專利名稱：在凝血反應中有治療活性的新型肽化合物，其制備方法及其藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在凝血反應中有治療活性的新型肽化合物及其制備方法和含該化合物的藥物組合物。
眾所周知，當血液中的促凝血因子和抗凝血因子之間的平衡被破壞時，就會導致血栓或血塊的形成。促使血栓形成的主要病原因素有三個血流滯止或流速降低、凝固性高和血管壁內(nèi)皮損傷。為防止這些發(fā)病機理的發(fā)生，確立一種以抗凝血藥物為基本要素之一的治療方法是可取的。
抗凝血劑確實可以用于治療嚴重的靜脈血栓形成、肺栓塞、四肢動脈栓塞、動脈血栓形成(如心肌梗塞)、動脈粥樣硬化及所有其它血栓栓塞病癥；抗凝血劑也可用于維持血液環(huán)境穩(wěn)定，尤其是在體外循環(huán)中。
在已知的抗凝血劑當中，水蛭素，含有65個氨基酸的多肽，是從藥物水蛭的唾液腺提取得到的一種專一的凝血酶抑制劑(Biochem.25，4622-28，1986)。
各種可用作凝血酶抑制劑的水蛭素均已得到過報導。專利EP209061或EP332523所報導的化合物就是一個例子。而且，一些人工合成的具有抗凝血性質(zhì)的水蛭素片段的類似物也曾有過報導，專利EP276014、EP291981、EP291982和EP333356中要求的化合物即屬此類。與天然樣品相比，這些較短的肽段(10到20個氨基酸)具有“更易于控制”，尤其是合成更簡單的優(yōu)點。
最近，歐洲專利申請EP0,372,503報導了一些和水蛭素結(jié)構(gòu)相似的肽，在這些肽化合物中一個天然的氨基酸被一個人工合成的氨基酸所取代。申請EP0,443,598所報導的與水蛭素結(jié)構(gòu)相似的肽中是一個天然氨基酸被一個磺化的或磷酰化的衍生物所取代。
專利申請PCT 91/01328、EP443429報導了一些水蛭素類似物，其修飾不僅涉及引入非天然氨基酸，而且還引入磺酰-氧代或膦酰-氧代氨基酸。
本發(fā)明更具體地涉及式(I)的化合物H-phe-A1-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-A2-Leu-glu-OH (I)其中，A1代表一個脯氨酸殘基(Pro)、八氫吲哚-2-羰基(Oic)、2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-3-羰基(Abh)或2-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷-3-羰基(Abo)；A2代表一個對位或間位被一個PO3H2基團取代的苯丙氨酸殘基(Phe(pPO3H2)，Phe(mPO3H2))；它們與藥學上可接受的酸或者堿的加合鹽，肽序列上的每一個氨基酸都是光學純的，每一個氨基酸的碳原子都具有D或L構(gòu)型。
沒有任何限制意義，可以提及的藥學上可接受的酸有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、富馬酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、抗壞血酸、草酸、甲磺酸和樟腦酸等等；可提及的藥學上可接受的堿有氧氧化鈉、氫氧化鉀、三乙胺和叔丁基胺等等。
本發(fā)明還進一步涉及式(I)衍生物的制備方法，其制備方法有很多種，如順序固相合成、液相肽段縮合合成、酶促合成、克隆并在轉(zhuǎn)化細菌中表達基因的遺傳合成，或上述各種方法的結(jié)合。
B.W.ERICKSON和R.B.MERRIFIED曾報導過固相肽合成的一般方法(“The Proteins”，Solid-Phase Peptide Synthesis，3rd edi-tion，257-527，1976)。
固相肽合成可以在自動化儀器上進行，這種自動化儀器以一種反復的程序控制方式執(zhí)行去保護、縮合和洗滌的循環(huán)操作，從而把氨基酸按順序接成肽鏈。氨基酸(最好是C-末端的氨基酸)被連接到樹脂上。通常用于制備多肽的樹脂最好是以0.5-3.0％的苯二乙烯與聚苯乙烯交聯(lián)，并供以一些活性殘基如氯亞甲基或羥亞甲基，使得第一個氨基酸以共價鍵連接到樹脂上。選用合適的樹脂就可使羧酸、酰胺或醇等C-末端功能團連接到樹脂上。
氨基酸在控制儀的控制下一個一個按順序接入。每接一個氨基酸需要一個合成循環(huán)，每個循環(huán)要經(jīng)過以下步驟去保護(最好是肽鏈的N-末端去保護)，連續(xù)洗滌(為除試劑或溶脹樹脂)，氨基酸活化與縮合以及重新洗滌。每個循環(huán)之后緊接著一次過濾，過濾由裝在合成反應器中的燒結(jié)多孔玻璃來完成。肽合成所用的縮合劑通常是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基-氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)或二苯基磷?；B氮化物(DPPA)。
另外還可使用形成混合酸酐的活化方法。
每次放入反應器的氨基酸大約是樹脂取代度的四倍，與縮合劑的量大致相當?？s合反應可在其合成的每一階段用E.KAISER等人報導的茚三酮反應試驗來檢測(Analyt.Biochem.，34，595，1970)。
在樹脂上組裝肽鏈后，在苯甲醚、乙二硫醇或2-甲基吲哚存在下用強酸如三氟乙酸或氫氟酸處理，使肽與樹脂脫離，同時肽鏈的一些保護基也可能被切除。所得產(chǎn)物用常規(guī)提純技術純化，一般使用色譜技術。
本發(fā)明肽也可用液相法制備先在固相或溶液相中制備肽段，再選擇性地保護肽段，最后在溶液中縮合肽段。除了不必將肽鏈接到樹脂上之外，液相法與固相法基本相似，也要使用保護基并利用它們不同的穩(wěn)定性。例如C-末端的羧基可用甲酯或酰胺功能團保護?？s合肽段的活化方法也與固相法類似。
式(I)化合物具有非常優(yōu)越的藥理特性。它們具有抗凝血和抗血栓形成的性能，能夠溶解血塊從而防止血栓栓塞后并發(fā)癥的發(fā)生它們也可直接用作速效抗凝血劑，防止血栓形成的擴張。藥理學試驗結(jié)果表明本發(fā)明化合物具有比參比化合物hirulog-1(J.M.MARAGANORE et al.，Biochem.，29，7095-7101，1990)更高的抗血栓形成活性，活性更高是因為它對凝血酶催化位點的抑制作用更強。
本發(fā)明的主題還有以本發(fā)明化合物作為活性成分的藥物組合物。這些藥物組合物至少要包含一種具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化合物或其與藥學上可接受的酸或堿的加合鹽，它們可單獨使用或者與一種或多種的非毒性惰性賦形劑或載劑結(jié)合使用。
在本發(fā)明的藥物組合物中，要特別提到的是那些適于口服、腸胃外投藥、鼻內(nèi)投藥及可制成普通藥片、糖衣片、舌下片、貼劑、急救包、膠囊、glossettes、錠劑、栓劑、乳膏、軟膏、皮凝膠、氣霧劑、供口服和注射的安瓿劑等藥物組合物。
劑量大小要根據(jù)患者的年齡、體重、病種、病情輕重以及投藥方式而定。
可以口服、鼻內(nèi)投藥、直腸投藥或腸胃外投藥。通常一次治療的劑量在0.05-0.3mg之間，可以每24小時一次投藥或均分幾次投藥。
下面舉例說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
在下面的實例中，氨基酸的縮寫以大寫字母開頭的是L構(gòu)型，以小寫字母開頭的是D構(gòu)型。
稱做Abo的氨基酸是3S構(gòu)型。
稱做Oic的氨基酸是2S、3aS、7aS構(gòu)型。
Phe(pPO3H2)代表殘基 Phe(m PO3H2)代表殘基
在制備A中所描述的化合物是合成式(I)化合物的中間體。制備AN-Fmoc-4-(二甲氧磷酰基)-L-苯丙氨酸(或Fmoc-Phe(p PO3(Me)2)步驟AN-Boc-4〔((三氟甲基)磺?；?氧基〕-L-苯丙氨酸芐酯向冰浴冷卻下的含有6.8mmol的N-Boc-L-酪氨酸芐酯和7.4mmol的苯基二((三氟甲基)磺?；?胺和10ml二氯甲烷的溶液中，逐滴加入7.4mmol的三乙胺，于0℃攪拌混合物1小時，室溫下攪拌2小時。加入60ml乙醚后，依次用水、1N氫氧化鈉、水、飽和氯化鈉溶液洗滌有機相，然后干燥并蒸發(fā)。最后以80/20的戊烷/乙酸乙酯作洗脫劑，在硅膠柱上層析純化，即得到所要的油狀產(chǎn)物。步驟BN-Boc-4-(二甲氧磷酰基)-L-苯丙氨酸芐酯取1.1mmol上步所得的化合物、1.4mmol甲基嗎啉、1.32mmol的(EtO)2POH和0.032mmol的Pd(O)(p PH3)4懸浮于3ml無水乙腈中，于70℃，N2氣下攪拌15個小時。冷卻后，加入40ml乙酸乙酯，分別用5％檸檬酸和10％的碳酸氫鈉溶液洗滌有機相，然后干燥、蒸發(fā)。用3/7的乙酸乙酯/戊烷作洗脫劑，在硅膠柱上層析純化后，得到所要的油狀產(chǎn)物。步驟CN-Boc-4-(二甲氧磷酰基)-L-苯丙氨酸將含有14.4mmol上步所得的化合物在60ml甲醇和40ml水中的溶液在氫氣壓下，用10％的鈀/碳作催化劑還原。過濾并蒸干溶劑后，得到油狀產(chǎn)物。步驟DFmoc-Phe(p PO3(Me)2)
上步所得的化合物用B.Gutte等人(J.Biol.Chem.，246，1922-1941，1971)報導的方法脫除保護基，用Carpino等人(J.Org.Chem.，37，3404-3409，1972)報導的方法接上Fmoc基團。實施例1H-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH實例1化合物的合成是在0.33mmol/g的Fmoc-glu(OtBu)-OH取代的2g樹脂上，按照下列重復過程進行
合成反應在事先已裝入多孔玻璃的玻璃槽(即反應器)中進行，每一步操作都在30ml的溶劑中于室溫攪拌下完成，并緊接著經(jīng)多孔玻璃過濾。樹脂保留在過濾器上，逐步延長的肽鏈就連在樹脂上。
按以下順序連接所選的被保護氨基酸Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe(pPO3Me2)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Abo-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pmc)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-phe-OH.
在30ml DMF中溶解2.64mmol(4當量)的被360mg HOBT保護的氨基酸，再于室溫下30分鐘后加入618mg DCC，活化每一循環(huán)中待縮合(操作6)的氨基酸。然后隨即將溶液轉(zhuǎn)到含10ml二氯甲烷的反應槽中。
一般用95％三氟乙酸(TFA)，在苯甲醚或乙二硫醇的存在下處理樹脂，再用含90％TFA、5％(CH3)3SiBr和5％茴香硫醚的溶液選擇性去除磷酸酯基的甲基而脫保護，便得到所要的產(chǎn)物。經(jīng)制備性高效液相色譜(HPLC)純化后，冷凍干燥此肽。
用6N鹽酸于110℃水解所得產(chǎn)物(肽)18個小時，使其分解為氨基酸，再用HPLC對氨基酸進行定量分析。
Arg Gly Asp+Asn Phe Glu Aso+Ile Pro Leu計算值 15 2 24 2 31實測值 1.04 4.9 2.01 1.89 4.27 1.82 3.02 1.03質(zhì)譜(FAB)MH+，m/2＝2381以下各實例中化合物的制備方法同實施例1所述。實施例2H-phe-Oic-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OHArg Asp+Asn Glu Gly Pro Phe Abo+Ile Leu Oic計算值1 2 4522 2 l 1實測值 0.87 2.08 4.31 5.07 2.13 1.82 1.89 1.08 1.03質(zhì)譜(FAB)MH+，m/z＝2435實施例3H-phe-Abh-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH實施例4H-phe-Abo-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH實施例5H-phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(mPO3H2)-Leu-glu-OH
本發(fā)明化合物的藥理學研究實施例6抗血栓形成活性結(jié)扎雄性OFA鼠的下腔脈誘發(fā)導致的靜脈血栓形成可作為本實驗的血栓形成模型，(Millet et al.，Thrombosis Res.，45123-133，1987)。用戊巴比妥鈉(50mg/kg i.p.)麻醉試驗動物。結(jié)扎前15分鐘，用本發(fā)明物質(zhì)靜脈內(nèi)處理動物。結(jié)扎后25分鐘，從下腔取出血塊，于60℃干燥24小時，稱重。本發(fā)明化合物的試驗劑量為0.05到1mg/kg，hirulog-1的試驗劑量為0.1到1 mg/kg。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明物質(zhì)的血塊重減輕量明顯大于hirulog-1的減輕量。就此實驗模型來說，實施例1化合物的活性是hirulog-1的20倍，實施例2化合物是它的10倍。血塊重減輕量％
實施例7抗凝血活性，凝血酶時間和活化腦磷脂時間的測量在標準量凝血酶或活化腦磷脂存在下，正常血漿分別在一定的時間內(nèi)即凝血酶時間(TT)和活化腦磷脂時間(ACT)內(nèi)凝固。由藥物延長凝血時間反映出抗凝效果。
產(chǎn)物的離體抗凝效果用人血漿檢測。穿刺靜脈，收集血液到含檸檬酸鹽的試管中，經(jīng)過傾析(1200g，10min)，傾出血小板含量低的血漿，然后進行凝血試驗。本發(fā)明化合物明顯延長了TT和ACT。實施例1化合物在濃度為0.05M時延長TT一倍，在濃度為0.14M時延長ACT一倍。抗凝活性分別高于濃度相應為0.07M和0.2M的hirulog-1。
本發(fā)明產(chǎn)物的體外抗凝效果由戊巴比妥鈉(60mg/kg i.p.)麻醉的OFA鼠來測試。鼠的頸動脈和頸靜脈都插入導管之后，收集1.5cm3的動脈血到0.109M的檸檬酸鹽溶液中。30分鐘后，將1ml待測物靜脈注入。分別在1.5min、3min、5min、15min、30min和60min后收集1.5cm3的動脈血樣。每收集一次血樣，就重新注射1.5cm3的含檸檬酸鹽的生理鹽水到鼠體內(nèi)(頸動脈注射)。本發(fā)明化合物顯著延長了鼠離體的TT和ACT。所延長時間(倍增因數(shù))明顯大于hirulog-1的倍增因數(shù)，而且作用期也更長。TT的延長量
ACT的延長量
實施例8對凝血酶和絲氨酸蛋白酶的抑制為測定本發(fā)明產(chǎn)物對人凝血蛋白酶(Sigma，比活力3230 NI-HU/mg)的體外抑制活性，分別在有和無試驗抑制劑的條件下，于20℃溫浴一定量的凝血酶(0.7或0.2nM)10分鐘，然后加入人纖維蛋白原(Fg)(純化的或血漿的)或生色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(0.66nM，S2238，Kabi)。
為測定這些物質(zhì)對不同的凝血絲氨酸蛋白酶的選擇性(在體外)，分別對純?nèi)死w維蛋白溶酶(2nM，Stago)、純?nèi)嘶罨蜃覺(2nM，Stago)、激肽釋放酶(2nM，Sigma)、尿激酶(2nM，Sigma)、纖維蛋白溶酶原組織激活因子(t-PA；2nM，Stago)和純?nèi)嘶罨鞍證(2nM，Stago)進行同樣的操作過程，但要用不同的含對硝基苯酰胺肽作底物。抑制劑、酶和底物在同一緩沖液(0.01nM磷酸緩沖液，pH7.4，含0.12M的氯化鈉和0.05％牛血清白蛋白)中稀釋，然后分配到體積為50ml的聚苯乙烯微孔板中。
于20℃反應15到30min后，在凝血酶作用下形成的纖維蛋白或在絲氨酸蛋白酶作用下釋放出來的對硝基苯胺可用分光光度法在450nM處測定。
下列結(jié)果表明本發(fā)明化合物和hirulog-1分別在纖維蛋白原和生色底物存在下對凝血酶的抑制作用。結(jié)果以IG50值表示，即抑制酶活力達50％時所需濃度(nM)。本發(fā)明化合物的抑制活性高于hirulog-1，尤其是在生色底物的情況下，這說明了本發(fā)明化合物對凝血酶的催化部位的抑制作用更強。
同hirulog-1一樣，本發(fā)明化合物對凝血酶具有高度選擇性，因為它對其它的纖維蛋白溶解和凝血絲氨酸蛋白酶的IC50值都要大于33M。實施例9藥物組合物注射溶液注射溶液實施例1化合物5mg注射用蒸餾水適量至25ml藥劑1000片的配方實施例1化合物………………………………………………………5g小麥淀粉……………………………………………………………10g玉米淀粉……………………………………………………………10g乳糖…………………………………………………………………60g硬脂酸鎂……………………………………………………………2g硅石，羥丙基纖維素………………………………………………2g還需一個額外的包囊以保證蓋侖制劑的胃耐受性。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物H-phe-A1-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-A2-Leu-glu-OH(I)其中A1代表一個脯氨酸殘基(Pro)、八氫吲哚-2-羰基(Oic)、2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-3-羰基(Abh)或2-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷-3-羰基(Abo)，A2代表一個對位或間位被PO3H2基團取代的苯丙氨酸殘基(Phe(pPO3H2)，Phe(mPO3H2))，它們與藥學上可接受酸或堿的加合鹽，肽序列上的每一個氨基酸均為光學純，每一個氨基酸的碳原子都具有D或L構(gòu)型。
2.如權(quán)利要求1所述的式(I)化合物，其中A1代表一個脯氨酸殘基(Pro)。
3.如權(quán)利要求1所述的式(I)化合物，其中A2代表一個(pPO3H2)苯丙氨酸殘基。
4.如權(quán)利要求1所述的式(I)化合物，它是H-phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH。
5.如權(quán)利要求1所述的式(I)化合物，它是H-phe-Oic-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH。
6.制備權(quán)利要求1所述的式(I)化合物的方法，可從被保護氨基酸順序固相合成，從肽段液相合成或者以上兩種方法的結(jié)合來獲得該化合物，如必要，式(I)衍生物可轉(zhuǎn)變成其與藥學上可接受的酸或堿的加合鹽。
7.一種藥物組合物，它至少包含一種權(quán)利要求1到5任一項所述的化合物作為活性成分，它們可以單獨使用或與一種或多種的藥學上可接受的非毒性惰性賦形劑或載劑結(jié)合使用。
8.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其至少含有一種權(quán)利要求1到5任一項所述的活性成分，它可用作抗凝血劑，治療急性靜脈血栓形成、肺栓塞、四肢動脈栓塞、心肌梗塞、動脈粥樣硬化和其它血栓栓塞病癥；也可用于維持血液內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，尤其是在體外循環(huán)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及如下式(I)的化合物H-phe-A其中A
文檔編號C07K7/08GK1134706SQ9419405
公開日1996年10月30日 申請日期1994年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月7日
發(fā)明者J·L·費切爾, C·瑟伊, T·韋伯恩, A·魯賓, S·西蒙特 申請人:阿迪爾公司