專利名稱：用于測(cè)定全血中的凝固因子活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明得到了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的資助，合同號(hào)HL48872。美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
此外，某些臨床狀態(tài)，諸如血管疾病、外科手術(shù)、創(chuàng)傷、惡性腫瘤、血管修復(fù)裝置、全身麻醉、懷孕、服用口服避孕藥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及感染，可能使個(gè)體易于發(fā)生反向的凝塊形成現(xiàn)象。由血液凝塊形成異常而導(dǎo)致的可疑急性狀態(tài)的患者，在急癥室就診。一種采用全血樣品來(lái)快速測(cè)定患者當(dāng)前形成血凝塊危險(xiǎn)性的方法，將有助于確定或排除血栓形成過程和凝血病。這不僅有利于將急診健康治療提供給那些有需要的人，同時(shí)還能夠早期識(shí)別那些有可能發(fā)生潛在的致命性血液凝固病理的患者。
血液也可能形成凝塊過慢或者根本不形成凝塊，這種情況會(huì)導(dǎo)致出血或其他血液凝固障礙。血友病就是遺傳性的出血疾病例子。另外，影響肝臟的疾病，諸如酒精性肝硬變以及急性和慢性肝炎，都與多種凝塊形成異常相關(guān)，這是因?yàn)楦闻K是合成多種凝固因子的器官。
在遺傳性的凝固障礙中，已知最多的是血友病A和B，它們分別與因子VIII和IX的活性下降相關(guān)。這種障礙的嚴(yán)重程度，取決于相應(yīng)的凝塊形成因子的減少程度。嚴(yán)重的病例在生命的早期就已經(jīng)表現(xiàn)出來(lái)，并且患血友病的兒童常常表現(xiàn)出大關(guān)節(jié)諸如膝蓋容易出血以及凝塊形成的顯著缺陷。較輕微的血友病也許直到生命的晚期才明顯表現(xiàn)出來(lái)。
血友病的治療一般包括輸入血液制品的濃縮劑，其中含有大量的凝固因子VIII或IX。雖然許多血友病患者能夠過一種相對(duì)正常的生活，但是在進(jìn)行戶外活動(dòng)以及在外科手術(shù)或牙病治療期間卻必須格外小心。不幸的是，10％的血友病患者人群產(chǎn)生了因子VIII抗體并變得難以治療。
血液過快形成凝塊(即凝固性太高)也是一種病理狀態(tài)。彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)就是獲得性血液凝固障礙的一個(gè)例子，其特征在于血液病理性地快速形成凝塊。
血液形成凝塊是一個(gè)復(fù)雜的過程；它涉及多種起始因子，以及激活劑、酶和調(diào)節(jié)劑的多級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致纖維蛋白的形成，纖維蛋白又聚合為不溶性的凝塊。內(nèi)源性和外源性的血液凝固途徑，在例如Davie等人，血液凝固級(jí)聯(lián)系統(tǒng)起始、維持和調(diào)節(jié)，生物化學(xué)(Biochemistry)，30(43)10363-70(1991)中有描述，此處引用作為參考。
確定血液凝塊形成傾向的經(jīng)典方法，是通過手工或自動(dòng)化地測(cè)定血漿或血液樣品形成不溶性的纖維蛋白絲或者凝塊所需的時(shí)間。例如，凝塊形成的檢測(cè)，可以采用肉眼觀察纖維蛋白絲的形成，或者采用自動(dòng)化的方法諸如檢測(cè)粘度的變化一粘度可通過機(jī)械或電阻抗來(lái)測(cè)定，或者采用光學(xué)檢測(cè)。
對(duì)所抽取的沒有加入抗凝血質(zhì)的新鮮血液，可以立即進(jìn)行凝固時(shí)間的測(cè)定。或者，也可以用含有結(jié)合鈣離子的抗凝血質(zhì)諸如檸檬酸鹽的血液，測(cè)定凝固時(shí)間。在這種情況下，凝固時(shí)間的測(cè)定，是通過加入鈣鹽以逆轉(zhuǎn)抗凝血質(zhì)的效應(yīng)而起始的。后一種測(cè)定方法所得到的時(shí)間被稱為再鈣化時(shí)間。通常所使用的測(cè)定血液凝固時(shí)間的典型方法，包括依賴于凝血酶原時(shí)間(PT)的測(cè)定、活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的測(cè)定、凝血酶時(shí)間的測(cè)定以及纖維蛋白原水平的測(cè)定這樣一些方法。也可以通過測(cè)定循環(huán)血液中可溶性纖維蛋白或纖維蛋白降解產(chǎn)物的水平，對(duì)血栓形成過程進(jìn)行檢測(cè)。
血液凝固時(shí)間的確定，最常用于疾病諸如血友病、馮威勒布蘭特病、B型血友病以及某些肝臟疾病的診斷，在這些疾病中，異常延長(zhǎng)的凝固時(shí)間一般具有診斷價(jià)值。雖然有許多疾病均涉及到異?？焖俚难耗?，但是當(dāng)前的測(cè)定方法，在鑒定所有這些快速形成凝塊病理狀態(tài)時(shí)，除了那些最異常的情況之外，并沒有足夠敏感到具有診斷價(jià)值。
PT和APTT實(shí)驗(yàn)在臨床上在對(duì)病理性凝固性過高狀態(tài)的檢測(cè)中并沒有用途。一般地，這些測(cè)定被用于檢測(cè)具有延長(zhǎng)的凝固時(shí)間的狀態(tài)，也就是凝固性過低狀態(tài)。這些實(shí)驗(yàn)通常采用血漿來(lái)進(jìn)行，但血漿中不含有激活的血小板和單核細(xì)胞，因?yàn)檫@兩種成分均可以顯著地改變血液的凝固狀態(tài)。而且，在這些實(shí)驗(yàn)中，向樣品中加入了本身就是前凝血質(zhì)的試劑，從而將血漿的凝固時(shí)間從大約6分鐘分別減小到PT值為大約10-13秒鐘、APTT值為大約25-39秒鐘。實(shí)驗(yàn)室測(cè)定手冊(cè)(Laboratory Test Handbook)，第4版，Lexi-Comp公司，1996，第227頁(yè)(APTT)和262頁(yè)(PT)。由于將全血中的細(xì)胞組分諸如單核細(xì)胞的影響排除在外，所以這些基于血漿來(lái)測(cè)定凝固時(shí)間的常用方法，并不能對(duì)由血液中的細(xì)胞組分調(diào)節(jié)的血栓形成過程提供最大的預(yù)見和診斷價(jià)值。
而且，如果可以對(duì)全血而不是單獨(dú)的血漿的凝固性進(jìn)行測(cè)定，那么將會(huì)改善對(duì)抗凝療法諸如肝素和華法林的監(jiān)測(cè)。這些治療性施用的抗凝血質(zhì)，通過細(xì)胞以及可溶性(血漿)血液組分，調(diào)節(jié)血液的凝固性。
在全血中存在著若干重要的血液凝塊形成過程的起始物和調(diào)節(jié)劑。一種被稱為組織因子，也稱為因子III的前凝血質(zhì)蛋白質(zhì)就是這樣一種分子，它是一種跨膜糖蛋白，存在于已知為單核細(xì)胞的循環(huán)細(xì)胞的表面上。在血漿中，發(fā)現(xiàn)組織因子也存在于磷脂小體中。已經(jīng)將循環(huán)的組織因子之水平的提高與多種血栓形成障礙和病理狀態(tài)聯(lián)系起來(lái)。例如，在癌癥、感染、血栓形成障礙諸如心臟病發(fā)作和中風(fēng)這樣一些患者的循環(huán)細(xì)胞和血漿小體上已發(fā)現(xiàn)有組織因子。全血中的組織因子活性水平在鑒別診斷有可能患血栓形成危險(xiǎn)的患者時(shí)是一個(gè)具有診斷用途的參數(shù)。
組織因子(TF)必須與血漿凝塊形成因子即因子VII或其激活形式即因子VIIa，形成活性復(fù)合物。接著，該TFVIIa復(fù)合物將因子IX和因子X這兩個(gè)酶原激活為其酶的活性形式，分別為因子IXa和因子Xa。因子Xa與因子Va結(jié)合，生成凝血酶原酶復(fù)合物(有活性的前凝血質(zhì))，該復(fù)合物接著將凝血酶原切割為凝血酶。然后，凝血酶又切割纖維蛋白原，產(chǎn)生出纖維蛋白，纖維蛋白則形成凝塊。
已有描述直接測(cè)定組織因子的方法。除免疫測(cè)定方法諸如在美國(guó)專利5403716中所描述的之外，通過將全血與內(nèi)毒素接觸，正如在美國(guó)專利4814247以及Spillert與Lazaro，1993，J.Nat.Med.Assoc.85611-616中所描述，提供了在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)評(píng)價(jià)TF水平的方法。在使用內(nèi)毒素的方法中，測(cè)定了血液樣品的修改的再鈣化時(shí)間。當(dāng)內(nèi)毒素或其他免疫調(diào)節(jié)劑造成一種模仿疾病或創(chuàng)傷的狀態(tài)時(shí)，這種評(píng)價(jià)代表了所存在的組織因子表達(dá)水平，所以當(dāng)患者經(jīng)歷這種狀態(tài)時(shí)就可以測(cè)定其凝塊形成傾向性。本發(fā)明通過提供一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)確定全血中循環(huán)的組織因子活性的當(dāng)前實(shí)際水平值，而提供了另一種重要的組織因子測(cè)定方法，從而可以測(cè)定患者當(dāng)前的形成血凝塊的危險(xiǎn)性。
例如，我們可以通過使用Sonoclot Coagulation and PlateletFunction Analyzer(一種血液凝固和血小板功能分析儀器)(Sienco，Wheat Ridge，CO)-這種儀器將一次性使用的振動(dòng)探針浸入全血中來(lái)測(cè)定纖維蛋白絲的黏性阻力，測(cè)定纖維蛋白的形成?；蛘撸部梢允褂肏EMOCHROTM系統(tǒng)(Internat ional Technidyne公司)，這種系統(tǒng)使用于試管內(nèi)精確排列的磁塊以及位于儀器內(nèi)的磁性檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)凝塊的形成。
當(dāng)前，并沒有任何測(cè)定組織因子(TF)或組織因子通路抑制劑(TFPI)的功能活性的標(biāo)準(zhǔn)臨床測(cè)定法。然而，在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)，還確實(shí)有測(cè)定某些前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)活性的方法。例如，對(duì)存在于血漿中的因子XII活性的百分比，可以通過將該血漿加入到因子XII嚴(yán)重缺乏的血漿中，用此時(shí)所獲得的校正程度來(lái)加以確定。這種測(cè)定法是APTT實(shí)驗(yàn)的修改版，它測(cè)定了患者的血漿對(duì)含有少于1％因子XII的血漿的APTT“校正”能力。將通過稀釋患者的血漿獲得的校正量，與采用已知濃度的因子XII所獲得的校正量進(jìn)行比較。正常的血漿被認(rèn)為是可以給出100％的校正。
對(duì)存在于血漿中的凝血酶(因子II)活性的百分比，也可以通過將該血漿加入到因子II嚴(yán)重缺乏的血漿中，用此時(shí)所獲得的校正程度來(lái)加以確定。這種測(cè)定法是凝血酶原時(shí)間實(shí)驗(yàn)的修改版，它測(cè)定了患者的血漿對(duì)含有少于1％因子II的血漿的PT“校正”能力。將通過稀釋患者的血漿獲得的校正量，與采用已知濃度的因子II所獲得的校正量進(jìn)行比較。正常的血漿被認(rèn)為是可以給出100％的校正。然而，所討論的當(dāng)前這類血液凝固因子測(cè)定法，僅僅在臨床條件下，檢測(cè)凝固性過低的狀態(tài)(即，血液病理性地形成凝塊慢)時(shí)有用途。
對(duì)于激活血液凝固級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的幾個(gè)標(biāo)志物，諸如F1.2凝血酶原片段、D-二聚體、可溶性的纖維蛋白和凝血酶/抗凝血酶III復(fù)合物，有多種免疫測(cè)定法來(lái)對(duì)它們進(jìn)行測(cè)定。一般地，這些凝固性免疫測(cè)定法除了在作研究時(shí)常用外，對(duì)它們的接受程度還有限，這是因?yàn)檫@些方法涉及到很慢和勞動(dòng)強(qiáng)度相對(duì)高的ELISA法。
因此，希望提供一種快速和簡(jiǎn)單的體外方法以評(píng)價(jià)血液的總凝固性—它與體內(nèi)血液形成凝塊的危險(xiǎn)性以及前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的某一效應(yīng)對(duì)凝固性所起的作用相關(guān)。這將為醫(yī)療健康專業(yè)人員在下面三種情況下提供診斷及臨床方面有用的數(shù)據(jù)(1)評(píng)價(jià)患者的狀態(tài)；(2)選擇恰當(dāng)?shù)闹委煶绦颍?3)監(jiān)控外科手術(shù)或非外科手術(shù)治療的快慢和有效性。以前，并沒有一種可以使用的快速評(píng)價(jià)血液的總凝固性的方法，來(lái)特異評(píng)估組織因子以及其他前凝血質(zhì)和抗凝血質(zhì)所起的作用。如果能夠檢測(cè)出前凝血質(zhì)和抗凝血質(zhì)的水平提高了，那么將可以更早地采取治療措施，從而改善預(yù)后。當(dāng)前，并沒有任何全血凝固性測(cè)定法來(lái)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)這種血液凝固性過高或過低的狀態(tài)。本發(fā)明的方法，通過在存在和不存在前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)活性的至少一種抑制劑的情況下比較患者的全血凝固時(shí)間，測(cè)定凝固性過高或過低的狀態(tài)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是，通過功能性地確定全血中的一種或多種前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的當(dāng)前水平，提供一種方法，用于測(cè)定患者發(fā)生血栓形成現(xiàn)象的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是，通過測(cè)定全血樣品中的凝固活性，提供一種方法，用于測(cè)定抗凝療法諸如使用華法林或低分子量肝素的有效性；其中全血樣品中的凝固活性是這樣測(cè)定的首先在全血樣品中加入抑制劑，接著采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定血液樣品的凝固時(shí)間。凝固時(shí)間的長(zhǎng)短，或者抑制劑處理過的樣品值與對(duì)照值在凝固時(shí)間上的差別，用于監(jiān)控抗凝療法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，通過采用本文中所描述的方法監(jiān)控血液凝塊形成，提供一種監(jiān)控患者從與反向的血液凝固性相關(guān)的狀態(tài)恢復(fù)過來(lái)的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供診斷試劑盒，在存在和不存在前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的至少一種抑制劑的情況下，這種試劑盒被用于測(cè)定全血和血漿的凝固時(shí)間。
通過參考發(fā)明詳述，更好的理解本發(fā)明的各個(gè)方面。


圖1是一個(gè)示意圖，它表明了單核細(xì)胞TF在全血中纖維蛋白凝塊形成起始期間的中心作用。TFVIIa復(fù)合物將因子X激活為因子Xa以及因子IX激活為因子IXa。凝血酶(因子II)激活血小板，而血小板又為凝血酶原復(fù)合物(XaVa)形成血栓形成表面。纖維蛋白原被切割以產(chǎn)生纖維蛋白凝塊。該示意圖選自Kjalke等人，活性位點(diǎn)被滅活的因子VIIa、Xa和IXa在基于細(xì)胞的組織因子起始的凝固模型中抑制多個(gè)單步驟，Thromb.Haemost.，80578-84(1998)。
圖2表示在存在和不存在抗-TF抗體的情況下，在37℃溫育10分鐘后，通過比較凝固時(shí)間，檢測(cè)全血中外源性加入的TF。
圖3表示抗-TF抗體對(duì)再鈣化全血的凝固時(shí)間的效應(yīng)。將全血與LPS(10μg/mL)在37℃溫育2小時(shí)，由于誘導(dǎo)了TF表達(dá)而導(dǎo)致凝固時(shí)間縮短。抗-TF抗體的加入，封阻了LPS-介導(dǎo)的再鈣化全血凝固時(shí)間上的縮短。相比之下，加入非抑制性對(duì)照抗體，對(duì)LPS凝固時(shí)間沒有任何效應(yīng)。
圖4表示重組TF對(duì)再鈣化全血的凝固時(shí)間的效應(yīng)。全血中加入脂質(zhì)化的重組TF，以劑量依賴方式，在范圍為0-80pg/mL內(nèi)(平均值±95％平均值的可信區(qū)間，對(duì)于每個(gè)點(diǎn)n＝11個(gè)同樣樣品)，縮短了再鈣化全血的凝固時(shí)間。
圖5a表示從血液分離的細(xì)胞與多種血漿混合的凝固時(shí)間。
圖5b表示將抑制性的抗—因子XI抗體(100μg/mL)加入到血液中，37℃溫育10分鐘的效應(yīng)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。加入抗—因子XIa抗體延長(zhǎng)了凝固時(shí)間。相比之下，加入相應(yīng)量的對(duì)照抗體，并影響凝固時(shí)間。
圖5c表示在有或沒有LPS刺激的情況下，將玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)(32μg/mL)加入到血液中，37℃溫育2小時(shí)的效應(yīng)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。
圖6a表示未分級(jí)的肝素(0-0.1U/ml)對(duì)LPS-刺激的血液的凝固時(shí)間的效應(yīng)。
圖6b表示低分子量的肝素(LMWH；0-0.25U/ml)對(duì)LPS-刺激的血液的凝固時(shí)間的效應(yīng)。
圖6c表示水蛭素(0-0.1U/ml)對(duì)LPS-刺激的血液的凝固時(shí)間的效應(yīng)。
圖7將不穩(wěn)定心絞痛患者(n＝8)與健康正常人(n＝37)的再鈣化全血凝固時(shí)間進(jìn)行了比較。圓圈表示處于凝固時(shí)間的第5％和第95％之外的個(gè)體。
血液的總凝固性是由多種因子控制的，這些因子來(lái)自血液的可溶性部分(血漿)以及由細(xì)胞部分所提供的血液可溶性部分。測(cè)定凝塊形成或血液凝固性的傳統(tǒng)方法，例如，凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的測(cè)定等，一般采用血漿來(lái)測(cè)定血液的凝固性。但是，這些基于血漿的方法，卻忽略了細(xì)胞組分對(duì)血液凝固性所起的作用。一個(gè)例子是組織因子對(duì)血液凝固性的作用。正如上面所描述，組織因子是血液凝固的起始物和調(diào)節(jié)劑，并且可能存在于血液之中。組織因子水平的上升與病理狀態(tài)相關(guān)。除組織因子外，存在于血液的細(xì)胞組分之中或之上的其他成分也可能調(diào)節(jié)血液的凝固性，并且使血液在體內(nèi)易于凝集。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一個(gè)方法涉及到在有或沒有前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的抑制劑情況下，測(cè)定全血凝塊形成的。在有或沒有抑制劑的情況下，在凝固時(shí)間上的差異程度，與存在于樣品中的前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的量成比例，即當(dāng)差異較大時(shí)就表示所測(cè)定因子的量較多。除了在凝固時(shí)間上的差異外，凝固時(shí)間的絕對(duì)值也是重要的，因?yàn)閷?dǎo)致患者凝固性過高的原因，也可能除了前凝血質(zhì)水平的提高的另一種異常。
當(dāng)用組織因子的抑制劑實(shí)施本發(fā)明的測(cè)定法時(shí)，與上面提到的由Spillert和Lazaro所描述的修改的再鈣化時(shí)間測(cè)試—其中溫育于全血樣品中的內(nèi)毒素誘導(dǎo)了組織因子的合成，而組織因子又依次影響了血液樣品的凝固特性—相比，本發(fā)明的方法并不測(cè)定組織因子的合成對(duì)血液凝固性的效應(yīng)。相反，它測(cè)定現(xiàn)存于全血樣品中的組織因子對(duì)血液凝固性的影響。見例如，Santucci等人，全血中組織因子活性的測(cè)定，Thromb.Haemost.，83(3)445-54(2000)，此處引用作為參考。
實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)可以采用新鮮的全血；向全血中加入抑制劑，然后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定該血液樣品以及不加抑制劑樣品的凝固性?；蛘?，也可以將血液樣品收集于含諸如檸檬酸鹽、草酸鹽、EDTA等的抗凝血質(zhì)的容器中。這里的抗凝血質(zhì)不包括封阻內(nèi)源性凝塊形成通路的抗凝血質(zhì)，也就是說(shuō)，這里的抗凝血質(zhì)將封阻外源性或者共同的通路。隨后，可以將抑制劑加入，然后采用標(biāo)準(zhǔn)方法確定血液的凝固性。任何已知的測(cè)定血液凝固性的方法均可以用于本發(fā)明的方法中。
當(dāng)血液被收集到含有抗凝血質(zhì)的容器中時(shí)，在測(cè)定血液的凝固性或凝固時(shí)間時(shí)，必須將血液樣品中的抗凝血質(zhì)的效應(yīng)予以逆轉(zhuǎn)。這可通過加入鈣鹽諸如，例如，氯化鈣來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過加入鈣鹽再激活凝塊形成過程，測(cè)定經(jīng)抗凝處理的血液樣品的凝固時(shí)間就稱為再鈣化時(shí)間。
前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的任何抑制劑，只要對(duì)某一特定的前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)是特異的，就適用于本發(fā)明的方法。合適的抑制劑包括抗體或者前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的底物類似物，等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，類似物是肽。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，他們知道合適的抑制劑，并且這些抑制劑通?？缮虡I(yè)獲得。
在一個(gè)優(yōu)選的的實(shí)施方案中，抑制性抗體或者對(duì)組織因子表現(xiàn)出足夠親和力的多抗體聯(lián)合(combinations of antibodies)，可被用作TF因子VIIa復(fù)合物的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將兩種抗體，指定為VD10和VIC12，聯(lián)合使用。對(duì)試劑中抗體或多抗體聯(lián)合的濃度要予以提供，這樣就可以將其容易地加入到血液樣品中以提供恰當(dāng)?shù)慕K濃度，從而實(shí)施本發(fā)明的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑為因子VIIai，它是因子VIIa的無(wú)催化活性變體。
也可以在有某些另加的化合物存在下，采用本發(fā)明的方法來(lái)確定凝固時(shí)間；另加的化合物在鑒定和監(jiān)測(cè)某些與血栓形成有關(guān)的疾病狀態(tài)時(shí)，提供了診斷和治療用途方面的有用信息。化合物諸如同型半胱氨酸、組織因子、Russell’s蝰蛇毒和其他促凝血蛇毒，均予以考慮。計(jì)劃中用于本發(fā)明的凝塊形成過程的其他調(diào)節(jié)劑包括前凝血質(zhì)類諸如凝血酶、血小板激活因子、纖維蛋白原、高嶺土、硅藻土、腺嘌呤二磷酸、花生四烯酸、膠原和瑞斯托菌素。具有抗凝活性、可用作本發(fā)明的凝塊形成過程之調(diào)節(jié)劑的因子包括蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、抗凝血酶III、血栓調(diào)節(jié)素、組織纖溶酶原激活劑、尿激酶、鏈激酶、組織因子通路抑制劑和馮威布蘭特因子。所加入的可調(diào)節(jié)血液凝固活性的治療性藥物，也可以在本發(fā)明中用作調(diào)節(jié)劑。另外，癌細(xì)胞提取物和羊膜液也可以作為調(diào)節(jié)劑使用。
本發(fā)明并不局限于任何特定的測(cè)定凝塊形成方法。在本發(fā)明中，可以使用任何數(shù)量的已知的測(cè)定血液凝塊形成方法，其中包括手工、半自動(dòng)和全自動(dòng)的方法及其相應(yīng)裝置或儀器。適于該目的的儀器包括，例如，測(cè)定由起始凝塊形成而引起的機(jī)械阻抗的所有儀器。起始凝塊形成或者影響凝固時(shí)間的試劑，可以多種形式出現(xiàn)，其中包括但不限于溶液、冷干或風(fēng)干的形式、或者干板模式(dry card formats)。
例如，Sienco公司的SONOCLOTTM血液凝固分析儀，通過測(cè)定粘彈性以確定待測(cè)樣品的機(jī)械阻抗。這種分析對(duì)纖維蛋白形成非常敏感，因而提高了結(jié)果的敏感性和可重復(fù)性。
另一種裝置，血栓彈力描述儀(TEG)，也可用于測(cè)定粘彈性。這類儀器的一個(gè)例子是計(jì)算機(jī)化的血栓彈力描述儀(CTEG)，來(lái)自Haemoscope公司。SONOCLOTTM和CTEG都能夠通過分別測(cè)定血液的黏性或彈性的變化，記錄血液凝固過程中的變化。最后，可以得到一張整個(gè)過程的完整圖譜。
其他儀器諸如HEMOCHRONTM，雖然測(cè)定凝固時(shí)間，但是并不提供凝塊形成參數(shù)隨時(shí)間的變化曲線圖。該HEMOCHRONTM系統(tǒng)(InternationalTechnidyne公司)使用了于試管內(nèi)精確排列的磁塊以及位于儀器內(nèi)的磁性檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)凝塊的形成。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中的測(cè)定法是基于急情況實(shí)施的，例如，在急癥室中對(duì)懷疑具有急性血栓形成現(xiàn)象諸如心臟病發(fā)作或中風(fēng)的患者進(jìn)行測(cè)定，因而不需要使用任何抗凝血質(zhì)，并且可以用新鮮血液直接進(jìn)行測(cè)定。所需要的試劑，諸如抗體，可以預(yù)先加載到凝固分析儀中，然后確定凝固時(shí)間，同時(shí)還可以對(duì)不加抗體的對(duì)照樣品進(jìn)行測(cè)定。或者，也可以首先將血液收集到含結(jié)合鈣離子的抗凝血質(zhì)諸如檸檬酸鹽、草酸鹽、EDTA等的容器中，接著在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定凝固時(shí)間。為了起始含一種或多種這些抗凝血質(zhì)樣品的凝塊形成，必須加入鈣鹽。形成纖維蛋白聚合物所需要的時(shí)間，在這種情況下，被稱為再鈣化時(shí)間。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)血液的收集是在有內(nèi)源性接觸激活凝固途徑的一特定抑制劑，比如玉米胰蛋白酶抑制劑，存在下進(jìn)行時(shí)，可能會(huì)改善血液凝固中的前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的檢測(cè)敏感性和特異性。
作為對(duì)抗凝處理的血液進(jìn)行測(cè)定的例子，我們將1毫升檸檬酸化的血液與抑制性的抗一組織因子單克隆抗體(終濃度為10毫克/毫升)混和。將另一個(gè)同樣是1毫升分裝的檸檬酸化的血液與對(duì)照抗體或?qū)φ盏鞍踪|(zhì)混和。在對(duì)樣品進(jìn)行混合處理后，置于37℃溫育箱中。在經(jīng)過一定的溫育時(shí)間后，分別從每個(gè)樣品取出300微升，與40微升0.1M氯化鈣混合，然后采用自動(dòng)化儀器測(cè)定再鈣化時(shí)間(形成纖維蛋白所需要的時(shí)間)。對(duì)照與含有抑制劑(抗體)樣品在再鈣化時(shí)間上的差異，被診斷性地用于表明患者是否由于組織因子水平的升高而具有異常的血液凝固性以及患者是否需要醫(yī)療干預(yù)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于測(cè)定血液凝固性的測(cè)試試劑盒，其中提供了恰當(dāng)濃度的抑制劑，目的就在于根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)確定凝塊形成或再鈣化的時(shí)間。
組織因子(TF)，也稱為因子III，負(fù)責(zé)起始外源性血液凝固途徑。組織因子主要存在于循環(huán)血液的單核細(xì)胞中。某些疾病狀態(tài)可能會(huì)使人的單核細(xì)胞易于被組織因子所激活，所以就具有異?？焖俚娜虝r(shí)間傾向性。這樣的患者就很可能處于血栓形成或其他過程的危險(xiǎn)之中。
目前，還沒有任何方法來(lái)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)這種血液凝固性過高的狀態(tài)。通過在存在和不存在抗-TF抗體的情況下對(duì)未受刺激的凝固時(shí)間進(jìn)行比較、從而檢測(cè)出循環(huán)的TF水平，本發(fā)明可被用來(lái)評(píng)價(jià)血液的過高凝固性。在本發(fā)明的另一種形式中，通過在存在或不存在抗-TF抗體的情況下對(duì)患者的經(jīng)LPS-刺激的全血凝固時(shí)間進(jìn)行比較，已考慮過對(duì)血液凝固性過高的生理承受潛力進(jìn)行測(cè)定。
Hemochron P213樣品試管0.01M氯化鈣儲(chǔ)存液含有非抑制性抗體的對(duì)照小試劑瓶含有干燥的抗—組織因子抗體的小試劑瓶測(cè)試質(zhì)量對(duì)照試劑Hemoliance RecombiPlasTin儲(chǔ)存液(脂質(zhì)化的重組組織因子)TF稀釋液(20mM HEPES 150mM氯化鈉，pH7.4，含有0.10mg/mL牛血清白蛋白)含有抗凝血質(zhì)檸檬酸鹽液體和玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)的血液收集管Hemochron P213試管的準(zhǔn)備在進(jìn)行未受刺激的凝固時(shí)間測(cè)試之前，預(yù)先加載50μL 0.10M氯化鈣溶液于Hemochron P213試管中。將試管蓋上塞子于室溫保存。用于未受刺激的全血凝固時(shí)間的質(zhì)控樣品之制備陰性對(duì)照＝TF稀釋液強(qiáng)陽(yáng)性TF對(duì)照將脂質(zhì)化的重組TF儲(chǔ)藏液按1∶100進(jìn)行稀釋，也就是，將10μl脂質(zhì)化的重組TF儲(chǔ)藏液加入到0.99ml稀釋TF用溶液中。弱陽(yáng)性TF對(duì)照將強(qiáng)陽(yáng)性TF對(duì)照溶液按1∶7進(jìn)行稀釋，也就是，將100μL強(qiáng)陽(yáng)性TF對(duì)照溶液加入到0.60ml稀釋TF用溶液中。抽血棄去所抽血液開始的幾毫升，然后抽血至5ml檸檬酸鹽/CTI血液收集管中。所抽血液應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。循環(huán)的TF之未受刺激的血塊凝固時(shí)間測(cè)試(10分鐘溫育)從每8支檸檬酸鹽/CTI血液收集測(cè)試管中取出一支，用于未受刺激的凝固時(shí)間測(cè)試。
將10μl陰性或者陽(yáng)性TF對(duì)照試劑加入到下列4支測(cè)試小管中對(duì)照小管+陰性TF對(duì)照抗-TF抗體小管+陰性TF對(duì)照對(duì)照小管+陽(yáng)性TF對(duì)照抗-TF小管+陽(yáng)性TF對(duì)照取0.5mL檸檬酸鹽/CTI抗凝處理的血液，轉(zhuǎn)移到每支測(cè)試小管中。緩慢翻轉(zhuǎn)試管幾次予以混勻。
置于37℃水浴中溫育10分鐘。
在溫育10分鐘結(jié)束之后，從每支測(cè)試小管中取0.40ml血液轉(zhuǎn)移到含有50μl氯化鈣的Hemochron P213樣品試管中。
在Hemochron 8000上，選擇測(cè)試(test)＝“ACT”和試管(tube)＝“P214/5”。按“開始(start)”鍵，啟動(dòng)凝塊形成計(jì)時(shí)器。緩慢地轉(zhuǎn)動(dòng)Hemochron試管，將血液和氯化鈣溶液混勻。將試管置于Hemochron樣品井中。轉(zhuǎn)動(dòng)樣品井中的試管，直到綠燈亮了為止。
典型的未受刺激的凝固時(shí)間對(duì)照小管+陰性TF對(duì)照＞850秒TF抗體小管+陰性TF對(duì)照＞850秒對(duì)照小管+強(qiáng)陽(yáng)性TF對(duì)照250-350秒對(duì)照小管+弱陽(yáng)性TF對(duì)照650-750秒TF抗體小管+弱或強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照＞850秒為了闡明本發(fā)明在檢測(cè)循環(huán)的TF、從而評(píng)價(jià)血液的凝固性過高中的用途，圖2表示在存在和不存在抗-TF抗體的情況下，在37℃溫育10分鐘后，通過比較凝固時(shí)間，檢測(cè)全血中外源性加入的TF。
含有干燥的LPS的小試劑瓶含有干燥的LPS和干燥的抗-組織因子抗體的小試劑瓶含有抗凝血質(zhì)檸檬酸鹽液體和玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)的血液收集管Hemochron P213試管的準(zhǔn)備在進(jìn)行受刺激的組織因子凝固時(shí)間測(cè)試之前，預(yù)先加載50μl0.10M氯化鈣溶液于Hemochron P213試管中。將試管蓋上塞子于室溫保存。抽血棄去所抽血液開始的幾毫升，然后抽血至試劑盒所提供的5ml檸檬酸鹽/CTI血液收集管中。所抽血液應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。LPS-刺激的凝固時(shí)間測(cè)試(2小時(shí)溫育)取0.5ml檸檬酸鹽/CTI抗凝處理的樣本血液，轉(zhuǎn)移到下列每支測(cè)試小管中含有干燥的LPS和對(duì)照試劑的小管含有干燥的LPS和干燥的抗-TF抗體這二者的小管緩慢翻轉(zhuǎn)幾次測(cè)試小管，將樣品混勻。置于37℃水浴中2小時(shí)在溫育2小時(shí)結(jié)束之后，緩慢翻轉(zhuǎn)測(cè)試小管予以混勻。從每支測(cè)試小管中取0.40ml血液轉(zhuǎn)移到含有50μl氯化鈣的Hemochron P213樣品試管中。
在Hemochron 8000上，選擇測(cè)試(test)＝“ACT”和試管(tube)＝“P214/5”。按“開始(start)”鍵，啟動(dòng)凝塊形成計(jì)時(shí)器。緩慢地轉(zhuǎn)動(dòng)含有再鈣化血液的Hemochron試管。將試管置于Hemochron上。扭轉(zhuǎn)樣品井中的試管，直到綠燈亮了為止。
在2小時(shí)的LPS刺激后，典型的凝固時(shí)間為L(zhǎng)PS小管200-350秒帶有抗-TF抗體的LPS小管＞850秒在本實(shí)施例中描述的組織因子全血測(cè)定法，包括一個(gè)在SonoclotTM儀器上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作。這個(gè)操作使用了抗-TF抗體抑制實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)LPS-刺激的全血中組織因子水平。樣本要求使用19mm刻度針，按照靜脈切開放血術(shù)步驟，詳細(xì)操作見，例如，用于凝固性測(cè)試和凝固性測(cè)定法操作的血液樣本的收集、運(yùn)輸和加工(美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)文件，#H21-A-2，第11卷，第23)((Collection.Transport and Processing of Blood Specimensfor Coagulation Testing and Performance of Coagulation Assays)National Committee for Clinical Laboratory Standards document#H21-A-2，Volume XI，No.23)。首先收集一個(gè)棄管(頂部為藍(lán)色的Vacutainer)，接著在棄管內(nèi)放入含有50μg/ml的玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)和0.5ml 3.2％的檸檬酸鈉的塑料Vacutainer試管，用作實(shí)際的測(cè)試樣本。Vacutainer試管應(yīng)含有至少4.5ml血液。如果不夠4.5ml，不要繼續(xù)進(jìn)行測(cè)試。在樣本的收集過程中如果不能獲得充分的血流，那么就棄去樣本并嘗試在患者的另外一只胳膊上再進(jìn)行一次靜脈穿刺術(shù)。抽血后，緩慢翻轉(zhuǎn)Vacutainer幾次。注意將收集后的樣本放在室溫。試劑的制備和保存1.帶蓋小管(2.0-ml聚丙烯)和冷干試劑由Sienco提供。在小管的蓋上有彩色標(biāo)碼干凈無(wú)色蓋(代表對(duì)照單克隆抗體)，白色插入物(代表TF單克隆抗體混合劑)，黃色插入物(不含任何試劑)，藍(lán)色插入物(含有20微升0.5mg/ml的冷干的Difco內(nèi)毒素)。每個(gè)患者的樣品將需要4支試管，每種顏色1支。保存于2-8℃。
2.氯化鈣0.1M(Analytical Control Systems，Inc.，F(xiàn)ishers，Ind.)。保存于2-8℃。
1.于Tris緩沖的鹽液(pH7.4)1mg/ml BSA中的抗-骨鈣素單克隆抗體。保存于2-8℃。
2.于Tris緩沖的鹽液(pH7.4)1mg/ml BSA中的組織因子單克隆抗體。保存于2-8℃。所需要的設(shè)備1.SonoclotTM分析儀2.使用手冊(cè)3.由Sienco提供的小池。對(duì)于每一個(gè)患者的樣品，將需要5個(gè)小池(4個(gè)裝血液樣品，剩下的那個(gè)用來(lái)溫暖氯化鈣)4.由Sienco提供的磁力攪拌棒5.由Sienco提供的探針6.由Sienco提供的探針提取器7.加熱裝置或者設(shè)置到37℃的水浴箱8.計(jì)時(shí)器9.Eppendorf移液管和移液管吸頭(40微升，300微升和1000微升)10. 13個(gè)100mm規(guī)格的Haematologic Technologies公司的Vacutainer，其中每個(gè)含有0.5ml 3.2％緩沖的檸檬酸鹽和50μg/ml的玉米胰蛋白酶抑制劑11. 19mm刻度針操作步驟1.樣品的制備將1個(gè)無(wú)色透明小管、1個(gè)白色小管、1個(gè)黃色小管和1個(gè)藍(lán)色小管置于試管架上。手工混合Vacutainer 6-10次，確?；旌暇鶆?。在通風(fēng)櫥中或者在防濺裝置下打開Vacutainer。
2.吸取1.0ml血液移至每個(gè)無(wú)色透明和白色的小管中。在每個(gè)無(wú)色透明小管中加入5微升對(duì)照抗體。在每個(gè)白色小管中加入5微升TF單克隆抗體混合劑。把每個(gè)小管的蓋合上，緩慢翻轉(zhuǎn)6-10次，然后將小管置于水浴中。設(shè)定計(jì)時(shí)器為10分鐘。
3.吸取1.0ml血液移至每個(gè)黃色和藍(lán)色的小管中。不要向這些小管中加入任何試劑。把每個(gè)小管的蓋合上，緩慢翻轉(zhuǎn)6-10次，然后將小管置于水浴中。設(shè)定計(jì)時(shí)器為2小時(shí)。
4.樣品的測(cè)試a)吸取300微升氯化鈣移至已置于SonoclotTM分析儀側(cè)井中的小池中，如此將氯化鈣溫暖至37℃。
b)通過略微擺動(dòng)，將探針置于SonoclotTM上合適的位置。也是通過略微擺動(dòng)，將小池穩(wěn)固地置于插座上。
c)將1根磁力攪拌棒插入到小池中。
d)加40μl0.1M氯化鈣于小池中。合上蓋頭。
e)在校正溫育時(shí)間后，從水浴中移出合適顏色的小管并緩慢翻轉(zhuǎn)6-10次。把蓋子移開，然后立即吸出300微升樣品移至置于SonoclotTM分析儀中的小池中。要避免泡沫的形成。
f)緩慢地再抽吸樣品僅僅一次(以避免激活血小板)，使其與已處于小池中的氯化鈣混和均勻。一旦樣品被轉(zhuǎn)移到小池中并與氯化鈣混和，立即將SonoclotTM分析儀上的金屬肘節(jié)開關(guān)按至“開始(Start)”(下)位置，以激活磁力攪拌器。等待聲音提示以及屏幕上的文字說(shuō)明，以關(guān)閉蓋頭。合上門蓋(port head)這將把探針引入到樣品中并將開始進(jìn)行測(cè)試。
g)當(dāng)測(cè)試完成時(shí)將會(huì)聽到一聲聲音提示音響。讀取數(shù)據(jù)盤上的數(shù)值以及SonoclotTM分析儀的圖表記錄。SoneclotTM分析儀自動(dòng)地計(jì)算出凝固時(shí)間。即使音響較早地響起，也應(yīng)讓測(cè)試運(yùn)行至少20分鐘，以獲得更多原始數(shù)據(jù)。
h)立即記錄下全血的凝固時(shí)間，同時(shí)還有鑒定信息，其中包括小管的類型(無(wú)色透明，白色，黃色，或藍(lán)色)、患者的身份號(hào)碼和進(jìn)行測(cè)試的日期和時(shí)間。
i)清洗小池，用探針提取器處理探針j)對(duì)于每個(gè)樣品小管，一旦已將其溫育了合適的時(shí)間，就重復(fù)上述步驟a-i。
3.安全預(yù)防措施技術(shù)人員應(yīng)采取廣泛的預(yù)防措施，以消除通過血液中攜帶的病原體感染上疾病的可能性。這些預(yù)防措施應(yīng)至少包括眼鏡、手套和合適的罩衣。應(yīng)采用恰當(dāng)?shù)囊埔汗?、吸頭、小管和樣品容器處理技術(shù)。操作步驟評(píng)注1.檢查試劑的日期。試劑不應(yīng)該已過其失效期。
2.確保溫育時(shí)間和溫度的準(zhǔn)確性。這些步驟至關(guān)重要。
3.操作患者樣品時(shí)要采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施。
4.所有移液管吸頭使用塑料制品。在任何情況下，不能使玻璃制品與血液接觸。
5.采用合適的消毒程序以除去流出血液。
6.將測(cè)試試劑盒材料保存于2-8℃。失效期過后不要使用。這種測(cè)試僅用于體外診斷性研究。質(zhì)控1.與SonoclotTM分析儀一起提供的粘度油對(duì)照，應(yīng)按照說(shuō)明手冊(cè)中所述進(jìn)行。
2.技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)行定期的樣品復(fù)讀(至少每組或每25次讀數(shù)一次，無(wú)論哪個(gè)更頻繁)。為了這么做，從同一個(gè)溫育小管中吸取兩個(gè)300微升樣品并置于兩臺(tái)儀器中，以同時(shí)記錄全血的凝固時(shí)間讀數(shù)。對(duì)從小管中要吸出的每一個(gè)樣品都使用一支新移液管吸頭。復(fù)份數(shù)值的誤差應(yīng)在平均值的10％以內(nèi)。
3.為質(zhì)控目的，每日應(yīng)根據(jù)制造商的說(shuō)明要求，其位于SonoclotTM說(shuō)明書手冊(cè)第4章中，對(duì)儀器作出評(píng)價(jià)。錯(cuò)誤來(lái)源在進(jìn)行測(cè)定中可能發(fā)生的錯(cuò)誤是那些可以歸咎到技術(shù)人員錯(cuò)誤、儀器或供給問題以及記錄錯(cuò)誤的錯(cuò)誤。每一組錯(cuò)誤的主要來(lái)源包括1.技術(shù)人員錯(cuò)誤—低水平或創(chuàng)傷性靜脈穿刺，樣品抽不滿，樣品沒有恰當(dāng)?shù)鼗旌虾头D(zhuǎn)，樣品或鈣的體積不合適，溫育時(shí)間錯(cuò)誤，儀器使用錯(cuò)誤，數(shù)據(jù)傳輸錯(cuò)誤，或者樣品混雜。
2.儀器錯(cuò)誤—沒有按照說(shuō)明書進(jìn)行，沒有運(yùn)行儀器制造商的質(zhì)控操作步驟，沒有運(yùn)行凝固性質(zhì)控操作步驟，溫度錯(cuò)誤，以及復(fù)讀樣品間持續(xù)缺乏一致性。
3.記錄錯(cuò)誤—無(wú)法保持準(zhǔn)確和及時(shí)的記錄，數(shù)據(jù)傳輸錯(cuò)誤，沒有記錄小瓶的批號(hào)。受試人群供血受試者是從位于LaJolla，California的Scripps研究所(TheScripps Research Institute)的一般臨床研究中心(General ClinicalResearch Centre(GCRC))中的健康正常人群中抽取的。受試者沒有長(zhǎng)期服用任何藥物，并且在供血前的20天內(nèi)不能使用非類固醇性抗炎藥物(NSAIDS)。人血液樣品的使用，得到了人類受試者研究委員會(huì)(Human Subjects Research Committee)的批準(zhǔn)，并受其管理。凝固時(shí)間的測(cè)定全血凝固時(shí)間的測(cè)定，正如上面所描述，使用了SonoclotTMCoagulation and Platelet Function Analyzer(Sienco公司，WheatRidge，CO)，這種儀器將一次性使用的振動(dòng)探針浸入300μl全血中，以測(cè)定纖維蛋白絲的黏性阻力(1，2)。通過使用Sienco公司修改的軟件以用于預(yù)定啟始(custom onset)計(jì)算法(CoagulationDiagnostics公司，Bethesda，MD)，計(jì)算再鈣化樣品的阻抗上升至高于基線6個(gè)單位的秒數(shù)，就可以得出凝固時(shí)間。正如上面所提到，用于測(cè)定的全血樣品，是無(wú)創(chuàng)傷性地收集至含有0.5ml 3.2％檸檬酸鈉(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)的5ml Vacutainer玻璃試管中的。從抽血到進(jìn)行測(cè)試，這之間的時(shí)間少于4小時(shí)。在將血液等量分裝至溫育試管中之前，將裝有血樣的試管翻轉(zhuǎn)幾次以對(duì)全血進(jìn)行再混合。在有或沒有細(xì)菌脂多糖(LPS)(10μg/ml)(大腸桿菌055B5 Weatphal，Difco；Detroit，MI)存在下，將處于塑料試管中的血液(1ml)于37℃溫育10分鐘或2和4小時(shí)。在37℃溫育期間不能有任何攪動(dòng)。溫育之后，再混合血液，然后等量分裝300μl至已溫暖的小池中，小池中已預(yù)先加載了40微升0.1M CaCl2和磁力攪拌棒。在10秒的攪拌順序之后，對(duì)凝固時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。抑制TF活性對(duì)凝固時(shí)間的效應(yīng)通過加入終濃度為10g/ml抑制性的鼠抗人組織因子(3)(9C3，5G9，6B4)的IgG1單克隆抗體的混合劑，，測(cè)定了抑制性的抗-TF抗體對(duì)凝固時(shí)間的影響。非抑制性的鼠IgG1抗體(10H10)被用來(lái)作為對(duì)照。
為了確定TF對(duì)全血的凝固時(shí)間所起的作用，我們檢驗(yàn)了抑制性的抗-TF抗體混合劑對(duì)凝固時(shí)間的效應(yīng)。抑制性的抗-人TF單克隆抗體顯著地延長(zhǎng)了LPS-刺激的血液的凝固時(shí)間，但對(duì)來(lái)自健康自愿者的未受刺激的血液就不是這樣。非抑制性抗體對(duì)照對(duì)受刺激或未受刺激的血液沒有任何效應(yīng)(圖3)。對(duì)19位健康個(gè)體的進(jìn)一步研究證明，抑制性的抗-TF抗體對(duì)平均基線凝血時(shí)間(10分鐘)沒有任何效應(yīng)(有抗體存在時(shí)478±78對(duì)無(wú)抗體存在時(shí)473±113，平均值±SD)。這些數(shù)據(jù)表明，該測(cè)定法測(cè)定了LPS-刺激的全血中依賴TF的纖維蛋白絲形成。加入到全血中的重組的脂質(zhì)化TF，在0-80pg/ml的范圍內(nèi)以劑量依賴方式，縮短了再鈣化的全血凝固時(shí)間(圖4)。實(shí)施例4 接觸激活途徑對(duì)未受刺激血液的凝固時(shí)間的作用為了估計(jì)接觸激活途徑對(duì)全血凝固所起的作用，我們使用了3個(gè)方案i)我們將再構(gòu)建于因子XII，XI，或VII缺陷的血漿中的血液形成凝塊；ii)我們使用了玉米胰蛋白酶抑制劑，它抑制因子XIIa；和iii)我們使用了抑制性的抗—因子XIa抗體，以抑制因子XIa活性。為了確定缺陷血漿的效應(yīng)，通過850×g離心10分鐘將細(xì)胞與血漿分開，并對(duì)所分離的細(xì)胞進(jìn)行沖洗和再懸浮于以下血漿自體血漿，匯集的正常血漿，因子XI-缺陷血漿，因子XII-缺陷血漿和因子VII-缺陷血漿(Sigma)。在分析因子XIIa抑制實(shí)驗(yàn)中，我們使用了玉米胰蛋白酶抑制劑(32g/ml)(Haematologic Technology，EssexJunction，VT)。在分析因子XIa抑制實(shí)驗(yàn)中，在37℃溫育之前，將山羊抗-人因子XIa抗體(10g/ml)(由K.Mann博士慷慨提供)或者未免疫山羊抗體對(duì)照加入到全血中。在所有情況下，在測(cè)定全血凝固時(shí)間之前，均將血液在37℃溫育10分鐘。
在測(cè)定凝固時(shí)間之前，將從全血中分離的細(xì)胞與多種血漿再構(gòu)建。再構(gòu)建于自體血漿中的細(xì)胞比未處理的血液表現(xiàn)出略微較快的凝固時(shí)間(圖5A)，這也許反映出在分離細(xì)胞的過程中，單核細(xì)胞和血小板被部分激活。再構(gòu)建于正常血漿或因子VII-缺陷血漿中的細(xì)胞，所表現(xiàn)出的凝固時(shí)間與用自體血漿再構(gòu)建所觀察到的那些結(jié)果相似，這與抗-TF抗體研究相一致，即未受刺激的血液沒有表現(xiàn)出任何TF活性。自體血漿與正?；蛞蜃覸II-缺陷血漿之間的微小差別，也許是由于新鮮血漿與冰凍/冷干血漿之間有不同之處所致。與用因子VII-缺陷血漿所得到的結(jié)果相反，當(dāng)將細(xì)胞與因子XI-和因子-XII這二者均缺陷的血漿再構(gòu)建時(shí)，凝固時(shí)間被顯著地延長(zhǎng)了，這就提示接觸激活途徑對(duì)未受刺激血液的凝固時(shí)間產(chǎn)生了作用。類似地，抑制性的抗-因子XIa抗體顯著地延長(zhǎng)了未受刺激全血的凝固時(shí)間(圖5B)。
我們使用了玉米胰蛋白酶抑制劑，以封阻因子XIIa活性(4)。又一次地，我們同樣觀察到在存在玉米胰蛋白酶抑制劑時(shí)，未受刺激血液的凝固時(shí)間延長(zhǎng)了(圖5c)。在使用或不使用玉米胰蛋白酶抑制劑的情況下，在凝固時(shí)間上的平均差異為141±88秒(平均值±SD，n＝28)。重要的是，玉米胰蛋白酶抑制劑并不封阻LPS-刺激的血液的凝固時(shí)間(圖5c)，并且我們已經(jīng)表明它是依賴TF的(見圖3)?？偲饋?lái)，這些研究表明雖然接觸激活途徑對(duì)未受刺激血液的凝固時(shí)間產(chǎn)生了作用，但是它并不顯著地影響LPS-刺激的血液之較短的凝固時(shí)間。實(shí)施例5 抑制抗凝血質(zhì)對(duì)全血凝固時(shí)間的作用我們對(duì)未分級(jí)肝素、低分子量肝素(LMWH)和水蛭素這些抗凝血質(zhì)對(duì)LPS-刺激的血液的凝固時(shí)間進(jìn)行了檢驗(yàn)。其結(jié)果分別表示于圖6A-6C。未分級(jí)肝素和LMWH既抑制凝血酶又抑制因子Xa。但是，相對(duì)于其抗—因子Xa活性，未分級(jí)肝素表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凝血酶活性(5)。相反，與其抗-因子Xa活性相比，LMWH之類所具有的抗凝血酶活性低(5)。水蛭素選擇性地抑制凝血酶(6)。對(duì)LPS-刺激的血液施用臨床相關(guān)劑量的這三種抗凝血質(zhì)中的任何一種，均以劑量依賴方式顯著地延長(zhǎng)了凝固時(shí)間。這些數(shù)據(jù)表明，該凝固時(shí)間測(cè)定法可用于臨床方面，以監(jiān)測(cè)抗凝血質(zhì)治療。實(shí)施例6 不穩(wěn)定心絞痛患者的血液凝固時(shí)間為了研究不穩(wěn)定心絞痛，我們對(duì)收入位于Baltimore的JohnHopkins醫(yī)院急癥室、入院診斷為不穩(wěn)定心絞痛患者(n＝8)的血液進(jìn)行了分析。排除了服用抗凝血質(zhì)的患者。將一組來(lái)自同一地點(diǎn)的健康自愿者(n＝37)作為對(duì)照組。人血樣品的使用，得到了人類受試者研究委員會(huì)(Human Subjects Research Committee)的批準(zhǔn)，并受其管理。在文獻(xiàn)(7，8，9，10)中已報(bào)道不穩(wěn)定心絞痛患者的血液中的TF蛋白質(zhì)的水平升高。我們檢查了收入急癥室、患有不穩(wěn)定心絞痛患者的未受刺激血液的凝固時(shí)間。不穩(wěn)定心絞痛患者的未受刺激血液的凝固時(shí)間顯著地快于健康自愿者組的凝固時(shí)間(圖7)。這些結(jié)果表明，不穩(wěn)定心絞痛患者的循環(huán)TF活性水平已經(jīng)提高了。
雖然前面的詳述講述了本發(fā)明的原理，為了闡明還提供了實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，通過閱讀本發(fā)明公開內(nèi)容，可以對(duì)其進(jìn)行多種形式和細(xì)節(jié)上的改變而不脫離本發(fā)明的真正范疇。
本文所引用的所有專利和出版物，均為全文引用、作為參考。
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權(quán)利要求
1.一種用于確定全血中前凝血質(zhì)的存在及其功能測(cè)定的方法，包括(a)收集全血樣品；(b)將全血樣品至少等量分裝兩份；(c)于等量分裝物之一中加入至少一種前凝血質(zhì)抑制劑；(d)對(duì)等量分裝物進(jìn)行溫育；(e)測(cè)定每個(gè)等量分裝物的凝固時(shí)間；和(f)比較各等量分裝物的凝固時(shí)間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的前凝血質(zhì)選自α-2-抗纖維蛋白溶酶、纖維蛋白原、高分子量激肽原、激肽釋放酶、前激肽釋放酶、組織因子、因子II、因子IIa、因子Va、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，它進(jìn)一步地包括將接觸激活抑制劑加入到全血樣品中或者在存在接觸激活抑制劑的情況下收集樣品或全血。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的接觸激活抑制劑是玉米胰蛋白酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的前凝血質(zhì)抑制劑是抗體或前凝血質(zhì)底物的類似物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的抑制劑是抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的類似物是肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，它進(jìn)一步包括將對(duì)照抗體加入到不含前凝血質(zhì)的抗體性抑制劑的等量分裝物中，其中對(duì)照抗體的加入量與前凝血質(zhì)的抗體性抑制劑基本相等。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的前凝血質(zhì)不是組織因子。
10.一種用于確定全血中抗凝血質(zhì)的存在及其功能測(cè)定的方法，包括(a)收集全血樣品；(b)將全血樣品至少等量分裝兩份；(c)于等量分裝物之一中加入至少抗凝血質(zhì)抑制劑；(d)對(duì)等量分裝物進(jìn)行溫育；(e)測(cè)定每個(gè)等量分裝物的凝固時(shí)間；和(f)比較各等量分裝物的凝固時(shí)間。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的抗凝血質(zhì)選自α-1-抗胰蛋白酶、激活的蛋白質(zhì)C、抗凝血酶III、C1酯酶抑制劑、肝素、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、血栓調(diào)節(jié)素和組織因子通路抑制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，它進(jìn)一步地包括將接觸激活抑制劑加入到全血樣品中或者在存在接觸激活抑制劑的情況下收集樣品或全血。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的接觸激活抑制劑是玉米胰蛋白酶抑制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的抗凝血質(zhì)抑制劑是抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，它進(jìn)一步包括將對(duì)照抗體加入到不含抗凝血質(zhì)的抗體性抑制劑的等量分裝物中，其中對(duì)照抗體的加入量與抗凝血質(zhì)的抗體性抑制劑基本相等。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將全血樣品收集到含有檸檬酸鹽的溶液中，并且在步驟(e)之前將血液再鈣化。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中將全血樣品收集到含有檸檬酸鹽的溶液中，并且在步驟(e)之前將血液再鈣化。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中將全血樣品收集到含有檸檬酸鹽的溶液中，并且在步驟(e)之前將血液再鈣化。
19.一種用于確定全血中前凝血質(zhì)的存在及其功能測(cè)定的試劑盒，它包括(a)含有前凝血質(zhì)抑制劑的小瓶；(b)含有非抑制性對(duì)照試劑的小瓶；和(c)含有液體檸檬酸鹽抗凝血質(zhì)的小瓶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中含有液體檸檬酸鹽抗凝血質(zhì)的小瓶進(jìn)一步地包含玉米胰蛋白酶抑制劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述的前凝血質(zhì)是組織因子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述的抑制劑是至少一種抗體。
23.一種用于確定全血中抗凝血質(zhì)的存在及其功能測(cè)定的試劑盒，它包括(a)含有抗凝血質(zhì)抑制劑的小瓶；(b)含有非抑制性對(duì)照試劑的小瓶；和(c)含有液體檸檬酸鹽抗凝血質(zhì)的小瓶。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中含有液體檸檬酸鹽抗凝血質(zhì)的小瓶進(jìn)一步地包含玉米胰蛋白酶抑制劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述的抑制劑是至少一種抗體。
26.一種用于確定全血中前凝血質(zhì)的存在及其功能測(cè)定的方法，包括(a)收集全血樣品；(b)將全血樣品至少等量分裝四份；(c)于兩個(gè)等量分裝物中加入免疫調(diào)節(jié)劑；(d)將至少一種前凝血質(zhì)抑制劑加入到一個(gè)沒有免疫調(diào)節(jié)劑的等量分裝物中以及一個(gè)有免疫調(diào)節(jié)劑的等量分裝物中；(e)對(duì)等量分裝物進(jìn)行溫育；(f)測(cè)定每個(gè)等量分裝物的凝固時(shí)間；和(g)比較各等量分裝物的凝固時(shí)間。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的全血樣品進(jìn)一步包含抗凝血質(zhì)和玉米胰蛋白酶抑制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑是內(nèi)毒素。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的抑制劑是抗體。
全文摘要
通過測(cè)定和比較加有和不加有前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的抑制劑情況下的凝固時(shí)間,本發(fā)明涉及快速評(píng)估患者血液樣品的總凝固特性。當(dāng)樣品為全血時(shí),所得到的凝固時(shí)間代表血液中的血漿和細(xì)胞組分的總凝固活性,該總凝固活性可以指示由異常凝固性而產(chǎn)生的已存在或即將發(fā)生的病理學(xué)。通過功能性地確定全血中的一種或多種前凝血質(zhì)或抗凝血質(zhì)的當(dāng)前水平,本發(fā)明還提供了一種用于測(cè)定患者發(fā)生血栓形成過程危險(xiǎn)性的方法。另外,本發(fā)明也提供了測(cè)定抗凝療法有效性的方法以及實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/86GK1368886SQ00810751
公開日2002年9月11日 申請(qǐng)日期2000年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月23日
發(fā)明者N·麥克曼, J·J·麥克唐奈 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究所, 凝血診斷公司