埋法相結(jié)合的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明介紹一種用于成象的組織樣品制作方法。按當(dāng)前的做法，制備透射式顯微鏡(包括可見(jiàn)光或電子顯微鏡)用的有機(jī)組織樣品和其它材料，通常按以下方法進(jìn)行，即將樣品經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)處理，最終制作出將樣品包埋在內(nèi)的固體塊狀物。
在此制作過(guò)程中，首先，通過(guò)化學(xué)法，用甲醛水溶液、戊二醛或其他能防止樣品自溶(自我降解)的材料將組織固定，使該樣品具有剛性，并增加其滲透性，由此提高隨后的溶液浸潤(rùn)效果。固定后的浸潤(rùn)步驟被設(shè)計(jì)為用濃度逐漸增加的有機(jī)溶劑，如乙醇和二甲苯，通過(guò)逐漸置換，除去樣品中的全部水份。在使用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡的情況下，浸潤(rùn)過(guò)程的最后一步是用熔融石蠟浸潤(rùn)組織。隨后將樣品的溫度降至室溫，由此使經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)的組織固化。然后將硬化的、經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)的組織放入模具內(nèi)，另用石蠟包埋好，制成組織塊。
除了石蠟以外，塑料也廣泛用于制作組織塊?？捎玫乃芰鲜羌谆┧狨ァh(huán)氧聚合物，或相關(guān)材料，但無(wú)論用任何一種材料，組織樣品都必須經(jīng)過(guò)大致類似于石蠟法所采用的制作過(guò)程。組織中的水用有機(jī)溶劑置換，而有機(jī)溶劑再用液體聚合物置換。該聚合物的前體組分混合物可用各種方法固化(聚合)，包括使其暴露在紫外光下、加熱、或加入化學(xué)催化劑。在光學(xué)和電子顯微鏡的使用中，塑料制作法已為其所采用。
對(duì)于上述的每種方法，隨后是將含有組織的塊在切片機(jī)上切片。使用光學(xué)顯微鏡時(shí)，是將切片收集，并置于玻璃載片上。切片在玻璃載片上固定后，用各種標(biāo)記細(xì)胞特定部位(如核酸、類脂化合物等)的染料將切片染色；或者用另一種方法，即按免疫組織化學(xué)法處理切片。
此外，整體染色的方法也已引入，該方法是先將整個(gè)樣品用浸漬法染色，再進(jìn)行浸潤(rùn)和包埋。然后將制得的塊狀物切成切片供透射式顯微鏡使用，或者是將塊狀物本身的切割面用所謂“塊面顯微學(xué)”的方法使其成象。該后一方法包括在表面成象顯微鏡(美國(guó)專利No.4,960,330，“圖象記錄儀”)中實(shí)施的成象方法，即樣品先用熒光染料整塊染色，隨后用介質(zhì)浸潤(rùn)并包埋在介質(zhì)中，該介質(zhì)通常為塑料聚合物，此聚合物高度不透光或經(jīng)不透光處理，可抑制該組織來(lái)源于塊中超過(guò)幾微米以上深處的圖像。這樣形成了薄的“虛切片”，幾乎與常用的載有組織切片的載物片類似。
發(fā)明概述本發(fā)明特征為描述將樣品整塊染色并包埋的方法，該方法包括以下步驟，(a)將樣品浸入含有染料的染色溶液中，該染料與樣品中的組分可以可逆性結(jié)合，以及(b)將樣品包埋在包埋介質(zhì)中，其中在包埋介質(zhì)中，該染料的溶解度不高于其在染色溶液中溶解度的50％。
優(yōu)選包埋介質(zhì)與浸潤(rùn)物質(zhì)為同一種物質(zhì)，并可包括使其不透明的物質(zhì)。優(yōu)選溶于包埋介質(zhì)的染料溶解度不多于其在染色溶液中的20％，更優(yōu)選溶于包埋介質(zhì)中的染料溶解度不多于其在染色溶液中的10％，甚至2％。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品為生物學(xué)組織樣品，例如通過(guò)人體尸體解剖得到的樣品，或來(lái)源于做活組織檢查病人的樣品。
此處所用的名詞“樣品”是指被染色和包埋的組織或其他材料。樣品在染色之前未經(jīng)組織切片術(shù)切片。樣品的厚度大于200微米，也可大于1毫米、1厘米，或更厚。
此處所用的名詞“固定”是指用化學(xué)溶液處理組織樣品，該化學(xué)溶液使樣品防腐、硬化，并有滲透性。
此外所用的名詞“浸潤(rùn)”是指用液體或一系列液體處理該組織，所用的液體在分子水平上穿透整個(gè)組織，然后使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，使樣品具有剛性。
此處所用的名詞“包埋”是指將經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)的組織裝入模型中，并用某種物質(zhì)(通常與浸潤(rùn)物為同一種物質(zhì))包圍住，然后此物質(zhì)硬化而鑲嵌成塊。這樣該包埋物質(zhì)就起到剛性支撐作用，并且便于切割加工。
此處所用的名詞“切片”是指從塊上切下薄片，此薄片然后可載于載玻片或其他載體上。
此處所用的名詞“染色”是指用有色或熒光物質(zhì)處理組織，該物質(zhì)在分子水平上與組織結(jié)合。
此處作為同義詞所用的名詞“極性的”和“親水的”是指水溶性很好的化學(xué)物質(zhì)，而名詞“非極性的”和“疏水的”是指水溶性很差，但易溶于有機(jī)溶劑和脂肪或類脂化合物的化學(xué)物質(zhì)。
此處所用的名詞“不透明劑”是指加入包埋和浸潤(rùn)介質(zhì)中，產(chǎn)生很高吸光度的物質(zhì)，該吸光度可抑制組織中發(fā)源于塊中深度多于幾微米之處的圖象。不透明劑的例子是Fat Brown RR(Solvent Brown 1；Sigma化學(xué)產(chǎn)品公司，St.Louis，MO)。
采用非極性的浸潤(rùn)和包埋材料，例如極性染料在其中的溶解度很小的環(huán)氧化物和石蠟，并用極性染料對(duì)組織染色，可使該極性染料分配進(jìn)入組織，將親水的組分(例如蛋白)染色，并抑制染料進(jìn)入周圍的介質(zhì)，形成高對(duì)比度的圖象。
另一種做法是采用非極性的、脂溶性的(即疏水性的)染料對(duì)細(xì)胞中的富脂結(jié)構(gòu)(例如細(xì)胞膜)染色。在這種情況下，則采用極性的包埋材料，例如甲基丙烯酸二醇酯(Polysciences有限公司產(chǎn)品，瓦令頓，PA)，以防止非極性染料從組織中擴(kuò)散到包埋介質(zhì)中，從而提高組織圖象的對(duì)比度。
本發(fā)明的重要性主要體現(xiàn)在以下方面在整塊染色之后，使用某些類型的顯微鏡(包括塊面顯微鏡)成象之前，不將浸潤(rùn)介質(zhì)和包埋介質(zhì)除去。因此，采用消除來(lái)源于包埋材料本身的成象信號(hào)的技術(shù)，對(duì)于產(chǎn)生高對(duì)比度的圖象來(lái)說(shuō)是很重要的，亦即樣品與包埋介質(zhì)之間的高對(duì)比度是很必要的。因此，由于選擇相對(duì)疏水的染料與極性的包埋介質(zhì)，例如甲基丙烯酸二醇酯和Carbowax(固體聚乙二醇；UnionCarbide公司產(chǎn)品，Danbury CT)共用，防止染料從組織樣品(即先染色的整個(gè)塊狀物)進(jìn)入周圍的介質(zhì)，保持包埋介質(zhì)中無(wú)染料，從而改進(jìn)染色組織與周圍介質(zhì)之間的對(duì)比度。
從以下的詳細(xì)敘述以及權(quán)利要求中，可明顯看到本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明詳述任何一種染料在某種指定介質(zhì)中的溶解度可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定，由此測(cè)出其在任何一種指定介質(zhì)中的溶解度。對(duì)于很多種染料，其溶解度可用參考書，例如Merk Index確定。溶解度可用溶質(zhì)的克數(shù)/溶劑的體積(g/100ml或g/L)表達(dá)，以百分?jǐn)?shù)(w/v；100g/100ml＝100％)，或用體積摩爾濃度或重量摩爾濃度表示。例如，對(duì)高爾基氏體染色的中性紅(3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽)，在水中的溶解度為4.0％(0.4g/L)，在無(wú)水乙醇中為1.8％，在乙二醇中為3.0％，而幾乎不溶于二甲苯(前述Merck index)。另一種染料，伊紅y的溶解度如下水中44.0％；乙醇中2.0％；溶纖劑中25.0％；乙二醇中27.5％，而在二甲苯中小于0.1％(《電子顯微術(shù)科學(xué)》，華盛頓堡，PA，1999年目錄)。
本發(fā)明方法最重要的原理是染料在包埋溶液中的溶解度小于其在染色溶液中的溶解度。染料在包埋溶液中的溶解度與其在染色溶液中的溶解度之比百分?jǐn)?shù)越低，則對(duì)比度越高。優(yōu)選該百分?jǐn)?shù)小于50％，更優(yōu)選小于20％，最優(yōu)選小于10％，或甚至2％。
表1列出適宜作極性染色溶液的染料，以及適宜于本文所述本發(fā)明的相應(yīng)非極性包埋介質(zhì)。表1還列出了與染色脂類的尼羅紅染料相容的極性包埋介質(zhì)。表1所列的染料和包埋介質(zhì)僅用作說(shuō)明，而不作為限制。應(yīng)明確，其他的染料，例如列于Conn，H.J所著《生物染色》第9版(Williams和Wilkens公司，巴爾的摩1977年出版)的染料，可能與以下表1所列的一種或多種包埋介質(zhì)相容。類似地，其他包埋介質(zhì)可能與例如表1或前述Conn著作中提供的染料相容。
表1
實(shí)施例實(shí)施例1一種制作組織樣品的方法，其中樣品中的蛋白用整塊染色法染色，該方法中包含下面所述組分，其中的染料極易溶于水，而包埋介質(zhì)是疏水性的染料2％伊紅Y熒光染色劑(Sigma化學(xué)產(chǎn)品公司，St.Louis，MO)的水溶液。包埋/浸潤(rùn)介質(zhì)石蠟為基礎(chǔ)的包埋介質(zhì)(Surgipath醫(yī)藥工業(yè)公司產(chǎn)品，Richmond IL)。不透明劑飽和的Fat Brown RR(Solvent Brown 1；Sigma化學(xué)產(chǎn)品公司產(chǎn)品，St.Louis，MO)。
不透明介質(zhì)的制備方法如下將過(guò)量的不透明劑在中等速度攪拌下溶于熔融的石蠟中，混合物在連續(xù)加熱的條件下放置1小時(shí)，然后潷析。組織樣品浸入伊紅Y溶液中染色，隨后用乙醇和二甲苯處理，然后用不透明介質(zhì)浸潤(rùn)并使其包埋入該不透明介質(zhì)中。將該組織塊在塊面顯微鏡上成象。
實(shí)施例2一種組織樣品的制作方法，其中樣品中的核酸為被染色的部位，其中的染料極易溶于水，而包埋介質(zhì)是疏水性的，該方法中使用以下組分染料1％碘化丙錠染色劑(Sigma化學(xué)產(chǎn)品公司產(chǎn)品，St.Louis，MO)水溶液。包埋/介質(zhì)Epon環(huán)氧類樹(shù)脂介質(zhì)(Polysciences，有限公司，瓦令頓，PA)。
Epon環(huán)氧類樹(shù)脂按照制造商的使用說(shuō)明來(lái)配制。將組織樣品浸入碘化丙錠溶液中染色，隨后用分級(jí)乙醇和二甲苯處理，然后用環(huán)氧化物介質(zhì)浸潤(rùn)并將其包埋入該環(huán)氧化物介質(zhì)中。組織塊在表面成象顯微鏡上成象。
實(shí)施例3一種組織樣品的制備方法，其中樣品中的中性類脂化合物為被染色的部位，該方法中使用下面所述組分，其中的染料水溶性低，而包埋介質(zhì)水溶性高染料1％尼羅紅染色劑(分子探針公司產(chǎn)品，Eugene，OR)溶于2-甲氧基乙醇的溶液。包埋/浸潤(rùn)介質(zhì)全濃度甲基丙烯酸二醇酯的催化聚合浸潤(rùn)樹(shù)脂(JB-4，Polysciences，有限公司產(chǎn)品，瓦令頓，PA)。
將組織樣品放入每個(gè)為10ml并裝有染色溶液的管瓶中，旋轉(zhuǎn)混合24小時(shí)。經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)和染色的樣品然后轉(zhuǎn)移至另加入包埋介質(zhì)的2ml包埋被膜內(nèi)，旋轉(zhuǎn)混合24小時(shí)，5000rpm下離心10分鐘，以便于樣品沉降，然后使其在室溫下聚合(約1小時(shí))。制成的組織塊在表面成象顯微鏡上成象。
參考文獻(xiàn)“組織工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)方法”武裝部隊(duì)病理學(xué)研究所編著，Prophet，E.B.，Mills B.，Arrington J.B.，Sobin L.H.編輯，美國(guó)病理學(xué)注冊(cè)處，華盛頓，D.C.，1992。
Carson，F(xiàn).L.“組織工藝學(xué)”自學(xué)教科書，ASCP出版社，美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)，芝加哥，1990。
Sheehan，D.C.，Hrapchak，B.B.“組織工藝學(xué)理論與實(shí)踐”，第二版，Battelle出版社，哥倫布，OH，1980。
美國(guó)專利4,960,330“圖象記錄儀”本文提到的所有專利及出版物都引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種將樣品整塊染色，并包埋該樣品的方法，該方法包括a)將樣品浸入含有染料的染色溶液中，該染料與該樣品中的某種組分以可逆方式結(jié)合；以及b)將該樣品包埋在包埋介質(zhì)中，其中所說(shuō)染料在包埋介質(zhì)中的溶解度不高于其在染色溶液中溶解度的50％。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述包埋物質(zhì)亦為浸潤(rùn)物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述包埋介質(zhì)包含不透明劑。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)染料在包埋介質(zhì)中的溶解度不高于其在染色溶液中溶解度的20％。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)染料在包埋介質(zhì)中的溶解度不高于其在染色溶液中溶解度的10％。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)染料在包埋介質(zhì)中的溶解度不高于其在染色溶液中溶解度的2％。
7.權(quán)利要求1的方法，其中的樣品包括生物學(xué)組織。
全文摘要
本發(fā)明特征在于描述一種將樣品整塊染色,并進(jìn)行包埋的方法,該方法包括以下步驟,(a)將樣品浸入含有染料的染色溶液中,該染料與樣品中的組分以可逆方式結(jié)合,以及(b)將樣品包埋在包埋介質(zhì)中,其中在包埋介質(zhì)中染料溶解度不高于其在染色溶液中溶液度的50%。
文檔編號(hào)G01N1/36GK1340156SQ00803847
公開(kāi)日2002年3月13日 申請(qǐng)日期2000年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月19日
發(fā)明者R·L·凱施曼 申請(qǐng)人:分析科學(xué)公司