專利名稱：因子 a變體的檢測與測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及因子XIIa，所述因子XIIa是“接觸激活系統(tǒng)”的一個組分。
背景技術(shù)：
因子XIIa是存在于正常血液中的一種無活性的酶原。在體外，當(dāng)存在激肽釋放酶、高分子量激肽原和負(fù)電性表面時，它可以很容易地被轉(zhuǎn)化成具有酶活性的形式，因子XIIa。以前報道了兩種形式的體外活性因子XIIa。其中80Kd的是一種絲氨酸蛋白酶，通常稱為因子αXIIa，由52Kd的重鏈和28Kd的輕鏈經(jīng)二硫鍵連接組成。該因子經(jīng)蛋白酶解從重鏈釋放出一個肽，得到產(chǎn)物，即因子βXIIa，它保留了絲氨酸蛋白酶活性，是由因子αXIIa的28Kd鏈和源于其52Kd重鏈的一個小肽片段經(jīng)二硫鍵連接而成。在許多情況下，該小肽的分子量約為1000d，但體外也觀察到其不同大小的片段。
專利WO90/08835公開了一種因子XIIa的免疫測定方法，還公開了與因子XIIa結(jié)合的單克隆抗體2/215和201/9及其生產(chǎn)方法。產(chǎn)生單克隆抗體細(xì)胞株(mAb)2/215的雜交瘤2/215于1990年1月16日以存放號90011606存放于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(ECACC)(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心，生物制品部，PHLS Centre for Applied Microbiology and Research，PortonDown，Salisbury SP4 OJG，England)，產(chǎn)生單克隆抗體201/9的雜交瘤細(xì)胞株201/9于1990年1月18日以存放號90011893存放于ECACC。
很早就知道因子XIIa參與了體內(nèi)血液凝結(jié)的接觸系統(tǒng)。近期更多的工作表明XIIa也參與了其他的系統(tǒng)，如纖維蛋白溶解作用、激肽原生成、補體激活和血管發(fā)生。許多臨床和實驗數(shù)據(jù)表明接觸系統(tǒng)的作用已超越了血液凝結(jié)，它在維持血管完整和血壓上有作用，對內(nèi)皮細(xì)胞的多種功能有影響，參與了纖維蛋白溶解的控制和血管內(nèi)組成性抗凝因子的維持。深入的臨床和實驗研究表明接觸系統(tǒng)參與了急性和慢性炎癥、病原應(yīng)激、糖尿病、變態(tài)反應(yīng)、包括彌漫性血管內(nèi)凝血在內(nèi)的的凝血-出血紊亂和癌癥疾病。還有膿毒病、自發(fā)性流產(chǎn)和血栓栓塞。另外，因子XIIa也可能參與了組織防御和修復(fù)。Yarovaya等最近的文章(Yarovaya，G.A.，Blokhina，T.B.，& Neshkova，E.A.Contact system.New concepts on activationmechanisms and bioregulatory functions.Biochemistry(Mosc).2002 Jan；67(1)13-24)綜述了接觸系統(tǒng)和有關(guān)激活機(jī)制及生物調(diào)控功能的新概念。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從一個樣品中檢測或測定一種或幾種形式的因子XIIa的方法，包括一個可以將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被檢測或測定的過程。
在一個實施例中，本發(fā)明的一個方法能通過一個實驗將所研究的一種或幾種形式因子XIIa優(yōu)先于其他形式的因子XIIa被檢測或測定。
在另一個實施例中，本發(fā)明的一個方法能將所研究的一種或幾種形式的因子XIIa從其他形式的因子XIIa分離出來，并檢測或測定所分離的一種或幾種因子XIIa。
檢測或測定所分離的一種或幾種因子XIIa可以用一種能將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被檢測或測定的方法。
在另一個實施例中，本發(fā)明的一個方法包括將樣品用一個能與所研究的因子XIIa或者可選擇地，也能與其他形式的因子XIIa結(jié)合的標(biāo)記抗體結(jié)合，使所研究的因子XIIa從其他形式的因子XIIa中分離，并檢測或測定所研究的因子XIIa。
本發(fā)明也提供一種方法，對某些疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的人的治療提供信息。這包括從病人樣品中將一些因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被檢測或測定，并將該病人樣本的測試結(jié)果與用相同方法測試如下至少一種到數(shù)種對象的樣本的結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有這種疾病或紊亂的研究對象；(ii)患有這種疾病或紊亂的研究對象，對其這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果進(jìn)行了監(jiān)測；(iii)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象；(iv)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象，該研究對象針對對這種疾病或紊亂的治療過程或結(jié)果被監(jiān)測；(v)未患這種疾病或紊亂的研究對象；(vi)同一研究對象在這種疾病或紊亂發(fā)作之前或在對這種疾病或紊亂治療開始之前，以及(vii)同一研究對象在這種疾病或紊亂早期或晚期，或在對這種疾病或紊亂治療的早期或晚期，或在這種疾病或紊亂開始之前。
本發(fā)明還提供一種方法包括對來源于患有疾病或紊亂或在接受治療的對象的樣品的因子XIIa進(jìn)行一系列的測試，并選擇一個測試方法提供與疾病或紊亂或其治療相關(guān)的因子XIIa的水平的信息。
本發(fā)明也提供一種方法測試因子XIIa，適宜于對某些疾病或紊亂的易感性、進(jìn)展或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的人的治療提供相關(guān)信息。這包括對來源于患有疾病或紊亂或在接受治療的對象的樣品的因子XIIa進(jìn)行一系列的測試，并決定選擇哪一個(幾個)測試結(jié)果來為某些疾病或紊亂的易感性、進(jìn)展或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)δ切┘膊』蛭蓙y的治療提供相關(guān)信息。
這種方法最好包括對從來源于患有疾病或紊亂或在接受治療的對象的樣品的因子XIIa測試結(jié)果與同樣方法測定的至少任何一種或幾種源于如下對象的樣品的因子XIIa測試結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有這種疾病或紊亂的研究對象；(ii)患有這種疾病或紊亂的研究對象，對其這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果進(jìn)行了監(jiān)測；(iii)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象；(iv)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象，該研究對象針對這種疾病或紊亂的治療過程或結(jié)果被監(jiān)測；(v)未患這種疾病或紊亂的研究對象；(vi)同一研究對象在這種疾病或紊亂發(fā)作之前或在對這種疾病或紊亂治療開始之前，以及(vii)同一研究對象在這種疾病或紊亂早期或晚期，或在這種對疾病或紊亂治療的早期或晚期，或這種在疾病或紊亂開始之前。


圖1顯示的是關(guān)于在體內(nèi)存在的不同形式的因子XIIa的假說的圖示。
圖2a到2d顯示的是用熒光檢測的HPLC示蹤2a，血漿樣品；2b，F(xiàn)ITC標(biāo)記的2/215抗體；2c，與FITC標(biāo)記的2/215抗體孵育的血漿；2d，從2c示蹤中減去2a和2b示蹤得到的示蹤結(jié)果。
圖3顯示的是用HPLC分離的與同位素標(biāo)記2/215 Fab片段孵育的血漿各組分的放射性。峰1到峰5是單克隆抗體2/215 Fab片段與血漿組分結(jié)合的結(jié)果，峰6是剩余的未結(jié)合的克隆抗體2/215 Fab片段。
圖4a和4b顯示的是源于三種不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和洗滌后的細(xì)胞對因子XIIa免疫測試的標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)。在一微量滴定板上進(jìn)行的免疫測試，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的多克隆抗體(多克隆抗體偶聯(lián)物)(圖4a中的菱形，4b中的帶點條形)和標(biāo)記的單克隆抗體2/215(2/215偶聯(lián)物)(圖4a中的正方形，4b中的黑色條形)來檢測細(xì)胞的因子XIIa。
圖5顯示的是用Abbott Laboratories公司的IMx system系統(tǒng)來檢測細(xì)胞的因子XIIa的免疫測試的操作流程。
圖6a和圖6b顯示的是三個不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和細(xì)胞懸液對因子XIIa免疫測試的反應(yīng)。在一微量滴定板上進(jìn)行免疫測試，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的多克隆抗體(多克隆抗體偶聯(lián)物)(圖6a中的菱形，6b中的帶點條形)和標(biāo)記的單克隆抗體2/215(2/215偶聯(lián)物)(圖6a中的正方形，6b中的黑色條形)來檢測細(xì)胞的因子XIIa。
圖7a和圖7b顯示的是三個不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和細(xì)胞懸液對因子XIIa免疫測試的反應(yīng)。用IMx因子XIIa免疫測試系統(tǒng)，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9(201/9偶聯(lián)物)(圖7a中的菱形，7b中的帶點條形)和標(biāo)記的單克隆抗體2/215(2/215偶聯(lián)物)(圖7a中的正方形，7b中的黑色條形)來檢測細(xì)胞的因子XIIa。
圖8a和圖8b顯示的是FITC標(biāo)記的2/215單克隆抗體與血漿孵育后的的流式細(xì)胞計數(shù)結(jié)果。圖8a顯示的是無標(biāo)記抗體的血漿的結(jié)果，圖8b顯示的是與標(biāo)記抗體孵育的血漿的結(jié)果。分布的遷移表明標(biāo)記的2/215抗體與血漿細(xì)胞組分結(jié)合。
圖9顯示的是用添加放射性標(biāo)記的2/215單克隆抗體測定的8個個體的血漿細(xì)胞的因子XIIa。
圖10a和圖10b顯示的是源于一個因子XIIa“完全缺失”的個體的三種不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和細(xì)胞懸液對因子XIIa免疫測試的反應(yīng)。用IMx因子XIIa免疫測試系統(tǒng)，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9(圖10a中的菱形，10b中的帶點條形)和2/215(圖10a中的正方形，10b中的黑色條形)作偶聯(lián)物。
圖11a和11b顯示的是源于一個因子XIIa“完全缺失”的個體的三種不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和細(xì)胞懸液對因子XIIa免疫測試的標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)。用IMx因子XIIa免疫測試系統(tǒng)，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9(圖11a中的菱形，11b中的帶點條形)和2/215(圖11a中的正方形，11b中的黑色條形)作偶聯(lián)物。
圖12a和12b顯示的是分別源于一個正常志愿者和一個因子XIIa“完全缺失”的個體的三種不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和細(xì)胞懸液對因子XIIa免疫測試的標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)。因子XIIa的分析在IMx分析儀上進(jìn)行，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體2/215作偶聯(lián)物。(圖12a中的菱形和12b中的帶點條形表示源于正常個體的樣品；圖12a中的正方形和12b中的黑色條形表示源于因子XIIa“完全缺失”的個體的樣品。)圖13a和13b顯示的是分別源于一個正常志愿者和一個因子XIIa“完全缺失”的個體的三種不同樣品，即細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞稀少血漿和細(xì)胞懸液對因子XIIa免疫測試的歸一化的反應(yīng)。因子XIIa的免疫分析在IMx分析儀上進(jìn)行，用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物。(圖13a中的菱形和13b中的帶點條形表示源于正常個體的樣品；圖13a中的正方形和13b中的黑色條形表示源于因子XIIa“完全缺失”的個體的樣品。)圖14顯示的是從12個健康志愿者中得到的脂肪結(jié)合的因子XIIa的濃度。測試方法是通過添加放射性標(biāo)記的2/215抗體片段于檸檬酸鹽處理的血漿，去除細(xì)胞成分，用錳/肝素沉淀法沉淀脂蛋白，再測試沉淀組分中的放射性。
圖15顯示的是從64個因為胸部疼痛而住院的病人中得到的脂肪結(jié)合的因子XIIa的濃度。測試方法是先去除細(xì)胞成分，添加放射性標(biāo)記的2/215抗體片段于全血，用磷鎢酸鹽沉淀法沉淀脂蛋白，再測試沉淀組分中的放射性。
圖16顯示的是用ELISA方法測定8個志愿者的脂肪結(jié)合的因子XIIa的濃度(以550nm處吸光值表示)。
圖17a到17d顯示的是用熒光檢測的HPLC示蹤17a，尿液樣品；17b，F(xiàn)ITC標(biāo)記的2/215單克隆抗體；17c，與FITC標(biāo)記的2/215抗體孵育的尿液；17d，從17c示蹤中減去17a和17b示蹤得到的示蹤結(jié)果。
圖18顯示的是經(jīng)HPLC分離的與放射性標(biāo)記的2/215單克隆抗體片段孵育的尿液組分的放射性。峰1是2/215單克隆抗體與尿液因子XIIa結(jié)合的結(jié)果，峰2是剩余的未結(jié)合的2/215單克隆抗體片段。
圖19顯示的是用兩種不同的免疫測試方法測定的經(jīng)皮冠狀動脈血管成形術(shù)(PTCA)病人術(shù)前、術(shù)后和術(shù)后5天所取血漿樣品中因子XIIa濃度值的典型模式。測試1是包含有樣品孵育步驟的免疫測試。它用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中添加三硝基甲苯((Triton))。測試2用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用抗因子XII的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯((Triton))。菱形代表的數(shù)值表示從測試1得到的結(jié)果；正方形代表的數(shù)值表示從測試2得到的結(jié)果。
圖20顯示的是測定的從4個病人(病人S0216、S0794、S0811、S0909)在經(jīng)皮冠狀動脈血管成形術(shù)(PTCA)術(shù)前、術(shù)后和術(shù)后5天所取血漿樣品中因子XIIa濃度值。因子XIIa由一個有樣品孵育步驟的免疫測試法測定。用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的抗因子XII的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯((Triton))。帶點條形表示PTCA術(shù)前的值，陰影條形表示PTCA術(shù)后的值，黑色條形表示PTCA術(shù)后5天的值。
圖21顯示的是經(jīng)溶栓治療前、治療后以及治療后5天的病人樣品中的因子XIIa濃度。測試1包含樣品孵育步驟。它用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中添加三硝基甲苯((Triton))。測試2用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用抗因子XII的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯((Triton))。菱形代表的數(shù)值表示從測試1得到的結(jié)果；正方形代表的數(shù)值表示從測試2得到的結(jié)果。所得結(jié)果是從一個個體得到數(shù)值的典型模式。
圖22顯示的是測定的從3個病人(病人S0684、S0685、S0693)在經(jīng)溶栓治療前、治療后以及治療后5天的樣品中的因子XIIa濃度。因子XIIa由一個有樣品孵育步驟的免疫測試法測定。用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的抗因子XII的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯((Triton))。帶點條形表示PTCA術(shù)前的值，陰影條形表示PTCA術(shù)后的值，黑色條形表示PTCA術(shù)后5天的值。
圖23顯示的是被懷疑患有心肌梗塞或急性冠狀動脈綜合癥的住院病人住院期間內(nèi)重復(fù)肌鈣蛋白陽性的頻率。重復(fù)肌鈣蛋白陽性的頻率按因子XIIa的濃度分組。因子XIIa由一個含樣品孵育步驟的免疫測試法測定。用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用堿性磷酸酶標(biāo)記的同一抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中要加三硝基甲苯((Triton))。
圖24顯示的是用一些選擇性測試不同形式因子XIIa的測試法測定的圖23中病人的從一開始的住院期間內(nèi)重復(fù)肌鈣蛋白陽性的頻率。這表明特定形式的因子XIIa具有臨床用途而其他的形式則沒有。采用含有樣品孵育步驟的免疫測試法。方法a選擇性測定的因子XIIa形式用帶點的淺色條形代表。方法a用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以15μg/ml的重碳酸鹽緩沖液包被)，用堿性磷酸酶標(biāo)記的同一抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中要加三硝基甲苯((Triton))(如圖23)。方法b選擇性測定的因子XIIa形式用黑色條形代表。方法b用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以2μg/ml的磷酸鹽緩沖液包被)，用堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)。方法c選擇性測定的因子XIIa形式用帶對角線的淺色條形代表。方法c用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以2μg/ml的磷酸鹽緩沖液包被)，用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗因子βXIIa的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)。
圖25顯示的是圖23中的病人在住院30天內(nèi)繼發(fā)肌鈣蛋白陽性的頻率。重復(fù)肌鈣蛋白陽性的頻率按因子XIIa濃度分組。因子XIIa由一個有樣品孵育步驟的免疫測試法測定。用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中要加三硝基甲苯(Triton)。黑色條形表示非致命肌鈣蛋白陽性事件，帶對角線的淺色條形表示致命性的肌鈣蛋白陽性事件。
圖26顯示的是用一些可以選擇性測試不同形式因子XIIa的方法測定的圖25中病人住院30天內(nèi)繼發(fā)肌鈣蛋白陽性的頻率。這表明特定形式的因子XIIa具有臨床用途而其他的形式則沒有。方法x選擇性測定的形式的因子XIIa用帶點的淺色條形代表。方法x用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以2μg/ml的磷酸鹽緩沖液包被)，用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗因子βXIIa的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)。方法y選擇性測定的形式的因子XIIa用黑色條形代表。方法y用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以2μg/ml的磷酸鹽緩沖液包被)，用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗因子XIIa的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)。方法z選擇性測定的因子XIIa形式用帶對角線的淺色條形代表。方法z用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以15μg/ml的重碳酸鹽緩沖液包被)，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中要加三硝基甲苯(Triton)(如圖25所示的數(shù)值)。
圖27顯示的是對圖23和25中的病人作為治療終點的死亡頻率。死亡頻率按因子XIIa濃度分組。因子XIIa由一個含有樣品孵育步驟的免疫測試法測定。用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用抗因子XII的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)。黑色條形表示沒有第二次肌鈣蛋白陽性記錄的心肌死亡，含對角線的淺色條形表示有第二次肌鈣蛋白釋放陽性的死亡。
圖28顯示的是用兩種選擇性測試不同形式因子XIIa的測試法測定的圖27中病人的作為治療終點的死亡頻率。這表明特定形式的因子XIIa具有臨床用途而其他的形式則沒有。方法i選擇性測定的形式的因子XIIa用帶點的淺色條形代表。方法i用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以2μg/ml的磷酸緩沖液包被)，用堿性磷酸酶標(biāo)記的同一抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)。方法ii選擇性測定的形式的因子XIIa用黑條形代表。方法ii用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體(以2μg/ml的磷酸緩沖液包被)，用抗因子XII的多克隆抗體作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中不加三硝基甲苯(Triton)(如圖27所示的數(shù)值)。
圖29顯示的是被懷疑患心肌梗塞病人最初6個月的住院期內(nèi)發(fā)生重復(fù)非致命心肌梗塞(肌鈣蛋白陽性)的頻率。重復(fù)發(fā)作的頻率按脂結(jié)合的因子XIIa的濃度分組。淺色條形表示非致命的心肌梗塞，黑色條形表示心臟死亡。
圖30顯示的是用放射性標(biāo)記抗體孵育和HPLC分析測定的5個健康志愿者和5個腎病患者的尿液中因子βXIIa的濃度。
圖31顯示的是微量滴定板微量滴定板免疫測試的吸光值表示的5個健康志愿者和5個腎病患者的尿液中因子βXIIa的濃度。因子XIIa由一個有樣品孵育步驟的免疫測試法測定。用單克隆抗體2/215作為捕獲抗體，用標(biāo)記的單克隆抗體201/9作偶聯(lián)物，在樣品孵育步驟中要加三硝基甲苯(Triton)。
術(shù)語定義抗體，包括任何能與抗原結(jié)合的抗體片段，如Fab片段，F(xiàn)(ab’)2片段，以及重組、嵌合和人源化抗體。
抗體偶聯(lián)物，也稱檢測抗體，表示標(biāo)記了可以直接或間接用于分析的標(biāo)記物的抗體。
捕獲抗體表示用于免疫檢測的固定于固相的抗體。
捕獲測試是一種固定于固相的捕獲抗體與樣品接觸的免疫測試。如果樣品中含有能與固相的抗體結(jié)合的抗原且反應(yīng)條件恰當(dāng)，抗原會與固相的抗體形成抗原抗體復(fù)合物從而被捕獲于固相，從而能被檢測和測定。
細(xì)胞，如未特別作其他標(biāo)注，表示完整細(xì)胞、細(xì)胞殘留物和細(xì)胞組成物。
細(xì)胞性因子XIIa和細(xì)胞性因子XII分別指存在于細(xì)胞表面、與細(xì)胞、細(xì)胞殘留物和細(xì)胞組成物結(jié)合的因子XIIa和因子XII。
檢測指定性分析測試和(或)測定指定量或半定量分析。
因子XIIa，也叫活化的因子XII，表示任何有酶活性的酶原因子XII的形式或片段。
高親和性結(jié)合伴侶，表示一種可與因子XIIa形成復(fù)合物的分子，該分子與因子XIIa的結(jié)合不會因添加去垢劑或與另一種分子競爭等簡單方法而解離。
脂結(jié)合因子XIIa，表示與脂類物質(zhì)連接的因子XIIa，如，與脂肪尤其是脂蛋白及其殘留物的連接。
低親和性結(jié)合伴侶，表示一種與因子XIIa形成復(fù)合物的分子，該分子與因子XIIa的結(jié)合會因添加去垢劑或與另一種分子競爭等簡單方法而解離。
單克隆抗體(mAb)2/215，也叫抗體2/215，是雜交瘤細(xì)胞株2/215產(chǎn)生的抗體，雜交瘤細(xì)胞株2/215于1990年1月16日以存放號90011606存放于ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心，生物制品部，PHLS Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury SP4 OJG，England)。
單克隆抗體2/215類似物，表示與因子XIIa結(jié)合的特性與抗體2/215大致相同的抗體。
單克隆抗體201/9，也叫抗體201/9，是雜交瘤細(xì)胞株201/9產(chǎn)生的抗體，雜交瘤細(xì)胞株201/9于1990年1月18日以存放號90012512存放于ECACC。
單克隆抗體201/9類似物，表示與因子XIIa結(jié)合的特性與抗體2/215大致相同的抗體。
含細(xì)胞的樣品，指含有細(xì)胞的體液樣品和含有分離的細(xì)胞的樣品。
種類和形式，在指代因子XIIa的相關(guān)種類和形式時可以互換。μg和μl分別指微克和微升。
尿液因子XIIa，指尿液中的因子XIIa。
具體實施例方式
因子XIIa的形式本發(fā)明基于我們的一個驚人的發(fā)現(xiàn)，即因子XIIa(活化的因子XII)在血液中以多種形式(或種類)存在，而且不同種類或形式的測定結(jié)果能為不同臨床診斷治療提供相關(guān)信息。
不限于以下所述，我們關(guān)于在體內(nèi)因子XIIa以多種形式存在的假設(shè)如下，因子XIIa形式的變化可以指如下任何一種情況(i)因子XIIa在分子量和肽鏈長度方面的變化，這些變體包括αXIIa、βXIIa和γXIIa；(ii)兩個或多個因子XIIa或如(i)所述因子XIIa變體的復(fù)合體，例如在體液中不與細(xì)胞物質(zhì)或脂類物質(zhì)結(jié)合的因子XIIa分子；(iii)與細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)胞和細(xì)胞殘留物、脂類尤其是脂蛋白及其殘留物結(jié)合的因子XIIa或如(i)所述的因子XIIa變體；(iv)因子XIIa或如(i)所述因子XIIa變體與其他分子形成的復(fù)合物，如高親和性結(jié)合的蛋白質(zhì)如抑制分子，或低親和性結(jié)合的蛋白。
我們假設(shè)對某一特定的疾病情況并非所有因子XIIa的形式都能提供相同等量的信息，因此優(yōu)先測定某一種形式的因子XIIa更有利于臨床使用，如這種測定方法能與一種或幾種疾病或紊亂的診斷、預(yù)測、檢測及其治療聯(lián)系起來。
我們的假設(shè)如圖1所示。因子XIIa形式的變化反映了酶原因子XII經(jīng)逐步切割導(dǎo)致分子量和肽鏈序列變化。因子XII經(jīng)切割產(chǎn)生一個80Kd的有活性的絲氨酸蛋白酶，叫做因子αXIIa，圖1中以“αXIIa”表示，由一個二硫鍵連接的52Kd重鏈和28Kd輕鏈組成。這種形式的因子經(jīng)蛋白酶解從重鏈釋放出一個肽段得到的產(chǎn)物叫做因子βXIIa，圖1以“βXIIa”表示，它保留了絲氨酸蛋白酶活性，由αXIIa的28Kd鏈以一個二硫鍵與源于αXIIa的52Kd鏈的一個小肽段連接而形成。因子βXIIa可以經(jīng)進(jìn)一步蛋白酶解得到一個分子量約為15Kd的片段，我們稱之為因子γXIIa，圖1以“γXIIa”表示。
因子XIIa的任何形式的變體如αXIIa、βXIIa和γXIIa都有可能與其它分子聯(lián)合，包括高親和性結(jié)合伴侶如1酯酶抑制劑，和其它結(jié)合蛋白如低親和性結(jié)合伴侶。據(jù)推測因子XIIa與其他蛋白如低親和性蛋白的結(jié)合是可逆的，它與抑制蛋白的結(jié)合也是可以阻止的，從而可以減少或排除對因子XIIa活性的抑制。
因子XIIa的任何形式的變體如αXIIa、βXIIa和γXIIa都有可能與脂質(zhì)物如脂蛋白，可以是脂蛋白顆粒和(或)其殘留物，結(jié)合或解離。因子XIIa的任何形式的變體如αXIIa、βXIIa和γXIIa都有可能與細(xì)胞或細(xì)胞碎片結(jié)合或解離。特別是在因子XIIa與細(xì)胞、細(xì)胞碎片、脂蛋白和脂蛋白殘留物結(jié)合時，某一顆粒的表面可以結(jié)合多個某種形式的因子XIIa。并且，幾個相同或不同形式的因子XIIa分子可能以復(fù)合物形式存在。為表達(dá)清晰起見，這些復(fù)合物沒有在圖1中標(biāo)示出。
圖1顯示了對不同形式的因子XIIa的互相轉(zhuǎn)變的推斷。為表達(dá)清晰起見，因子βXIIa和γXIIa與細(xì)胞及其殘留物和脂蛋白及其殘留物的相互作用沒有標(biāo)示到圖1中。
此處假設(shè)圖1所示的系統(tǒng)是一個動態(tài)的體系。并且假設(shè)不同形式的因子XIIa在不同的病理和生理狀態(tài)下起不同的作用。與測定其他未知的形式的因子XIIa相比，選擇性地測定某一特定形式的因子XIIa有助于對疾病和紊亂及其治療的診斷、預(yù)測和監(jiān)測提供臨床用途。細(xì)胞性因子XIIa許多作者認(rèn)為因子XII活化為因子XIIa可以發(fā)生在細(xì)胞表面，并且有數(shù)據(jù)證明。尤其是，一些作者認(rèn)為因子XII的活化發(fā)生在細(xì)胞上尤其是內(nèi)皮細(xì)胞上，可以通過構(gòu)建同時包含高分子量的激肽原、激肽釋放酶前體和因子XI的多分子聚集體達(dá)到。Yarovaya等(loc.cit.)研究的模型表明激活后的因子XIIa會從多分子體聚集解離，不再保留于細(xì)胞表面。本發(fā)明基于我們驚人的發(fā)現(xiàn)，即因子XIIa以多種形式存在，其中一種形式的因子XIIa存在于在血液中循環(huán)的細(xì)胞表面以及來源于細(xì)胞的殘留物和細(xì)胞組成物質(zhì)的表面。這種形式的因子XIIa被稱為“細(xì)胞性因子XIIa”。這一發(fā)現(xiàn)與上述前人的發(fā)現(xiàn)，即在細(xì)胞表面多分子聚集體內(nèi)活化的因子XIIa將從這些多分子聚集體解離而不再存在于細(xì)胞表面的結(jié)論相反。
另一個發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)因子XIIa為細(xì)胞性因子時并非其所有抗原表位都可用，這與非細(xì)胞性因子XIIa不同。例如單克隆抗體2/215可以與細(xì)胞性和非細(xì)胞性的因子XIIa有效結(jié)合，而單克隆抗體201/9和一個源于綿羊的抗βXIIa的多克隆抗體似乎并不能象結(jié)合非細(xì)胞性因子XIIa一樣有效結(jié)合細(xì)胞性因子XIIa。
在血液中，因子XIIa似乎專一地存在于粒細(xì)胞上，尤其是一類在流式細(xì)胞實驗中較其他粒細(xì)胞表現(xiàn)出稍高分散性(表明它們與其他亞群具有不同形態(tài))的粒細(xì)胞上。這些發(fā)現(xiàn)具有臨床參考意義，見下文。
脂結(jié)合因子XIIa我們的驚人發(fā)現(xiàn)因子XIIa以多種形式存在的另一方面是因子XIIa與脂質(zhì)物結(jié)合，如血液中的脂蛋白及其殘留物，而且為這類脂結(jié)合因子XIIa的測定能對多種臨床情況提供相關(guān)信息。
尿液因子XIIa我們的驚人發(fā)現(xiàn)因子XIIa以多種形式存在的另一方面是因子XIIa存在于尿液，而且對這類尿液因子XIIa的測定能對多種臨床情況提供相關(guān)信息。
分子復(fù)合體及因子XIIa與其他分子種類的聯(lián)合體我們的發(fā)現(xiàn)表明兩個到幾個因子XIIa自身或因子XIIa與一到幾種其他種類的分子可以聯(lián)合在一起形成復(fù)合體。例如與高親和性結(jié)合蛋白如抑制劑分子或低親和性結(jié)合蛋白結(jié)合。免疫測試時加與不加去垢劑(這會打斷因子XIIa分子自身復(fù)合體和低親和性結(jié)合伴侶的結(jié)合，但不能打斷它與高親和性結(jié)合伴侶的結(jié)合)的結(jié)果也表明因子XIIa存在自身分子復(fù)合體和與其他結(jié)合伴侶的聯(lián)合體。
不同形式因子XIIa的檢測和測定本發(fā)明提供了從一個樣品中檢測或測定一或數(shù)種因子XIIa的方法，包括一個可以將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被檢測或測定的過程。
在一個實施例中，本發(fā)明的一個方法能通過一種測試將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被檢測或測定。
在另一個實施例中，本發(fā)明的一個方法能將所研究的因子XIIa形式從其他形式分離出來，并檢測或測定所分離的因子XIIa。
檢測或測定所分離的因子XIIa可以用一種能將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被檢測或測定的方法。
在另一個實施例中，本發(fā)明的一個方法包括將樣品用一個能與所研究的因子XIIa或者可選擇地，也能與其他形式的因子XIIa結(jié)合的標(biāo)記抗體接觸，使所研究的因子XIIa從其他形式的因子XIIa中分離，并檢測或測定所研究的因子XIIa。
因此根據(jù)本發(fā)明，可以首先將所研究的因子XIIa與其他形式的因子XIIa分離，再進(jìn)行測定?？梢杂靡粋€測試因子XIIa的通用方法，即不特別針對某種形式的方法；但用一種可以將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被測定的方法可能更有利。下面將給出這樣的例子。這種方法可以用于檢測或測定如細(xì)胞性因子XIIa、因子XIIa自身復(fù)合物和因子XIIa與其他分子的結(jié)合物。
可選擇地，一個能將所研究的因子XIIa形式優(yōu)先于其他形式被測定的方法可以用于直接測定一個樣品而無需將不同形式的因子XIIa分離處來。下面將給出這樣的例子。這樣的測試可以在一個樣品上直接進(jìn)行。這種測試可以被用來檢測或測定因子XIIa自身復(fù)合物和因子XIIa與其他分子的結(jié)合物。
還可選擇地是，一個含有不同形式因子XIIa的樣品可以與一個標(biāo)記的抗體接觸，然后可以將所研究的一或多種形式的因子XIIa分離出來，再對其進(jìn)行檢測或測試。這樣的測試可以用來檢測或測試如脂結(jié)合的因子XIIa。
各種形式因子XIIa的分離各種形式的因子XIIa可以根據(jù)它們的物理、化學(xué)和免疫學(xué)特征而被分開。一般說來，進(jìn)行任何這樣的分離的條件應(yīng)當(dāng)是使所研究的各種因子XIIa的形式保持不變，如一般在這種條件任何復(fù)合物或分子聯(lián)合體不會被打斷，任何與其它物質(zhì)如細(xì)胞性物質(zhì)或脂質(zhì)物結(jié)合的因子XIIa不會被釋放出來。然而在某些情況下更希望能將因子XIIa從聯(lián)合體或其它結(jié)合物上釋放。
基于物理性質(zhì)的分離不同形式的因子XIIa可以根據(jù)分子量的不同被分離，如用層析的方法如高壓液相層析(HPLC)，流式細(xì)胞技術(shù)和超速離心技術(shù)分離，然后對所分離的物質(zhì)進(jìn)行測試。
測試可以通過幾種方法進(jìn)行，如對所分離的形式的因子XIIa進(jìn)行免疫測試，或酶學(xué)測試如用生色物質(zhì)如S203(Kabi Diagnostics，Uxbridge，England)。針對因子XIIa的抗體可以與HPLC連用，如用標(biāo)記的抗體與樣品反應(yīng)，得到的混合物再經(jīng)HPLC分離。然后抗體與特定形式的因子XIIa的復(fù)合物可以通過針對標(biāo)記抗體的標(biāo)記物的合適的系統(tǒng)來測定。根據(jù)物理性質(zhì)分離因子XIIa自身復(fù)合物或因子XIIa與其他結(jié)合伴侶形成的聯(lián)合體這種方法，隨同其他的技術(shù)一起，對從其他形式的因子XIIa中分離由兩到多個因子XIIa組成的復(fù)合物和分離與高親和性和低親和性伴侶結(jié)合的因子XIIa，可能是有用的。
通常優(yōu)先考慮采用那些因子XIIa復(fù)合物不會被打斷、因子XIIa不會與結(jié)合伴侶解離的條件的分離。例如，通常應(yīng)選擇避免使用去垢劑，因為這會打斷復(fù)合體和一些分子聯(lián)合體。然而，在一些情況下可能希望這些打斷發(fā)生。例如，當(dāng)希望將因子XIIa從低親和性結(jié)合伴侶釋放，或?qū)⑴c低親和性伴侶結(jié)合的因子XIIa與同高親和性伴侶結(jié)合的因子XIIa分離時，恰當(dāng)?shù)臈l件如添加去垢劑就可以使用，以達(dá)到因子XIIa與低親和性伴侶分離而不與高親和性伴侶分離。
根據(jù)物理或化學(xué)性質(zhì)分離細(xì)胞性因子XIIa和脂類結(jié)合的因子XIIa可以通過物理或化學(xué)方法或結(jié)合兩種方法將細(xì)胞性和脂類結(jié)合因子XIIa從其他形式的因子XIIa分離出來。例如，細(xì)胞性因子XIIa可以通過離心或流式細(xì)胞技術(shù)分離。脂結(jié)合因子XIIa可以通過如脂蛋白沉淀試劑和離心，或密度梯度超速離心進(jìn)行分離。
通常優(yōu)選采用那些因子XIIa不會從細(xì)胞性物質(zhì)或脂類解離的條件進(jìn)行分離。例如，通常應(yīng)避免選擇使用去垢劑。然而，在一些情況下可能希望這些打斷發(fā)生。如果希望將因子XIIa從與其結(jié)合的物質(zhì)釋放，可以使用適當(dāng)?shù)臈l件。
免疫學(xué)分離可以采用免疫學(xué)方法通過能優(yōu)先結(jié)合這種或這些形式的因子XIIa的抗體將所研究的一到數(shù)種形式的因子XIIa與其他形式的因子XIIa分離。例如，可以將抗體固定在合適的固相支持物，用免疫親和層析的方法分離。層析過后結(jié)合或未結(jié)合的部分都可以進(jìn)行酶活性測定。這些用途所選用的抗體見如下免疫測試實驗相關(guān)描述。
如上基于物理或化學(xué)性質(zhì)分離的相關(guān)描述，免疫親和層析分離所用條件通常應(yīng)當(dāng)是因子XIIa的形式能保持不變，如復(fù)合物和聯(lián)合體不會被打斷，結(jié)合的分子不會被釋放。然而，可能也有希望打斷的情況，若此，可以選用恰當(dāng)?shù)臈l件。
測試方法適應(yīng)性的判定已知測定因子XIIa的方法包括生色法如酰胺分解實驗和如下面詳細(xì)描述的各種免疫測試。
如果測試開始前所研究的因子XIIa形式已經(jīng)從其他分子形式分離，可以用一個不分辨不同種類因子XIIa的測試方法如一個“通用”的因子XIIa測試法。然而即便是在分離步驟后進(jìn)行的測試，用一個能夠從其他形式因子XIIa中選擇性檢測或測定所研究一種或幾種形式的因子XIIa可能更有利。
如果沒有分離的步驟，所用測試法必須能夠檢測或測定所研究的因子XIIa。可以先驗證一下一個已知適合用來檢測或測定因子XIIa的方法能否從一個樣品中檢測或測試所希望的因子XIIa形式。
例如，對已知的一個包括細(xì)胞性因子XIIa的樣品用所選的測試方法和一個已知適合于檢測細(xì)胞性因子XIIa的方法同時測定并比較二者得到的結(jié)果。單克隆抗體2/215可以有效結(jié)合細(xì)胞性因子XIIa。一個包括單克隆抗體2/215或其類似物的免疫測試法可以用作對比測試。相同的策略也適用于對其他形式的因子XIIa的測試。
一個選擇是用所研究的方法對已知包括所要的形式如細(xì)胞性的因子XIIa的樣品的一部分進(jìn)行測試。在這種情況下，樣品不能包括非細(xì)胞性因子XIIa。該樣品的另一部分經(jīng)過處理使因子XIIa從細(xì)胞釋放，收集處理后的細(xì)胞并重復(fù)實驗然后比較兩次實驗得到的結(jié)果。如果測試原含有細(xì)胞性因子XIIa的部分樣品得到的結(jié)果高于測試處理去除細(xì)胞性因子XIIa的部分樣品，則表明此法適合于檢測或測定細(xì)胞性因子XIIa。這樣相同的策略也適用于對其他形式的因子XIIa的測試。
對一或幾種形式的因子XIIa的專一性的測試對一或幾種形式的因子XIIa相對于其他形式的因子XIIa的專一性的測試可以通過對測試方法的合理設(shè)計來達(dá)到或改進(jìn)。該測試法的各項參數(shù)應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)到使所研究的形式的因子XIIa能優(yōu)先于其他形式的因子XIIa被檢測或測定。
對測試方法的這種優(yōu)化在行內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)做法，適用的技術(shù)也很多，例如參考書Principlesand Practice of Immunoassays，Eds.Price CP & Newman DJ，Stockton Press，1991。
對于免疫測試的情況，為達(dá)到所需專一性可以調(diào)節(jié)的參數(shù)包括對所用抗體或抗體組合的一到數(shù)種選擇；對去垢劑加、不加或所加種類的選擇；在涉及將一抗體包被到固相的抗原捕獲測試時包被條件的選擇。
例如，在進(jìn)行微量滴定板免疫測試時有許多參數(shù)可以改變以達(dá)到優(yōu)先于其他形式測定某些形式的因子XIIa。
一個例子是捕獲抗體的選擇，比如可以用單克隆抗體2/215，或用單克隆抗體201/9或2/15，它們可以選擇性地檢測不同形式的因子XIIa。
將捕獲抗體包被到固相所用包被液的配方也影響對不同形式因子XIIa測定的選擇性，例如，配方中抗體的濃度、pH值以及緩沖液的組分都很重要。
另一個影響此類因子XIIa能否被優(yōu)先測定的參數(shù)是在樣品與抗體孵育時加或不加去垢劑，如(Triton)。此處推測加去垢劑可能打斷復(fù)合物如因子XIIa分子之間形成的復(fù)合物，可能將先前結(jié)合于細(xì)胞或脂質(zhì)的因子XIIa釋放。所加去垢劑的性質(zhì)或量也可能影響測試。
另一個可以改變以影響選擇性測試某些特定因子XIIa形式的參數(shù)是用來檢測抗原抗體復(fù)合物的被標(biāo)記形成偶聯(lián)物的抗體的選擇。
應(yīng)當(dāng)注意的是測試方法的參數(shù)之間有復(fù)雜的相互作用，例如一個測試中添加去垢劑的效果取決于捕獲抗體組合、包被抗體濃度、包被緩沖液和所使用的抗體偶聯(lián)物。檢測或測定所希望的因子XIIa的條件的適合性可以根據(jù)行內(nèi)的一般實踐通過對不同參數(shù)的適當(dāng)調(diào)整來確定。
樣品和樣品制備樣品對不同形式的因子XIIa的測定所用樣品，可以用體液樣品如全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液和淚液；也可用從體液中分離的細(xì)胞樣品，即細(xì)胞基本上游離于其在體內(nèi)時賴以存在的液體相；也可用包含來自于組織樣品的細(xì)胞和組織的樣品。
樣品制備樣品可以用常用方法獲得和制備，例如可參照如下參考文獻(xiàn)Young，D.S.& Bermes，E.W.“Specimen collection and processing”in Tiez Textbook of Clinical Chemistry 2ndEdition Eds.Burtis，C.A.& Ashwood，E.R.，Saunders(1994)；Methods in Enzymologhy，H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)，1981，72(B)；Practice and Theory of EnzymeImmunoassays，Ptijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，R.J.Burden and P.H.Van Knippenberg(Eds)，Elservier，1985；Introduction toRadioimmuoassay and Related Techniques，T.Chard，ibid，3rfEdition，1987；Methods inEnzymology，H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)1981，74(C).
體液根據(jù)本發(fā)明，一或多種形式的因子XIIa可以從體液樣品中檢測或測定。體液樣品的例子有全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液和淚液。體液樣品可以通過傳統(tǒng)的方式得到和制備，例如上面參考文獻(xiàn)描述的方法。
優(yōu)先于其他形式的因子XIIa對特定形式的XIIa進(jìn)行選擇性測定可以通過如下部分的測試達(dá)到。
細(xì)胞性因子XIIa在一個實施例中，本發(fā)明提供一種包括檢測或測定哺乳動物對象(通常是人)的血液或其他體液中循環(huán)的細(xì)胞組成樣品中的因子XIIa的方法。測定細(xì)胞性因子XIIa可以對體液樣品進(jìn)行，也可用測試前先從體液如全血或血漿中分離的細(xì)胞樣品，即基本沒有其體內(nèi)存在時的液相的分離細(xì)胞。也可用從組織樣品而來的細(xì)胞樣品。
如果所用方法既能檢測或測定細(xì)胞性因子XIIa，又能檢測或測定非細(xì)胞性因子XIIa，這樣對一個包含細(xì)胞的樣品測試時就既測了細(xì)胞性因子XIIa又測了非細(xì)胞性因子XIIa。然而，如果是用一個分離的細(xì)胞樣品進(jìn)行測試，結(jié)果就僅為細(xì)胞性因子的測試結(jié)果。名稱“包含細(xì)胞的樣品”此處既表示含細(xì)胞的體液也表示分離的細(xì)胞。
細(xì)胞，包括細(xì)胞殘留物和細(xì)胞組成物，可以用上述“分離不同形式的因子XIIa”的方法分離。例如，細(xì)胞可以用離心和洗脫分離。優(yōu)選細(xì)胞至少離心和洗滌一次，最好兩到多次。離心時的離心力通常應(yīng)當(dāng)高到足以使細(xì)胞形成一清晰的團(tuán)塊以使之能與上清液分離。細(xì)胞團(tuán)塊可以用不影響細(xì)胞性因子XIIa的合適的介質(zhì)洗滌，如不會使細(xì)胞性因子XIIa從細(xì)胞解離的介質(zhì)。比如pH7.4的磷酸緩沖液是可以用來洗滌和懸浮那些用來測試和(或)測定細(xì)胞性因子XIIa的緩沖液介質(zhì)。也可以用流式細(xì)胞技術(shù)分離細(xì)胞。
如果測試開始前細(xì)胞性因子XIIa已從其他形式的因子XIIa分離，就可以用一個不能區(qū)分細(xì)胞性和其他形式的因子XIIa的測試方法，即“通用”測試法來進(jìn)行測試。然而，即使測試前已經(jīng)分離了細(xì)胞，可能用一個相對于其他形式的因子XIIa能選擇性地檢測或測定細(xì)胞性因子XIIa的方法更有利。
如果沒有進(jìn)行分離步驟，所用方法應(yīng)當(dāng)能夠檢測或測定所研究的細(xì)胞性因子XIIa。針對因子XIIa的多種測試方法見下所述。
一個組織樣品中存在的細(xì)胞性因子XIIa可以用免疫組織學(xué)的技術(shù)檢測。例如，可以像如下所述，使用一個有恰當(dāng)標(biāo)記物如熒光標(biāo)記的單克隆抗體。
在一些情況下，可能測定的是因子XII而非因子XIIa。
脂結(jié)合因子XIIa本發(fā)明提供一種包括從組織樣品或特別是從哺乳動物尤其是人體獲得的體液樣品中檢測或測定脂結(jié)合因子XIIa的方法。
脂結(jié)合因子XIIa的測定可以用體液樣品如全血或血漿。可選擇的是，脂質(zhì)部分可以先從體液或組織分離，然后再測定脂質(zhì)部分因子XIIa的含量。脂質(zhì)部分的分離可以參照上邊“不同形式因子XIIa的分離”部分的描述進(jìn)行。例如，脂蛋白可以通過沉淀法從組織或體液如血漿分離。已知適于沉淀脂蛋白的試劑包括，如氯化鈉、氯化錳和肝素組成的試劑，磷鎢酸試劑。多種試劑和方法描述于參考文獻(xiàn)Demacker，P.N.M et al.Clinical Chemistry Vol.43，No.4，1997，p663-668；Sharma，A.et al.Clinical Chemistry，Vol.36，No.3，1990，p529-532。
一個樣品，如血漿，可以通過離心去除細(xì)胞組分。例如用像12000g到16000g的中到高速離心。脂蛋白可以通過脂蛋白沉淀試劑如含有氯化鈉、氯化錳和肝素的試劑沉淀，如約500mM氯化鈉，215mM氯化錳和500U/ml肝素，或者用磷鎢酸沉淀試劑如50mM磷鎢酸鹽和通常所用的氯化錳。
沉淀物可以通過離心分離。如需要，沉淀物可以重新懸浮于沉淀劑再分離。如需要，這種操作可以重復(fù)，如兩到三次。沉淀步驟之間可以進(jìn)行洗滌。
如果測試開始前脂蛋白結(jié)合因子XIIa已和其他形式的因子XIIa分離，就可以用一個不能區(qū)分不同形式的因子XIIa的測試方法，即“通用”測試法來進(jìn)行測試。然而，即便測試前已經(jīng)有了分離步驟，還是用能優(yōu)先于其他形式的因子XIIa進(jìn)行檢測或測定脂蛋白結(jié)合因子XIIa的方法更有利。
如果沒有進(jìn)行分離步驟，所用方法應(yīng)當(dāng)能夠檢測或測定脂蛋白結(jié)合因子XIIa。
在用免疫測試時，脂蛋白部分可以在樣品與一種抗體結(jié)合之前或之后分離出來?？赡芘c抗體結(jié)合之后再分離更有利。
因子XIIa自身分子復(fù)合物和因子XIIa與其他分子的聯(lián)合體一個測試所用的由因子XIIa自身分子復(fù)合物和因子XIIa與其他分子的聯(lián)合體組成的樣品，通常為體液，可以用如前所述的一般操作制備。
如需要，由兩到多個分子或兩到多種形式的因子XIIa組成的分子復(fù)合物與高親和性或低親和性結(jié)合伴侶聯(lián)結(jié)的因子XIIa可用如上“不同形式因子XIIa的分離”部分所述的方法在對因子XIIa測試之前進(jìn)行分離。例如，結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的αXIIa、結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的βXIIa，結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的βXIIa片段，結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的αXIIa，結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的βXIIa，結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的βXIIa片段，可以被分離。
如果由兩到多個分子或兩到多種形式的因子XIIa組成的分子復(fù)合物與高親和性或低親和性結(jié)合伴侶聯(lián)結(jié)的因子XIIa在測試之前已和其他形式的因子XIIa分離，就可以用一個不能區(qū)分這些形式與其他形式的因子XIIa的測試方法，即“通用”測試法來進(jìn)行測試。然而，即便測試前已經(jīng)有了分離步驟，還是用能優(yōu)先于其他形式的因子XIIa進(jìn)行檢測或測定脂蛋白結(jié)合因子XIIa的方法更有利。
如果沒有對所研究因子XIIa進(jìn)行分離步驟，可以用一個相對于其他形式的因子XIIa能優(yōu)先選擇性地檢測或測定所研究的因子XIIa的方法進(jìn)行測試。
合適的測試法，特別是免疫測試，見如下描述。
免疫測試根據(jù)本發(fā)明，可以用一種能優(yōu)先于其他形式的因子XIIa而選擇性地檢測或測定所研究的因子XIIa的免疫測試法進(jìn)行測試。根據(jù)本發(fā)明，任一相關(guān)樣品都能用一種免疫測試法測試。
通用免疫測試技術(shù)免疫測試的方法是廣為人知的。例如參考文獻(xiàn)Tiez Textbook of Clinical Chemistry2ndEdition Eds.Burtis，C.A.& Ashwood，E.R.，Saunders(1994)；Methods in Enzymologhy，H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)，1981，72(B)；Practice and Theory of EnzymeImmunoassays，Ptijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，R.J.Burden and P.H.Van Knippenberg(Eds)，Elservier，1985；Introduction toRadioimmuoassay and Related Techniques，T.Chard，ibid，3rfEdition，1987；Methods inEnzymology，H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)1981，74(C).
定量和定性的免疫測試技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)，蛋白質(zhì)印跡法，液相沉淀實驗，包被顆粒實驗，競爭實驗，夾心法測試包括正向、反向和同時進(jìn)行的夾心法實驗，和固相放射免疫測試(SPRIA)。
一種抗原抗體復(fù)合物可以直接檢測如用下面描述的技術(shù)或標(biāo)記抗體的方法。
雙抗體夾心法測試根據(jù)本發(fā)明，一種可以使用的ELISA的形式的例子是所謂“雙抗體夾心法測試”。該方法中，一種可以與一至多種形式因子XIIa結(jié)合的抗體，尤其是單克隆抗體，被固定在一種固相支持物上。例如塑料或其他的聚合材料，如微量滴定板的孔中，珠形物或顆粒物等，像在一些專利系統(tǒng)如IMx系統(tǒng)(Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois，USA.)所用。這一抗體稱為“捕獲抗體”。一種樣品與固定的捕獲抗體接觸孵育。任何能與固定的抗體結(jié)合的形式的因子XIIa將會被固定的抗體“捕獲”，從而使其自身也固定于固相。捕獲于固相的各形式的因子XIIa用能與其中一或多種形式的因子結(jié)合的標(biāo)記抗體檢測。這種標(biāo)記抗體常稱為抗體“偶聯(lián)物”。通過仔細(xì)選擇抗體和(或)其他測試條件，就可能優(yōu)化測試使其能優(yōu)先于其他形式而測量、檢測和/或測定一或多種特定形式的因子XIIa。
標(biāo)記抗體一種用來檢測和/或測定目標(biāo)抗原的標(biāo)記抗體可以是多克隆的或單克隆的。針對人體的抗體如針對人體的多克隆抗體，通常能方便地用作臨床使用的標(biāo)記抗體?？蛇x擇地，也可用能與所研究形式的因子XIIa結(jié)合的抗體。這樣的抗體可以結(jié)合像因子αXIIa重鏈、因子βXIIa或因子βXIIa的一個片段。
標(biāo)記物可以被直接檢測或間接檢測。任何合適的放射性同位素可以用作直接檢測標(biāo)記物，如β放射性同位素或γ放射性同位素，像125I，131I，3H和14C。商業(yè)用途中，優(yōu)先考慮非放射性標(biāo)記物，通常是酶標(biāo)記物。酶標(biāo)記物是間接檢測的。酶標(biāo)記物有堿性磷酸酶，過氧化物酶如辣根過氧化物酶。針對所選酶要用合適的底物，如能產(chǎn)生可檢測的光學(xué)或熒光變化的如酚酞一磷酸鹽或熒光底物，如4-甲基傘形酮酰磷酸鹽?？蛇x擇地，也可以用一種能用電化學(xué)方法顯示結(jié)果的酶學(xué)反應(yīng)。
一種標(biāo)記抗體可以用來檢測如ELISA中的抗原抗體復(fù)合物，或者也可以用來與抗原形成復(fù)合物，然后再檢測該復(fù)合物。檢測時可能用到流式細(xì)胞技術(shù)。
競爭實驗一或多種形式的標(biāo)記的因子XIIa，如放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記，可以用于競爭實驗中測量一或多種形式的因子XIIa。
因子XIIa的免疫測試因子XIIa免疫測試的一個例子見描述于專利WO90/08835中的捕獲測試。為優(yōu)先檢測或測定一到多種形式的因子XIIa，推薦使用單克隆抗體2/215或其類似物，特別是用作捕獲抗體。另一種不同的抗體如多抗或不同的單抗可以用作檢測或(和)測定所研究的因子XIIa，或者也可用同種抗體。選擇和(或)調(diào)整抗體和(或)測試條件可以做到相對于其他形式的因子XIIa優(yōu)先檢測和(或)測定某一或多種形式的因子XIIa。
其他免疫測試技術(shù)其他用來檢測或測定抗原的免疫測試方法用的是直接檢測所形成的抗原-抗體復(fù)合物。這樣的技術(shù)例如表面等離子體共振技術(shù)，表面聲波和石英晶體微量天平方法(Suzuki M，OzawaF，Sugimoto W，Aso S.Anal Bioanal Chem 372301-4，2002；Pearson JE，Kane JW，Petraki-Kallioti I，Gill A，Vadgama P.J Immunol Methods，22187-94，1998；WeischW，Klein C，von Schickfus M，Hunklinger S.Anal Chem 1996682000-4；Chou SF，HsuWL，Hwang JM，Chen CY.Clin Chem 48913-8，2002)。
如果一個標(biāo)記抗體與抗原形成了復(fù)合物，復(fù)合物可以通過流式細(xì)胞技術(shù)測試或測定。
標(biāo)準(zhǔn)和對照免疫測試通常用“標(biāo)準(zhǔn)物”作參考點。
一個檢測或檢測和/或測定一或多種形式因子XIIa的測試實驗的合適的標(biāo)準(zhǔn)物，典型的是由一種含有已知量的一或多種恰當(dāng)形式的因子XIIa的溶液組成?？蛇x擇地，標(biāo)準(zhǔn)物也可以是恰當(dāng)?shù)囊坏蕉喾N形式的結(jié)合于支持物如固相上的因子XIIa組成。
根據(jù)所用測試方法的不同，用作標(biāo)準(zhǔn)和對照的物質(zhì)可以采用不同的形式。在一些測試方案中，合適的物質(zhì)可以在水溶液中。因子XII或其片段，包括各種形式的因子XIIa。在其他方案中，如ELISA中當(dāng)同一抗體既作捕獲抗體又作檢測(偶聯(lián))抗體時，可能偏好制作能包含許多因子XII分子及其片段的載體，例如將因子βXIIa結(jié)合于珠形物表面，如直徑為3μM的聚碳酸脂珠。
一個檢測或檢測和/或測定脂蛋白結(jié)合的因子XIIa的測試實驗的合適的標(biāo)準(zhǔn)物，典型的是由一種含有已知量脂蛋白結(jié)合的因子XIIa的溶液組成?？蛇x擇地，標(biāo)準(zhǔn)物也可以是結(jié)合于非脂類支持物如固相上的因子XIIa組成，或者因子XIIa的水溶液也可用作標(biāo)準(zhǔn)。
一個檢測或檢測和(或)測定尿液因子XIIa的測試實驗的合適的標(biāo)準(zhǔn)物，典型的是由一種含有已知量因子XIIa的溶液組成。
免疫組織學(xué)存在于組織樣品中的一或多種形式的因子XIIa可用免疫組織學(xué)方法檢測。例如，用一個如上所述的標(biāo)有合適標(biāo)記物如可以是熒光標(biāo)記物的單克隆抗體。典型地，先用標(biāo)記抗體與組織樣品接觸孵育，然后用不會打斷所形成的抗原抗體復(fù)合物的條件洗脫孵育試劑，再檢測所形成的那些復(fù)合物。
生色實驗檢測或測定一或多種形式的因子XIIa可以通過用一種生色底物測量其酶活性而進(jìn)行，描述見參考文獻(xiàn)Vinazzer H.，Thromb Res.，14，155-156，1979。
這種測試可能包含一個將一或多種形式的因子XIIa和其他形式分離的步驟，見上文。對細(xì)胞性因子XIIa的免疫測試細(xì)胞可以從體液如血或血漿分離，例如通過離心和洗滌。洗滌時最好包括至少一次特別是一到多次的合適的介質(zhì)洗滌。洗滌的條件應(yīng)不影響細(xì)胞性因子XIIa，比如不會使細(xì)胞性因子XIIa從細(xì)胞解離。合適的液體一般為緩沖液，如pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)。
一個包含細(xì)胞的體液樣品可以被洗滌，即先高速離心再用合適液體懸浮得到“經(jīng)過洗滌的細(xì)胞”。一個高速離心的例子是16000g離心10分鐘。一種合適的洗滌和懸浮用液體是pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)?？梢赃M(jìn)行一或多輪，如兩或三或更多輪的離心。
細(xì)胞豐富血漿可以通過對血液低速離心得到，例如對檸檬酸鹽血1000g離心10分鐘。對所得細(xì)胞豐富血漿進(jìn)一步高速離心，如16000g離心10分鐘所得到的上清即稱為細(xì)胞貧瘠血漿。
用單克隆抗體2/215或其類似物同時作捕獲抗體和檢測抗體對細(xì)胞豐富血漿、細(xì)胞貧瘠血漿以及洗滌后的細(xì)胞樣品用雙抗體夾心法測試，結(jié)果是洗滌后細(xì)胞反應(yīng)最強(qiáng)，細(xì)胞貧瘠血漿反應(yīng)最弱。相反，當(dāng)用一個多克隆抗體作為檢測抗體，用單克隆抗體2/215或其類似物同時作捕獲抗體時，細(xì)胞豐富血漿和細(xì)胞貧瘠血漿有顯著的反應(yīng)而洗滌細(xì)胞只有微弱的反應(yīng)。進(jìn)一步的免疫測試和流式細(xì)胞實驗證實了這些結(jié)果。這些結(jié)果表明單克隆抗體2/215所結(jié)合的因子XIIa的抗原表位在它為細(xì)胞性因子時也可用，而當(dāng)因子XIIa存在于細(xì)胞表面時它的供單克隆抗體201/9結(jié)合的抗原表位則不大能用。
脂結(jié)合因子的XIIa的免疫測試一個免疫測試可以用單克隆抗體2/215或其類似物，或其片段如Fab片段，來進(jìn)行。在捕獲測試的情況下優(yōu)先考慮用單克隆抗體2/215或其類似物作捕獲抗體。一個不同的抗體如多克隆抗體或一個不同的單克隆抗體，或者相同的抗體可以用作檢測抗體。
可以用一個直接的免疫測試如放射免疫測試。在這種情況下優(yōu)先考慮用單克隆抗體2/215或其類似物，或其片段如Fab片段。合適的標(biāo)記物的例子上文已經(jīng)給出。
脂蛋白部分可以在樣品與一種抗體結(jié)合之前或之后分離出來?？赡芘c抗體結(jié)合之后再分離更有利。脂蛋白部分可以像上文“樣品制備”部分所述來分離。
作為免疫測試的另一種選擇，對脂蛋白結(jié)合因子XIIa的檢測和(或)測定可以通過用生色底物量度其酶活性的方法來進(jìn)行，見參考文獻(xiàn)Vinazzer H.，Thromb Res.，14，155-66，1979.這可能要一個將一到多種形式的因子從其他形式分離出來的步驟，如上文所述。對因子XIIa的分子復(fù)合物及其與其它種類分子的聯(lián)合體的免疫測試免疫測試可以用與其他形式分離的因子XIIa的復(fù)合物和因子XIIa與其他分子的聯(lián)合體樣品，也可以用未做這樣的分離的樣品。例如，如果希望，由兩到多種形式的因子XIIa組成的分子復(fù)合物或與高親和性或低親和性結(jié)合伴侶聯(lián)結(jié)的因子XIIa可用如上“不同形式因子XIIa的分離”部分所述的方法在對因子XIIa測試之前進(jìn)行分離。例如，結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的αXIIa、結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的βXIIa，結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的βXIIa片段，結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的αXIIa，結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的βXIIa，結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的βXIIa片段，可以被分離。
任何上文所述免疫測試法都可以用來測定因子XIIa的復(fù)合物和因子XIIa與其他分子的聯(lián)合體。如上所述，通常優(yōu)先考慮用單克隆抗體2/215或其類似物作為抗體特別是捕獲免疫測試中的捕獲抗體。用來檢測的標(biāo)記抗體應(yīng)當(dāng)能夠與被捕獲的形式的因子XIIa結(jié)合。例如，標(biāo)記抗體可以結(jié)合于因子αXIIa重鏈，因子βXIIa，或因子βXIIa的片段。
對尿液中因子XIIa的免疫測試和其他測試任何上文所述免疫測試法都可能相對于其他形式選擇性地測定尿液中的一到多種形式的因子XIIa。如上所述，通常優(yōu)先考慮用單克隆抗體2/215或其類似物作為抗體特別是捕獲免疫測試中的捕獲抗體。
試劑盒本發(fā)明還提供進(jìn)行本發(fā)明的免疫測試的試劑盒，所述試劑盒包括裝于單獨的容器中或分區(qū)放置的如下產(chǎn)品(i)一個可以結(jié)合一到多種形式的因子XIIa的單克隆抗體，如單克隆抗體2/215或其類似物或其他具有與單克隆抗體2/215或其類似物相同或相似的因子XIIa結(jié)合特性的單克隆抗體，和(ii)一個能與已經(jīng)結(jié)合上(i)中的單克隆抗體的一到多種形式的因子XIIa結(jié)合的標(biāo)記抗體。
試劑盒還可以包括進(jìn)行如上所述的免疫測試所需的其他組分。單克隆抗體可以固定于固相支持物上。
一個根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以包括，例如，a)一個可以結(jié)合一到多種形式的因子XIIa的單克隆抗體，如單克隆抗體2/215或其類似物或其他具有與單克隆抗體2/215或其類似物相同或相似的因子XIIa結(jié)合特性的單克隆抗體，b)一個標(biāo)準(zhǔn)物，典型的是由一種含有已知量的一或多種形式的因子XIIa溶液組成，c)一個能與已經(jīng)結(jié)合上(i)中的單克隆抗體的一到多種形式的因子XIIa結(jié)合的標(biāo)記抗體。
根據(jù)所用測試方法的不同，用作標(biāo)準(zhǔn)物和對照的材料可以有不同的形式。在一些測試方案中，合適的材料可以在水溶液中。因子XIIa及其片段，包括各種形式的因子XIIa。在其他方案中，比如在捕獲抗體和檢測抗體(偶聯(lián)物)為同一種抗體的ELISA測試中，可能更好的是制作能包含許多因子XII分子及其片段的載體，例如將因子βXIIa結(jié)合于珠形物表面，如直徑為3μM的聚碳酸脂珠。
更多的標(biāo)準(zhǔn)物的例子已在上文給出?？蛇x擇地，一個試劑盒也可包括標(biāo)記的各種形式的因子XIIa用來進(jìn)行競爭實驗。
一個試劑盒還可以包括更多的組成，例如分別裝于不同容器中的稀釋液、洗滌試劑液(wash reagent solutions)和底物溶液。
測試裝置本發(fā)明還提供一套適合于進(jìn)行本發(fā)明的測試的裝置。此處“裝置”是指進(jìn)行免疫測試的辦法，由一固相組成，通常是薄片形固相，如膜、一紙張形物、條形物、涂層、膠片或其他薄片形物體，在它們上面固定了適當(dāng)?shù)牟东@抗體。所固定的捕獲抗體最好在一固定區(qū)域，此處叫“抗原捕獲區(qū)”。
一套測試裝置可以是將固相整合于一剛性支持物或容器，容器中也可以包括一些或所有進(jìn)行測試所需要的試劑。樣品一般加于測試裝置的一個預(yù)定的上樣區(qū)，如將樣品傾倒或滴于這個區(qū)域或?qū)⒀b置的相應(yīng)部分浸泡于樣品中。如果加樣區(qū)與抗原捕獲區(qū)在不同位置，通常是調(diào)整裝置使樣品中的抗原移到抗體捕獲區(qū)。然后將所需試劑按恰當(dāng)?shù)捻樞蚣佑谥付ǖ膮^(qū)域，該區(qū)可能與上樣區(qū)相同，也可能不同。同樣，如果這個或任何其他試劑添加的位置與抗體捕獲區(qū)不同，通常是調(diào)整裝置使試劑移到檢測所形成的抗原抗體復(fù)合物的抗體捕獲區(qū)。一個免疫測試所需要的所有或部分試劑可以以液體或干的形式包括在裝置內(nèi)。如果這樣，裝置的安排需要做到裝置不同部分之間在進(jìn)行自動發(fā)生的或者操作者控制的反應(yīng)中，各種試劑以正確的順序相互接觸發(fā)生反應(yīng)，以使免疫測試得以進(jìn)行。
免疫測試文獻(xiàn)中介紹了很多種類的測試裝置。膜類裝置的例子見專利U.S.Patents Nos.4,623,461和4,693,984。根據(jù)它們的設(shè)計和操作速度，一些裝置被稱為“浸泡棒”，一些被稱為“快速測試”裝置?！翱焖贉y試”裝置通常在加樣10分鐘內(nèi)給出結(jié)果。(一個典型的微量滴定板或珠形物上進(jìn)行的反應(yīng)需要一個孵育步驟，要得到結(jié)果通常要至少1小時。)因此，雖然用測試裝置通常比微量滴定板或珠形物方案昂貴，它們在醫(yī)療檢測中還是有特別用途，例如當(dāng)需要快速知道結(jié)果時，如急診的情況。
用測試裝置的特別的優(yōu)勢在于它們可以無需復(fù)雜的實驗室設(shè)備而得以進(jìn)行，甚至可以不需要任何實驗室設(shè)施。因此它們可以用作“及時照顧”的測試，例如在急診室、手術(shù)中、配藥時，或者某些情況下，家庭檢測。它們在實驗設(shè)施稀少的地區(qū)特別適用。
單克隆抗體本發(fā)明涉及到使用優(yōu)先于其他形式能選擇性地與一到多種形式的活化的因子XII結(jié)合的單克隆抗體，例如單克隆抗體2/215或在與結(jié)合因子XIIa結(jié)合方面與單克隆抗體2/215具有相同或相似特性的單克隆抗體。
如上述，似乎當(dāng)因子XIIa為細(xì)胞性因子，即與細(xì)胞或細(xì)胞組成物結(jié)合時，其抗原表位不像非細(xì)胞性因子XIIa那樣全部可用。例如，單克隆抗體2/215既能與細(xì)胞性因子XIIa也能與非細(xì)胞性因子XIIa有效結(jié)合，而單克隆抗體201/9和一個針對因子βXIIa的綿羊多抗體似乎不能像結(jié)合非細(xì)胞性因子一樣有效結(jié)合細(xì)胞性因子XIIa。
不局限于以下假設(shè)，看來單克隆抗體2/215能有效結(jié)合形成復(fù)合物或聯(lián)合體后的因子XIIa所暴露的抗原表位。例如，當(dāng)因子XIIa與細(xì)胞物質(zhì)、脂質(zhì)、一或多個其他的因子XIIa、或者高或低親和性結(jié)合伴侶等形成復(fù)合物或聯(lián)合體時。
在結(jié)合特定因子XIIa方面與單克隆抗體2/215和單克隆抗體201/9具有相同或相似結(jié)合特性的單克隆抗體可以用傳統(tǒng)的方法制造，對所希望的結(jié)合特性也可以用傳統(tǒng)的方法篩選。例如，能與一到多種特定因子XIIa結(jié)合的單克隆抗體，像在結(jié)合因子XIIa方面與單克隆抗體2/215有相同或相似結(jié)合特性的單克隆抗體，可以用此處已知的方法產(chǎn)生?？梢詮乃玫降目贵w篩選具有所需特征的抗體。
通常希望本發(fā)明所用單克隆抗體對因子XII酶原沒有顯著結(jié)合特性。對因子XII的校正交叉反應(yīng)性是，比如0.1％或更低。本發(fā)明中評估一個抗體對因子XII的交叉反應(yīng)性所要考慮的因素，是即便“純”的因子XII制備物也幾乎不可避免地被小量因子XIIa污染(Silverbergand Kaplan，Blood 60，1982，64-70)。專利WO90/08835給出了測定校正交叉反應(yīng)性詳細(xì)的方法。如未特別說明，此處“交叉反應(yīng)性”是指校正的交叉反應(yīng)性。
產(chǎn)生單克隆抗體的方法已廣為人知，如參考文獻(xiàn)Methods in Enzymology，H.VanVunakis and J.J.Longone(Eds)1981，72(B)；ibid，1983 92(E).單克隆抗體可以通過修改自Kohler和Milstein的方法產(chǎn)生(G.Kohler and C.Milstein，Nature，1975，256，495)。
專利WO90/08835收入此處用作參考，它以介紹了如何產(chǎn)生結(jié)合因子αXIIa和因子βXIIa且與因子XII校正交叉反應(yīng)性為0.1％或更低的一般的方法。也給出了產(chǎn)生單克隆抗體2/215和201/9的特別細(xì)節(jié)。其中介紹的一般和特別的方法可以用來生產(chǎn)適合本專利用的單克隆抗體，比如在結(jié)合特定因子XIIa方面與單克隆抗體2/215和單克隆抗體201/9具有相同或相似結(jié)合特性的單克隆抗體。一個基于專利WO90/08835所公開的產(chǎn)生適合本專利用的單克隆抗體的操作流程，在下文實施例22給出。
產(chǎn)生單克隆抗體廣為人知的方法，如參考文獻(xiàn)Methods in Enzymology，H.Van Vunakisand J.J.Longone(Eds)1981，72(B)；ibid，1983 92(E).單克隆抗體可以通過修改自Kohler和Milstein的方法產(chǎn)生(G.Kohler and C.Milstein，Nature，1975，256，495)。用來產(chǎn)生單克隆抗體的免疫原可以是因子βXIIa，見專利WO90/08835。可以從所得到的單克隆抗體篩選那些與因子XII酶原沒有顯著結(jié)合特性，如與因子XII校正交叉反應(yīng)性為0.1％或更低的單克隆抗體。
可以從得到的單克隆抗體篩選偏好與不同形式因子XIIa結(jié)合者，如偏好結(jié)合細(xì)胞性因子XIIa，脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa，或者是因子XIIa與其他因子XIIa、或與高或低親和性結(jié)合伴侶所形成的復(fù)合物或聯(lián)合體。
在篩選與特定形式的因子XIIa結(jié)合的抗體時，用單克隆抗體2/215或單克隆抗體201/9做參照是有利的。所選擇的抗體可能與單克隆抗體2/215或單克隆抗體201/9有相同或相似的對所選擇的形式的因子XIIa的結(jié)合特性。
雖然用于產(chǎn)生單克隆抗體2/215的雜交瘤來源于小鼠脾細(xì)胞，本專利不限于用鼠源或半鼠源雜交瘤。所用融合伴侶(脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞)可以從任何合適的動物獲得。也可以作重組抗體。如需要，抗體可以采用嵌合或人源化的形式。雜交瘤最好體外培養(yǎng)。
多克隆抗體本發(fā)明還提供能與一到多種形式的因子XIIa選擇性結(jié)合的多克隆抗體，也叫抗血清。這種抗體可以標(biāo)記后用作檢測ELISA中捕獲的一到多種形式的因子XIIa。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)這種多克隆抗血清的方法，包括向一動物免疫因子XIIa如βXIIa，從該動物收獲血清，篩選到能與對一到多種形式的因子XIIa結(jié)合的血清。在一些情況下，因子XII可以用作免疫原。
本發(fā)明還包括一種從一研究對象尿液樣品中檢測或測定因子XIIa的方法。在這種情況下不必相對于其他形式而選擇性地檢測某一到多種形式的因子XIIa?？梢杂靡粋€不區(qū)分不同形式的因子XIIa的測試方法。這種測試法可以是，比如生色測試和免疫測試。一個免疫測試的例子見WO90/08835介紹。
測試尿液樣品中的因子XIIa，無論是“通用”方法還是能區(qū)分不同形式的因子XIIa的方法，都可以提供有關(guān)腎功能、腎臟疾病以及腎損傷的信息。因為尿液中因子XIIa的濃度是腎功能、腎臟疾病以及腎損傷的靈敏標(biāo)記，特別是沒有大量蛋白尿出現(xiàn)的情況下。相對于健康對象，尿液因子XIIa濃度升高意味著腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷。尿液因子XIIa濃度的變化可能是臨床病情變化的指示，如治療后狀況惡化或是改善。
臨床和其他用途本發(fā)明，尤其是上文所述免疫測試方法，提供了一種可以容易地在自動化設(shè)備上大規(guī)模開展的檢測和(或)測定不同形式的因子XIIa的方法。
因子XII及其活化形式因子XIIa，被認(rèn)為參與了血液凝結(jié)和其他接觸系統(tǒng)，也叫接觸相系統(tǒng)，例如纖維蛋白溶解作用、補體級聯(lián)系統(tǒng)、炎癥和血管擴(kuò)張，見參考文獻(xiàn)Jacobsen S.and Kriz M.，Br J Pharmaco1.，29，25-36，1967；Kurachi K et al，Biochemistry，19，1330-8 1980；Radcliffe R et al，Blood，50，611-7，1977；Ghebrehiwer B et al，J ClinInvest，71，1450-6.1983；Z Toossi et al，Proc Natl Acad Sci USA，89，11969-72，1992；Wachtfogel YT et al，Blood 67，1731-7，1986；Wachtfogel YT ea al，Thromb Haemost，80，686-91，1998；and Shreiber et al AD，J Clin Invest.，52，1402-9，1973.
因為因子XII和它的活化形式的因子XIIa參與了凝血，而且在維持血管完整和血壓，在影響內(nèi)皮細(xì)胞的多種功能，在控制纖維蛋白溶解和維持血管內(nèi)組成性的抗凝因子等方面有發(fā)揮了功能，對特定形式因子XIIa的測定在包括纖維蛋白溶解系統(tǒng)、補體級聯(lián)系統(tǒng)、血管擴(kuò)張系統(tǒng)等系統(tǒng)在內(nèi)的一些系統(tǒng)的研究中很有用。在與血栓形成和血管狹窄有關(guān)的研究中也是有用的。
臨床和實驗研究表明，包括因子XIIa在內(nèi)的接觸系統(tǒng)參與了急性和慢性炎癥，包括膿毒性休克在內(nèi)的病原不同的病原性休克，糖尿病，過敏，包括彌漫性血管內(nèi)凝血在內(nèi)的凝血一出血紊亂(thrombo-haemorrhagic disorder)，癌癥，心血管疾病如心肌梗塞、咽峽炎，急性冠狀動脈綜合癥，血管發(fā)生，膿毒，自發(fā)性流產(chǎn)和血栓栓塞。
因子XIIa參與凝血，維持血管完整和血壓，控制纖維蛋白溶解和維持血管內(nèi)組成性的抗凝因子等支持了因子XIIa參與了凝血-出血(thrombo-haemorrhagic)紊亂包括彌漫性血管內(nèi)凝血，癌癥疾病，心血管問題如心肌梗塞、咽峽炎，急性冠狀動脈綜合癥，血管發(fā)生和血栓栓塞的臨床和實驗觀察。
我們的關(guān)于因子XIIa存在于激活/參與炎癥過程的粒細(xì)胞上的驚人發(fā)現(xiàn)，支持臨床和實驗研究中關(guān)于因子XIIa參與了包括炎癥如急性和慢性炎癥，包括膿毒性休克在內(nèi)的病原不同的病原性休克，過敏，腫瘤疾病和膿毒癥的暗示。
因此檢測和/或測定特定形式的因子XIIa對有接觸系統(tǒng)參與的疾病和紊亂的臨床和科學(xué)研究是有用的。研究包括對某些疾病或紊亂的易感性、進(jìn)展或結(jié)果的診斷、監(jiān)測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的人的治療提供信息。這些疾病和紊亂包括急性和慢性炎癥，包括膿毒性休克在內(nèi)的病原不同的病原性休克，糖尿病，過敏，包括彌漫性血管內(nèi)凝血在內(nèi)的凝血一出血(thrombo-haemorrhagic)紊亂，血栓形成和血管狹窄，癌癥，心血管疾病如心肌梗塞、咽峽炎，急性冠狀動脈綜合癥，血管發(fā)生，膿毒癥和自發(fā)性流產(chǎn)。
因此對一到多種形式的因子XIIa的檢測或測定在對某些疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測，對患有或懷疑患有那些與健康研究對象相比有一到多種形式的因子XIIa含量不同的疾病或紊亂的研究對象的治療等目的上是有用的。一到多種形式的因子XIIa濃度的變化可能就是上面提到的那些疾病或紊亂的指示。一個研究對象體內(nèi)因子XIIa濃度隨時間的變化可能就是狀況變化的指示，如對應(yīng)于治療的狀況的惡化或改善。這種對那些疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測，或者對那些疾病或紊亂的治療的方法，稱為“診斷、預(yù)測和監(jiān)測”，是本發(fā)明的一部分。
另外，尿液中因子XIIa的濃度是腎功能、腎臟疾病以及腎損傷的靈敏標(biāo)記，對尿液中因子XIIa的檢測或測定可以為腎功能、腎臟疾病以及腎損傷提供有用信息。
診斷、預(yù)測和監(jiān)測本發(fā)明提供一套對某種疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、監(jiān)測或預(yù)測，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的研究對象的治療的方法。包括從研究對象樣品中將一種或多種因子XIIa優(yōu)先于其他形式的因子XIIa被檢測或測定，并將該病人樣本的測試結(jié)果與用相同方法測試從如下至少一種到多種獲取的樣本的結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有這種疾病或紊亂的研究對象；(ii)患有這種疾病或紊亂的研究對象，該研究對象針對這種疾病或紊亂的過程和/或結(jié)果被監(jiān)測；(iii)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象；(iv)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象，該研究對象針對這種的疾病或紊亂的過程或結(jié)果的治療被監(jiān)測；(v)未患這種疾病或紊亂的研究對象；(vi)同一研究對象在這種疾病或紊亂發(fā)作之前或在對這種疾病或紊亂治療開始之前，以及(vii)同一研究對象在這種疾病或紊亂早期或晚期，或在對這種疾病或紊亂治療的早期或晚期，或在這種疾病或紊亂開始之前。
樣品可以是上面描述的任一種。例如，樣品可以是一種體液樣品如全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液和淚液。
測試可以是針對一到多種形式的因子XIIa的檢測和(或)測定。例如，選擇任意一到多個形式的因子XIIa作為檢測和/或測定對象，如任意一到多種形式的細(xì)胞性因子XIIa、脂結(jié)合因子XIIa和尿液因子XIIa的檢測和/或測定。
相對于其他形式的因子XIIa，一個測試針對一種或幾種形式的因子XIIa的高度專一性可以通過如上文所述的對測試方法的合理設(shè)計來達(dá)到或改進(jìn)。對于免疫測試，這些設(shè)計包括對所用抗體或抗體組合的一到數(shù)種選擇，對去垢劑的加或不加以及所加去垢劑種類的選擇，在需要將一種抗體包被到固相的介質(zhì)上的抗原捕獲測試時包被條件的選擇，見上文描述。
對因子XIIa的測試可以是一種免疫測試。測試中使用一種能夠結(jié)合所研究的一種或多種形式的因子XIIa相結(jié)合的抗體。在這種測試中，這種抗體被固定于一種固相介質(zhì)上作為捕獲抗體。
另外，可選擇地，能結(jié)合所研究的一種或幾種形式的因子XIIa的抗體用可以直接檢測或間接檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。
在免疫測試中，所得到的抗原-抗體復(fù)合物可以被直接測定，如上文“免疫測試”部分所述。
免疫測試中能結(jié)合所研究的一種或幾種形式的因子XIIa的抗體可以是單克隆抗體2/215或其類似物，單克隆抗體201/9或其類似物，或能結(jié)合因子XIIa和可選擇地，也能結(jié)合因子XII的多克隆抗體。
在免疫測試中所用的單克隆抗體2/215或其類似物，單克隆抗體201/9或其類似物，或能結(jié)合因子XIIa的多克隆抗體，可以用能直接或間接檢測的標(biāo)記物標(biāo)記和/或固定于一種固相介質(zhì)上作為捕獲抗體。
任何被一種明確的抗體所捕獲的因子XIIa可以用一種標(biāo)記的抗體來檢測或測定，如上文所述。
所研究的疾病或紊亂可以是上文“臨床用途”部分介紹的任何一種，例如凝血系統(tǒng)的疾病或紊亂；包括涉及血液凝結(jié)、纖維蛋白溶解作用、激肽原生成、補體激活和血管發(fā)生、維持血管完整和血壓、維持血管內(nèi)組成型抗凝因子、組織防御和修復(fù)等過程的疾??；包括急性和慢性炎癥、病原休克、糖尿病、過敏、凝血-出血(thrombo-haemorrhagic)紊亂、膿毒癥、自發(fā)性流產(chǎn)或腫瘤疾病等的情況；還有血管內(nèi)凝血或血栓栓塞、血栓形成和血管狹窄、心肌梗塞、急性冠狀動脈綜合癥或咽峽炎等疾病。
臨床或病理情況的治療可以包括施用藥劑和/或外科手術(shù)。如對血栓栓塞和血管狹窄的治療可能包括冠狀動脈血管生成術(shù)和/或溶栓。
可能測試從一個研究對象得到的一系列樣品更有利，如疾病或紊亂過程中所取樣品，和/或這種疾病和紊亂治療中和/或治療開始前所取樣品。
疾病或紊亂可能包括血栓栓塞和血管狹窄，治療方法可能包括冠狀動脈血管生成術(shù)和/或溶栓。在本發(fā)明的一個實施例中，為對這些疾病的發(fā)病狀況和治療的進(jìn)展或結(jié)果進(jìn)行診斷、監(jiān)測或預(yù)測，所用的免疫測試可能是捕獲測試，其中捕獲抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，標(biāo)記抗體為抗因子XIIa的多克隆抗體，樣品孵育步驟中不加去垢劑(三硝基甲苯(Triton))。測試結(jié)果(見實施例16)表明當(dāng)進(jìn)行血管生成術(shù)或溶栓治療之前和之后分別對因子XIIa的濃度進(jìn)行測試時發(fā)現(xiàn)治療因子XIIa的濃度增高，進(jìn)而說明治療是有效的。本測試可能是測定由兩個或多個因子XIIa分子組成的分子復(fù)合物和/或由多個因子XIIa分子組成的顆粒。
疾病或紊亂也可以是未確診的心肌梗塞或急性冠狀動脈綜合癥。在預(yù)測這些疾病的過程或結(jié)果時，對不同形式的因子XIIa進(jìn)行測試會得到不同的信息。
在本發(fā)明的另一個實施例中，免疫測試采用的是一種捕獲測試方法，其中捕獲抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，標(biāo)記抗體為標(biāo)記的單克隆抗體2/215或其類似物，樣品孵育(第一個)步驟中樣品添加去垢劑(三硝基甲苯(Triton))。以住院開始取的樣品作為測試樣品，用2/215捕獲抗體和2/215標(biāo)記抗體進(jìn)行測試。結(jié)果表明低濃度的因子XIIa與首次住院期間次級肌鈣蛋白陽性的風(fēng)險加大是相互關(guān)連的(見實施例17)。
在本發(fā)明的第三個實施例中，免疫測試采用的是一種捕獲測試方法，其中捕獲抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，標(biāo)記抗體為標(biāo)記的單克隆抗體201/9或其類似物，樣品孵育(第一個)步驟中樣品添加去垢劑(三硝基甲苯(Triton))。相對于其他形式的因子XIIa，該測試優(yōu)先檢測一些特定形式的因子XIIa。結(jié)果表明以從住院開始取的樣品作為測試樣品，用2/215捕獲抗體和201/9標(biāo)記抗體進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)因子XIIa濃度的增高是住院期間30天內(nèi)次級肌鈣蛋白陽性風(fēng)險加大的指示(見實施例17)。
在本發(fā)明的另一個實施例中，免疫測試采用的是一種捕獲測試方法，其中捕獲抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，標(biāo)記抗體為標(biāo)記的抗因子XIIa的多克隆抗體，樣品孵育(第一個)步驟中樣品不添加去垢劑(三硝基甲苯(Triton))。相對于其他形式的因子XIIa該測試優(yōu)先檢測特定形式的因子XIIa。結(jié)果表明以住院開始取的樣品作為測試樣品，用2/215捕獲抗體和標(biāo)記的抗因子XIIa的多克隆抗體進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)因子XIIa濃度相對于中間濃度的增高或降低是高死亡風(fēng)險的指示(見實施例17)。本測試可能是測定由兩個或多個分子的因子XIIa組成的分子復(fù)合物和/或由多個因子XIIa分子組成的顆粒。
疾病或紊亂也可以是膿毒癥。在本發(fā)明的一個實施例中，樣品用包括單克隆抗體2/215或其類似物進(jìn)行免疫測試，測試結(jié)果表明某些細(xì)胞性因子XIIa濃度的增加是膿毒癥的指示。該結(jié)果與我們的在炎癥過程中被激活的粒細(xì)胞或者參與炎癥過程的粒細(xì)胞上有因子XIIa存在這一發(fā)現(xiàn)相吻合。這也支持了我們關(guān)于因子XIIa的假設(shè)一因子XIIa參與了涉及炎癥的多種疾病。
如上文所述，尿液中因子XIIa是腎功能、腎臟疾病以及腎損傷的靈敏標(biāo)記。本發(fā)明涉及到一種診斷或監(jiān)測疾病或紊亂的方法?；加羞@些疾病或紊亂的研究對象與健康研究對象相比，其尿液中的因子XIIa，尤其是因子XIIa的濃度是不同的。本發(fā)明提供一種診斷或監(jiān)測疾病或紊亂，或者對疾病和紊亂的治療進(jìn)行監(jiān)測的方法。方法包括在患有或懷疑患有這些疾病或紊亂的研究對象的尿液中檢測或測定因子XIIa，特別是因子XIIa的濃度。
例如，本發(fā)明提供一種對患有或懷疑患有腎功能問題、腎臟疾病以及腎損傷的研究對象的腎功能、腎臟疾病以及腎損傷情況或其治療進(jìn)行診斷或監(jiān)測的方法。方法是監(jiān)測或測定從這些研究對象所取樣品的因子XIIa。
一般來講從這些對象得到的結(jié)果要與同樣方法測定的至少任何一種或幾種源于如下對象的樣品的結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有疾病的研究對象，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷；(ii)患有疾病的研究對象，如腎功題受損、腎臟疾病以及腎損傷。這些研究對象的疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的進(jìn)展或后果受到監(jiān)測；(iii)患有疾病的研究對象，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷，并在進(jìn)行治療；(iv)患有疾病或紊亂，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷，并在進(jìn)行治療的研究對象，這些研究對象的疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的治療情況的過程或后果受到監(jiān)測；(v)沒有患有疾病或紊亂，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的研究對象；(vi)同一研究對象，在紊亂或疾病如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷發(fā)作前，或在紊亂或疾病如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的治療開始前；(vii)同一研究對象，在紊亂或疾病如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷本身或?qū)λ鼈兊闹委煹脑缙诨蛲砥?，或者在紊亂或疾病如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷開始前。
因子XIIa的檢測或測定可以用相對于其他形式能選擇性地檢測或測定一種或幾種形式的因子XIIa的檢測或測定方法，也可以用不區(qū)分不同形式因子XIIa的檢測或測定方法。
能提供有用臨床信息的測試方法的確定本發(fā)明的實踐中，鑒定哪種特定形式的因子XIIa與特定的疾病或紊亂相聯(lián)系并非必須。用簡單的方法得知或確定一種特定形式的因子XIIa確實與一種疾病或紊亂有關(guān)聯(lián)就夠了，如與疾病或紊亂的產(chǎn)生、過程或結(jié)果有關(guān)聯(lián)，或與對疾病或紊亂的治療的效率或治療結(jié)果有關(guān)聯(lián)。
如上文所公開，早已知道因子XIIa參與了體內(nèi)血液凝結(jié)的接觸系統(tǒng)。更多的近期研究表明，因子XIIa還參與了其他血液凝結(jié)和補體激活相關(guān)的系統(tǒng)；還有進(jìn)一步的臨床和實驗研究結(jié)果表明接觸系統(tǒng)還參與了許多其他的情況。這些情況在上文“臨床用途”部分有介紹。如下文將要介紹的，可以通過簡單的方法弄清楚某種形式的因子XIIa是否在臨床上與某種疾病或紊亂或者與一疾病或紊亂的治療相關(guān)聯(lián)。
因此，本發(fā)明不限于那些現(xiàn)在已經(jīng)知道的與因子XIIa相關(guān)聯(lián)的疾病或紊亂?？梢酝ㄟ^簡單的方法確定是否有一個關(guān)于因子XIIa與某疾病和紊亂的臨床關(guān)聯(lián)存在。
本發(fā)明提供一種方法，包括對從一個患有某疾病或紊亂，或者在對某疾病或紊亂進(jìn)行治療的研究對象得來的樣品的因子XIIa進(jìn)行一系列的測試；還包括選擇一個能對有關(guān)疾病或紊亂或其治療與因子XIIa水平之間的關(guān)系提供信息的測試。
本發(fā)明還提供一種對因子XIIa進(jìn)行測試的一種方法，它適合對某些疾病或紊亂的易感性、進(jìn)展或結(jié)果的診斷、監(jiān)測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的人的治療提供相關(guān)信息。這包括對來源于患有疾病或紊亂或在接受治療的研究對象的樣品的因子XIIa進(jìn)行一系列的測試，并決定選擇哪一個(幾個)測試結(jié)果來為某些疾病或紊亂的易感性、進(jìn)展或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)δ切┘膊』蛭蓙y的治療提供相關(guān)信息。
這種方法最好包括對來源于患有疾病或紊亂或正在接受治療的研究對象的樣品的因子XIIa進(jìn)行測試，測試結(jié)果與采用同樣方法測定的至少任何一種或幾種源于如下研究對象的樣品的因子XIIa進(jìn)行測試所得的結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有這種疾病或紊亂的研究對象；(ii)患有這種疾病或紊亂的研究對象，同時對其這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果進(jìn)行了監(jiān)測；(iii)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象；(iv)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象，同時對治療對其這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果進(jìn)行了監(jiān)測；(v)未患這種疾病或紊亂的研究對象；(vi)在這種疾病或紊亂發(fā)作之前或在對這種疾病或紊亂治療開始之前的同一研究對象，以及(vii)在疾病或紊亂早期或晚期，或在對這種疾病或紊亂治療的早期或晚期，或在這種疾病或紊亂發(fā)作之前的同一研究對象。
所分析的樣品最好是從各種研究對象如處于這種疾病或紊亂發(fā)病過程中或治療過程中的各種的研究對象所獲得的一系列的樣品。
所用測試可以是上文所描述的與本發(fā)明實踐相關(guān)的測試中的任意一種，包括免疫測試和其他測試方法。根據(jù)本發(fā)明，如果用某一特定的測試方法發(fā)現(xiàn)某一或某些形式的因子XIIa與一種疾病或紊亂或與對它們的治療在臨床上有關(guān)聯(lián)，那么這種測試方法就可以用作對某些疾病或紊亂的易感性、進(jìn)展或結(jié)果的診斷、檢測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)δ切┘膊』蛭蓙y的治療提供相關(guān)信息。見上文描述。
按照各種測試與各種病情狀況的關(guān)系將所得結(jié)果收集并組織起來形成一個數(shù)據(jù)庫可能是有用的。該數(shù)據(jù)庫能夠用來對對從所研究的特定研究對象上得到的結(jié)果進(jìn)行輔助解釋。這樣一個收集并組織結(jié)果建立的數(shù)據(jù)庫的方法也是本發(fā)明的一部分。
可見，存在不同形式因子XIIa的發(fā)現(xiàn)，不同形式因子XIIa水平與不同的疾病或紊亂以及它們的治療具有臨床關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)，具有更加廣泛的實際用途。超越了傳統(tǒng)的與因子XIIa有關(guān)聯(lián)的血液凝結(jié)系統(tǒng)，也超越了迄今為止已經(jīng)證實的與因子XIIa有關(guān)聯(lián)的疾病和紊亂的實際用途。
本發(fā)明通過下面的實施例(不只局限于這些實施例)進(jìn)行描述。
實施例實施例1本實施例用熒光標(biāo)記抗體結(jié)合的方式顯示了血清出中存在多種因子XIIa，并根據(jù)分子量的不同用高效液相色譜(HPLC)分離了抗原抗體結(jié)合復(fù)合物。
抗體2/215按照試劑使用說明用異硫氰酸熒光素(FITC)(Pierce，3747 N Meridian Road，PO Box 117，Rickford，IL 61105)標(biāo)記。
HPLC系統(tǒng)包括Waters 1525雙泵，Waters 2487雙波長吸收檢測器，和一個Jasco FP1520熒光檢測器組成。
HPLC的流動相為0.1M NaCl、0.05M Tris HCl，0.4％(W/V)Tris-檸檬酸鈉pH 7.5。固定相為一系列2×30cm BioSep-SEC-S 3000層析柱(Phenomenex，Queens Avenue，HurdsfieldIndustrial Estate，Macclesfield，Cheshire SK10 2BN，United Kingdom)。流速為1ml/分鐘，進(jìn)樣體積為100μl。Jasco熒光檢測器的設(shè)置為激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長520nm，放大倍數(shù)為1000，衰減為1。
在HPLC系統(tǒng)上分離的樣品有FITC標(biāo)記的抗體2/215，血清樣品，與FITC標(biāo)記的抗體2/215孵育4小時的血清樣品(250μl血清加1μl FITC標(biāo)記的抗體)。
熒光對時間的曲線的例子見圖2a到2d。
圖2a中，從血清樣品的示蹤可見血清樣品有自發(fā)熒光。圖2b顯示的是FITC標(biāo)記的抗體的熒光。圖2c顯示的是與FITC標(biāo)記的抗體孵育的血清樣品的熒光，可見比2a和2b多出了一些峰，從而表明FITC標(biāo)記的抗體能與血清樣品中的幾個組分相結(jié)合。這在圖2d的示蹤圖中得到進(jìn)一步顯示，此圖中血清自發(fā)熒光和FITC標(biāo)記抗體自身的熒光被減除，從而所得熒光示蹤結(jié)果就只反映了抗體與血清物質(zhì)之間的結(jié)合。
實施例2本實施例用與放射性(I125)標(biāo)記的抗體片段結(jié)合的方式顯示了血清中存在多種活化因子XII，并根據(jù)分子量的不同用高效液相色譜(HPLC)分離了結(jié)合復(fù)合物。
抗體2/215Fab片段用試劑盒“免疫純Fab制備試劑盒”(Pierce，3747 N Meridian Road，PO Box 117，Riekford，IL 61105，U.S.A)，按其操作手冊制備。所得2/215Fab片段由AmershamPharmacia Biotech公司(Pollards Wood，Nightingales Lane，Chalfont St Giles，HP8 4SPUnited Kingdom)進(jìn)行碘125放射標(biāo)記。
從健康志愿者的1ml血清中加1μl放射性標(biāo)記抗體片段。孵育4小時后，用高效液相色譜(HPLC)分離血清組分。HPLC系統(tǒng)為Agilent 1100系統(tǒng)。
HPLC的流動相為0.1M NaCl，0.05M Tris HCl，0.4％(W/V)Tris-檸檬酸鈉pH 7.5。固定相為一組2×30cm BioSep-SEC-S 3000層析柱(Phenomenex，Queens Avenue，HurdsfieldIndustrial Estate，Macclesfield，Cheshire SK10 2BN，United Kingdom)。流速為0.7ml/分鐘，進(jìn)樣體積為100μl。
HPLC洗脫組分用自動組分收集儀收集，設(shè)置為20秒收集一個部分。每個收集部分的放射性用多孔液閃計數(shù)儀測定。
圖3給出了一個放射性對時間的曲線圖例，可以看到其中有多個峰，表明放射性標(biāo)記的抗體片段已經(jīng)與血清中的不同組分結(jié)合。
實施例3微量滴定板測定細(xì)胞性因子XIIa向板上預(yù)先包被有單克隆抗體2/215的孔中各加100μl等分的樣品。孵育60分鐘后，以硼酸緩沖液(pH7.4)洗板。然后向每孔加入100μl的相應(yīng)的偶聯(lián)物(堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體)，再孵育60分鐘。再次進(jìn)行洗板后，加入100μl的酚酞磷酸鹽底物。孵育合適時間后，加入堿性終止液抑制進(jìn)一步的底物轉(zhuǎn)換發(fā)應(yīng)，于550nm測定吸光值。
方法從志愿者收集的血液分置于兩個用檸檬酸鹽處理過的離心管中，以1000g離心10分鐘分離血紅細(xì)胞。分離的血漿并到一塊以消除不同管之間的差異。一部分血漿以1ml等分分裝于離心管，并標(biāo)明“細(xì)胞豐富血漿”。
剩下的血漿等分后在小型離心機(jī)中以16000g高速離心10分鐘。收集分離到的上清液，并標(biāo)明為“細(xì)胞稀少血漿”。沉淀通過100mM pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)懸浮洗滌，于16000g離心10分鐘，棄去上清液。沉淀再以同樣的方法洗兩次，然后用PBS重新懸浮，并標(biāo)明“洗后細(xì)胞”。
所得的3種樣品(細(xì)胞豐富血漿，細(xì)胞稀少血漿和洗滌后細(xì)胞)用上述微量滴定板測試的方法測試。用單克隆抗體2/215捕獲細(xì)胞性因子XIIa，用標(biāo)記的單克隆抗體2/215(2/215偶聯(lián)物)或多克隆抗體(多克隆抗體偶聯(lián)物)檢測捕獲的細(xì)胞性因子XIIa。
結(jié)果測試結(jié)果見表1。由于沒有可用的雙2/215抗體(捕獲抗體和檢測抗體)測試的標(biāo)準(zhǔn)對照，以2/215偶聯(lián)物得到的結(jié)果以吸光值表示。對吸光值進(jìn)行歸一化數(shù)據(jù)處理，結(jié)果的圖示見圖4a和4b。
表1.對不同樣品用多克隆抗體偶聯(lián)物和2/215偶聯(lián)物的微量滴定板測試結(jié)果

從表1和圖4a及圖4b可見，用多克隆抗體偶聯(lián)物進(jìn)行測試時，細(xì)胞豐富血漿和細(xì)胞稀少血漿中都得到了顯著的應(yīng)答，而洗滌后細(xì)胞中只有微弱的應(yīng)答。相反，當(dāng)用2/215偶聯(lián)物進(jìn)行測試時，從洗滌后細(xì)胞中得到最大應(yīng)答，而從細(xì)胞稀少血漿中得到最低應(yīng)答。
實施例4對細(xì)胞性因子XIIa的IMx測試Abbott IMx系統(tǒng)是一種用酶免疫測試和熒光極化免疫測試技術(shù)來進(jìn)行測試的自動免疫測試分析儀。
在這些實施例中所用的技術(shù)是微粒酶免疫測試(MEIA，microparticle enzymeimmunoassay).MEIA技術(shù)采用了一種能特異的捕獲所測試分子的捕獲分子(此處為抗體)包被的微粒。微粒表面的有效表面和分析物與固相間的擴(kuò)散距離的有效性等方面的優(yōu)勢使測試動力學(xué)得以改進(jìn)，進(jìn)而使MEIA測試能比其他免疫測試更快速地完成。微粒及結(jié)合其上的分析物通過與MEIA反應(yīng)孔中的玻璃纖維基質(zhì)的不可逆結(jié)合而從反應(yīng)體系混合物中得到分離。MEIA測試所需的反應(yīng)物如下●包被有捕獲分子(此處為單克隆抗體2/215)的微粒●堿性磷酸酶標(biāo)記的偶聯(lián)物(此處為針對活化因子XII的抗體——多克隆抗體或單克隆抗體2/215)●熒光發(fā)生底物，4-甲基傘形酮酰磷酸鹽(4-methylumbelliferyl phosphate)(MUP)●含有能結(jié)合免疫反應(yīng)復(fù)合物的玻璃基質(zhì)的反應(yīng)孔。
還有其他試劑如稀釋溶液和/或洗滌溶液。
下面是MEIA反應(yīng)過程的描述1.IMx系統(tǒng)將樣品和微粒(包被有捕獲分子)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)室的孵育孔。通過一段孵育時間，分析物與微粒相結(jié)合，得到免疫反應(yīng)復(fù)合物。
2.IMx系統(tǒng)將一等份免疫反應(yīng)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)室內(nèi)部的玻璃纖維基質(zhì)上。免疫反應(yīng)復(fù)合物不可逆地結(jié)合于玻璃纖維基質(zhì)。IMx系統(tǒng)洗滌基質(zhì)以除去未結(jié)合物質(zhì)，免疫反應(yīng)復(fù)合物被保留于玻璃纖維而多余的反應(yīng)混合物從基質(zhì)里的大孔中快速流出。
3.IMx系統(tǒng)向基質(zhì)添加堿性磷酸酶標(biāo)記的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物結(jié)合于免疫反應(yīng)復(fù)合物，形成抗體-分析物-偶聯(lián)物的“三明治”狀。IMx系統(tǒng)再次洗滌基質(zhì)。
4.IMx系統(tǒng)向基質(zhì)中加入熒光發(fā)生底物4-甲基傘形酮酰磷酸鹽(4-methylumbelliferylphosphate)(MUP)。偶合物催化4-甲基傘形酮酰磷酸鹽(4-methylumbelliferyl phosphate)(MUP)水解為4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone)(MU)5.IMx儀器中的光學(xué)系統(tǒng)測量玻璃纖維基質(zhì)上熒光產(chǎn)物(MU)產(chǎn)生的速率。玻璃纖維基質(zhì)上熒光產(chǎn)物(MU)產(chǎn)生的速率與測試樣品中的分析物的濃度成正比。
下面描述的IMx實驗所用的操作步驟展開于附圖5。
方法和結(jié)果將從一個志愿者收集來的血液置于6個檸檬酸鹽處理過的離心管，1000g離心10分鐘分離血紅細(xì)胞。所用管中分離的血漿并到一起以消除不同收集管間的差異。其中一部分血漿以1ml的等分分裝于離心管中，并標(biāo)明“細(xì)胞豐富血漿”。
其余血漿等分并高速離心(16000g離心10分鐘)。收集分離得到上清并標(biāo)明“細(xì)胞稀少血漿”。沉淀通過100mM pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)懸浮洗滌，于16000g離心10分鐘，棄上清。沉淀再以同樣的方法洗兩次，然后用PBS重新懸浮，并標(biāo)明“洗后細(xì)胞”。所得的3種樣品(細(xì)胞豐富血漿，細(xì)胞稀少血漿和洗滌后細(xì)胞)像實施例3一樣采用微量滴定板測試的方法測試。測試既用2/215偶聯(lián)物也用多克隆抗體偶聯(lián)物。樣品同時也用AbbottIMx自動免疫測試儀測定活化的因子XII。與實施例3不同，測試中采用堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體201/9和2/215來檢測細(xì)胞性因子XIIa偶聯(lián)物。所得微量滴定板測試結(jié)果見圖6a和6b，用IMx測試所得結(jié)果見圖7a和7b。
如圖6a和6b所示，用多克隆抗體偶聯(lián)物進(jìn)行的微量滴定板測試中，細(xì)胞豐富血漿和細(xì)胞稀少血漿都得到強(qiáng)應(yīng)答，而細(xì)胞懸浮物中應(yīng)答微弱。而當(dāng)用2/215偶聯(lián)物進(jìn)行測試時，有最強(qiáng)應(yīng)答的是細(xì)胞懸浮物，細(xì)胞豐富和細(xì)胞稀少血漿的應(yīng)答低了很多，以細(xì)胞稀少血漿的應(yīng)答最弱。
如圖7a和7b所示，用201/9偶聯(lián)物進(jìn)行IMx系統(tǒng)測試時，應(yīng)答強(qiáng)烈的為細(xì)胞豐富和細(xì)胞稀少血漿而應(yīng)答最弱的是細(xì)胞懸浮物。當(dāng)用2/215偶聯(lián)物進(jìn)行IMx系統(tǒng)測試時，應(yīng)答強(qiáng)烈的為細(xì)胞懸浮物和細(xì)胞豐富血漿，而細(xì)胞稀少血漿的應(yīng)答降低了很多。
實施例5細(xì)胞性因子XIIa的流式細(xì)胞技術(shù)分析用流式細(xì)胞技術(shù)來測試單克隆抗體2/215是否結(jié)合血漿細(xì)胞上的因子XIIa是另外一種可選擇的方法。
單克隆抗體2/215用FITC標(biāo)記。FITC標(biāo)記的2/215與細(xì)胞豐富血漿孵育，同時將一個對照組(未加標(biāo)記抗體)以流式細(xì)胞技術(shù)測試。所得結(jié)果見圖8a和圖8b。圖8a顯示的是從沒有加標(biāo)記抗體的血漿得到的結(jié)果，圖8b顯示的是從與標(biāo)記抗體孵育的血漿得到的結(jié)果。
對比圖8a和圖8b，添加FITC標(biāo)記抗體后峰的右移表明抗體已經(jīng)與血漿中的細(xì)胞結(jié)合。
實施例6用與放射性標(biāo)記的抗體孵育的方法測定細(xì)胞性因子XIIa另一個定性和定量測定細(xì)胞性因子XIIa的方法是將放射性標(biāo)記的2/215抗體加到全血或血漿樣品中，通過離心分離細(xì)胞，然后測定結(jié)合于這一部分的放射性的量。
單克隆抗體2/215用碘125標(biāo)記。全血樣品來自8個志愿者，樣品與放射性標(biāo)記的抗體一起孵育。然后用低離心力(1000g)離心去除血紅細(xì)胞，其他細(xì)胞(包括血小板和白細(xì)胞)用高離心力(16000g)離心分離。離心得到的細(xì)胞團(tuán)塊用100mM pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)懸浮洗滌，于16000g離心10分鐘，棄去上清液。沉淀再以同樣的方法洗兩次，然后用PBS重新懸浮，并標(biāo)明“懸浮細(xì)胞”。
測定結(jié)合在這一細(xì)胞物質(zhì)上的放射性的量以及與因子XIIa結(jié)合的抗體上放射性的總量(相對于于自由抗體)，據(jù)此計算細(xì)胞性因子XIIa在細(xì)胞組分中的因子XIIa的比例。
表2給出了所加抗體中結(jié)合于細(xì)胞性因子XIIa的抗體的百分率和與細(xì)胞內(nèi)所有因子XIIa結(jié)合的抗體的比例。由表2可見，有大量且種類較多的細(xì)胞性因子XIIa。圖9以圖示的方式表明了8個個體的細(xì)胞性因子XIIa的相對濃度。
表2結(jié)合于細(xì)胞性因子XIIa的抗體百分率和與細(xì)胞部分因子XIIa結(jié)合的抗體的比例

實施例7“因子XII缺陷”個體的細(xì)胞性因子XIIa收集“健康”志愿者和被視為因子XII完全缺失的志愿者(以檢測因子XII抗原的ELISA測試測定因子XII，抗體來自公司ERL，15 Skelty Rd，Swansea，UK；也用凝結(jié)實驗來測定因子XII(見參考文獻(xiàn)Griffin，J.H.& Cochrane，C.G.，in Methods in Enzymology，Academic Press(New York)45，56-65，1976))的檸檬酸鹽處理的血樣。以1000g離心10分鐘分離細(xì)胞。各個體不同管的血漿匯集一處消除管間差異。一部分血漿以1ml等分分裝于離心管，并標(biāo)明“細(xì)胞豐富血漿”。
剩余血漿進(jìn)行等分，在一小型離心機(jī)高速離心(16000g離心10分鐘)。收集上清并標(biāo)明“細(xì)胞稀少血漿”。沉淀通過100mM pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)懸浮洗滌，于16000g離心10分鐘，棄上清。沉淀再以同樣的方法洗兩次，然后用PBS重新懸浮，并標(biāo)明“懸浮細(xì)胞”。
所得樣品(細(xì)胞豐富血漿，細(xì)胞稀少血漿，懸浮細(xì)胞)用2/215偶聯(lián)物和多克隆抗體偶聯(lián)物進(jìn)行微量滴定板免疫測試，同實施例1一樣。樣品用Abbott IMx自動免疫測試儀來測定活化的因子XII，同實施例4一樣。此處用來檢測細(xì)胞性因子XIIa的偶聯(lián)物為過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體201/9和2/215，與實施例3不同。
驚人的發(fā)現(xiàn)在“因子XII完全缺失”的個體中檢測到細(xì)胞性因子XIIa應(yīng)答，結(jié)果見圖10a，10b，11a，11b，12a，12b，13a和13b。
循環(huán)的因子XIIa源自肝臟。因為“因子XIIa完全缺失”個體在其體液中沒有循環(huán)的因子XIIa，與細(xì)胞結(jié)合的因子XIIa就不可能是通過吸收體液中的因子XII或因子XIIa而形成的，所以其細(xì)胞性因子XII和因子XIIa一定由其它來源產(chǎn)生。據(jù)認(rèn)為有可能一些其他的細(xì)胞系也可能產(chǎn)生因子XII，如淋巴細(xì)胞或巨核細(xì)胞。
實施例8本實施例通過向血漿中添加放射性示蹤劑(碘125)標(biāo)記的單克隆抗體2/215抗體片段，沉淀脂蛋白，進(jìn)而測定與沉淀的脂蛋白結(jié)合的放射性的量來顯示與脂質(zhì)結(jié)合的因子XIIa的存在。
抗體2/215Fab片段用“免疫純Fab制備試劑盒”(Pierce，3747 N Meridian Road，POBox 117，Rockford，IL 61105)按操作手冊制備。所得Fab片段由公司Amersham PharmaciaBiotech(Pollards Wood，Nightingales Lane，Chalfont St Giles，HP8 4SP United Kingdom)進(jìn)行碘125標(biāo)記。
檸檬酸鹽血漿樣品來自于12個健康志愿者(6男6女)。
向取自各志愿者的1ml血漿加入1μl放射性標(biāo)記抗體。4小時孵育后，血漿以12000g離心10分鐘去除細(xì)胞成分。通過向上清中加入沉淀劑(含500mM NaCl，215mM MnCl2和500U/ml肝素)來沉淀脂蛋白，每400μl上清加300μl沉淀劑。加入沉淀劑后混勻，孵育10分鐘，于12000g離心10分鐘。移除上清，將沉淀懸浮于1ml沉淀劑、12000g離心10分鐘并除去上清的以洗滌脂蛋白沉淀并除去液相殘留因子XIIa。洗滌過程重復(fù)3次后，用多孔液閃計數(shù)儀測定沉淀物質(zhì)的放射性。
圖14顯示的是從1取自2個志愿者的樣品中脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的水平。從圖14可見，盡管所有測試樣品中都有脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的存在，但不同個體之間脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的濃度還是有明顯的差異的。
實施例9本實施例通過向血漿添加放射性示蹤劑(碘125)標(biāo)記的2/215抗體片段，沉淀脂蛋白，測定與沉淀的脂蛋白聯(lián)結(jié)的放射性強(qiáng)弱來顯示脂質(zhì)結(jié)合的因子XIIa的存在。
抗體2/215Fab片段用“免疫純Fab制備試劑盒”(Pierce，3747 N Meridian Road，PO Box117，Rockford，IL 61105)按操作手冊制備。所得Fab片段由Amersham Pharmacia Biotech公司(Pollards Wood，Nightingales Lane，Chalfont St Giles，HP8 4SP United Kingdom)進(jìn)行碘125標(biāo)記。
檸檬酸鹽血漿從64個因胸痛住院的病人獲得。
向來自各志愿者的1ml血漿加入5μl放射性標(biāo)記抗體。孵育3小時后，血漿以16000g離心10分鐘去除血漿中的細(xì)胞成分。通過向每200μl血漿加500μl含51.54mM磷鎢酸、0.07M MgCl2，并以NaOH調(diào)至pH6.15的沉淀劑沉淀脂蛋白。加入沉淀劑混勻，孵育10分鐘，于16000g離心10分鐘。移除上清，通過將沉淀懸浮于1ml沉淀試劑、16000g離心10分鐘并除去上清的方式洗滌脂蛋白沉淀以除去液相殘留因子XIIa。洗滌過程重復(fù)3次后，用單孔液閃計數(shù)儀(Lab Logic，St John’s House，131 Psalter Lane，Sheffield，England S118UX)測定沉淀物質(zhì)的放射性。
圖15顯示的是從64個病人獲得的脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的水平。從圖15可見，盡管所有測試樣品中都有脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的存在，在不同個體間還是有明顯的差異。
實施例10本實施例用微量滴定板ELISA免疫測試的方法來顯示脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的存在。血漿樣品的脂蛋白通過針對一個存在于脂蛋白顆粒表面的蛋白的抗體而被捕獲。然后通過添加堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體2/215的方法來顯示因子XIIa的存在。
檸檬酸鹽血采自8位健康志愿者。
向預(yù)先包被有抗β-脂蛋白的山羊多抗(Sigma，The Old Brickyard，New Road，Gillingham，Dorset，UK)的微量滴定板孔加入等分的100μl檸檬酸鹽血漿。孵育60分鐘后，以硼酸鹽洗滌緩沖液(pH7.4)洗板。向每孔加入100μl含堿性磷酸酶標(biāo)記的2/215抗體的偶聯(lián)物，再孵育60分鐘。再洗板，然后加入100μl酚酞磷酸鹽底物。孵育30分鐘后，加入堿終止液抑制進(jìn)一步的底物轉(zhuǎn)換，于550nm測定光吸收。
圖16顯示的是用上述方法測定8個志愿者的脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa的濃度。由圖可見，盡管所有樣品中都存在脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa，但是不同個體間的濃度有明顯的差異。
實施例11尿液因子XIIa的微量滴定板測試從5個健康男性志愿者采集5個正常隨機(jī)尿樣。用如下描述的微量滴定板測試方法測試樣品中因子XIIa的存在。
向預(yù)先包被有單克隆抗體2/215的微量滴定板孔加入等分的100μl尿樣。孵育60分鐘后，以硼酸鹽洗滌緩沖液(pH7.4)洗板。向每孔加入100μl偶聯(lián)物(堿性磷酸酶標(biāo)記的綿羊抗人βXIIa多抗)，再孵育60分鐘，洗板，然后加入100μl酚酞磷酸鹽底物。孵育合適時間后，加入堿終止液抑制進(jìn)一步的底物轉(zhuǎn)換，于550nm測定光吸收。通過與從含有已知量的因子βXIIa的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得到的光吸收值的比較來計算樣品因子XIIa的濃度。尿液因子XIIa的濃度結(jié)果見表3。
表3.從健康男性隨機(jī)采集的尿樣因子XIIa濃度的微量滴定板測試

實施例12尿液因子XIIa的IMx測試從5個隨機(jī)的健康男性志愿者采集尿樣。用多克隆抗體偶聯(lián)物和如上述實施例4描述的IMx測試法測定這些樣品中的因子XIIa。所得尿液因子XIIa濃度見表4。
表4.IMx法測定的源于健康男性志愿者的隨機(jī)尿樣因子XIIa濃度

實施例13本實施例通過與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合并根據(jù)結(jié)合因子XIIa的抗體與未結(jié)合的抗體分子量大小差異用高效液相色譜(HPLC)分離的方法來顯示尿液因子XIIa的存在。
抗體2/215按照試劑使用說明用FITC(異硫氰酸熒光素，Pierce，3747 N Meridian Road，PO Box 117，Rickford，IL 61105)標(biāo)記。
HPLC系統(tǒng)由一個Waters 1525雙泵，一個Waters 2487雙波長吸收檢測器))，和一個Jasco FP1520整體熒光檢測器組成。
HPLC的流動相為0.1M NaCl，0.05M Tris HCl，0.4％(W/V)Tris-檸檬酸鈉pH 7.5。固定相為一組2×30cm BioSep-SEC-S 3000層析柱(Phenomenex，Queens Avenue，HurdsfieldIndustrial Estate，Macclesfield，Cheshire SK10 2BN，United Kingdom)。流速為1ml/分鐘，進(jìn)樣體積為100μl。Jasco熒光檢測器的設(shè)置為激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長520nm，放大倍數(shù)為1000，衰減為1。
在HPLC系統(tǒng)上分離的樣品有單獨的FITC標(biāo)記的抗體2/215，單獨的尿液樣品，單獨的與FITC標(biāo)記的抗體2/215孵育4小時的尿液樣品(250μl加1μl FITC)。
熒光對時間的曲線的例子見圖17a到17d。
圖17a中，從尿液樣品的示蹤可見尿液樣品有自發(fā)熒光。圖17b顯示的是FITC標(biāo)記的抗體的熒光。圖17c是與FITC標(biāo)記的抗體孵育的尿液樣品的熒光，可見比17a和17b多出了一些峰。這表明FITC標(biāo)記的抗體與尿液樣品中的幾個組分結(jié)合。這在圖17d的示蹤圖中得到進(jìn)一步顯示，此圖中與內(nèi)源熒光素相關(guān)的信號和單獨FITC標(biāo)記的抗體的信號被衰減，所得熒光示蹤結(jié)果就反應(yīng)了尿液物質(zhì)與抗體的結(jié)合。
實施例14本實施例用與放射性(I125)標(biāo)記抗體片段結(jié)合的方式顯示了尿液中存在多種活化因子XII，并根據(jù)分子量的不同用高效液相色譜(HPLC)分離了結(jié)合復(fù)合物。
所用HPLC系統(tǒng)為Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)。
抗體2/215Fab片段用試劑盒“免疫純Fab制備試劑盒”(Pierce，3747 N Meridian Road，PO Box 117，Rickford，IL 61105，U.S.A)，按其操作手冊制備。所得2/215Fab片段由AmershamPharmacia Biotech公司(Pollards Wood，Nightingales Lane，Chalfont St Giles，HP8 4SPUnited Kingdom)進(jìn)行碘125標(biāo)記。
向健康志愿者的1ml尿液中加1μl放射性標(biāo)記抗體片段。孵育4小時后，用高效液相色譜(HPLC)分離尿液組分。
HPLC的流動相為0.1M NaCl，0.05M Tris HCl，0.4％(W/V)Tris-檸檬酸鈉pH 7.5。固定相為一組2×30cm BioSep-SEC-S 3000層析柱(Phenomenex，Queens Avenue，HurdsfieldIndustrial Estate，Macclesfield，Cheshire SK10 2BN，United Kingdom)。流速為0.7ml/分鐘，進(jìn)樣體積為100μl。
HPLC洗脫組分用自動組分收集儀收集，每20秒收集一個部分。每個收集部分的放射性用多孔液閃計數(shù)儀測定。
圖18給出了一個放射性對時間的曲線圖例，可以看到除未結(jié)合抗體峰外的另一個峰，表明放射性標(biāo)記的抗體片段已經(jīng)與尿液中的不同組分結(jié)合。
實施例15本實施例顯示了進(jìn)行經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成型術(shù)的病人的各種形式因子XIIa的不同反應(yīng)。樣品取自于進(jìn)行冠狀動脈成型術(shù)病人在術(shù)前、術(shù)后和術(shù)后5天時。樣品用兩種偏好測定特定形式的因子XIIa的方法測試。
在測試1中，單克隆抗體2/215以15μg/ml的碳酸氫鈉包被緩沖液(pH.9.6)包被于Nunc(Nunc A/S，Karustrupuej 90，P O Box 280，4000Roskilde，Denmark)Maxisorbmicroplate(每孔包被100μl抗體)。75μl含0.5％(v/v)(三硝基甲苯(Triton))X-100(Sigma，F(xiàn)ancy Road，Poole，Dorset，England)的血漿加入微量滴定板孔，室溫孵育60分鐘。洗滌微量滴定板孔后，加入100μl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物為堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體201/9。孵育60分鐘后再次洗滌微量滴定板孔，然后加入100μl含酚酞磷酸鹽的底物溶液。室溫孵育60分鐘后用強(qiáng)堿性溶液(50g/l碳酸氫鈉，pH 10.5)終止反應(yīng)，然后在550nm測定光吸收。
在測試2中，抗體2/215以2μg/ml的磷酸鹽包被緩沖液(pH.7.4)包被于NuncMaxisorbmicroplate(每孔包被100μl抗體)。75μl不含(三硝基甲苯(Triton))X-100的血漿加入微量滴定板孔，室溫孵育60分鐘。洗滌微量滴定板孔后，加入100μl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物包含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗因子XII的多克隆抗體(Enzyme Research Laboratories，SkeltyRoad，Swansea，UK)。孵育60分鐘后再次洗滌微量滴定板孔，然后加入100μl含酚酞磷酸鹽的底物溶液。室溫孵育60分鐘后用強(qiáng)堿性溶液(50g/l碳酸氫鈉，pH 10.5)終止反應(yīng)，然后在550nm測定光吸收。
圖19顯示的是從-個個體得到的數(shù)值的典型模式?？梢?，測試1所選擇性測定的各種形式的因子XIIa的濃度在內(nèi)冠狀動脈成型術(shù)病人術(shù)前、術(shù)后和術(shù)后5天所取樣品中的變化很小。這與測試2選擇性測定的各形式的因子XIIa的濃度的變化明顯對立。測試2中手術(shù)剛完時測得數(shù)值明顯大幅增加，在術(shù)后5天回復(fù)到術(shù)前水平。
圖20顯示測試2所測試的不同的進(jìn)行冠狀動脈成型術(shù)病人中，特定形式的因子XIIa的反應(yīng)不同。病人S0216在術(shù)后因子XIIa表現(xiàn)出增加，在術(shù)后5天增加更多。病人S0974的因子XIIa僅表現(xiàn)出小量增加，而病人S0811和病人S0909的因子XIIa在手術(shù)以后表現(xiàn)出增加，在5天后回復(fù)到與術(shù)前類似甚至更低。這些應(yīng)答的不同反映了對涉及因子XIIa的生理系統(tǒng)的激活程度的不同，從而能夠指示冠狀動脈成型術(shù)手術(shù)過程的效率。
實施例16本實施例顯示了進(jìn)行溶栓治療的病人各形式的因子XIIa的不同反應(yīng)。
樣品取自于進(jìn)行溶栓治療病人在治療前、治療后和治療后5天時。樣品用兩種偏好測定特別形式的因子XIIa的方法測試。所用測試，即測試1和測試2，如實施例15所描述。
圖21顯示的是從一個個體得到的數(shù)值的典型模式。可見，測試1所選擇性測定的各種形式的因子XIIa的濃度在溶栓治療病人療前、療后和療后5天所取樣品中的變化很小。這與測試2選擇性測定的各形式的因子XIIa的濃度的變化明顯對立。測試2中溶栓治療剛結(jié)束時立即測得數(shù)值明顯大幅增加，在療后5天回復(fù)到療前水平。
圖22顯示測試2所測試的不同的溶栓治療病人中，特定形式的因子XIIa的反應(yīng)不同。病人S0684的溶栓治療對因子XIIa水平變化影響不大。病人S0685在治療后和治療5天后因子XIIa水平逐漸降低，而病人S0693溶栓治療后因子XIIa水平大幅增加，治療5天后回復(fù)到遼前水平。這些反應(yīng)性的不同反映了對涉及因子XIIa的生理系統(tǒng)的激活程度的不同，從而能夠指示溶栓治療的效果。治療前后所測得數(shù)值無明顯變化的兩個病人在幾天內(nèi)死去的事實證實了這一結(jié)論，而溶栓治療后測得數(shù)值表現(xiàn)明顯增加的病人在至少30天內(nèi)沒有出現(xiàn)事故。
實施例17本實施例顯示的是通過對因懷疑為心肌梗塞和急性冠狀動脈綜合癥的住院病人的特定形式的因子XIIa的測定來為其復(fù)發(fā)心肌梗塞或心死亡提供預(yù)測。
數(shù)據(jù)來自于820名住院病人。每個病人的因子XIIa水平用幾個不同測試法測定，因此也測定了不同形式的因子XIIa。研究每個測試結(jié)果，看在住院初期或入院30天后，它是否能為出現(xiàn)繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件(心肌梗塞)或心死亡的基本治療終點提供預(yù)測。
通過對選擇性測定不同種形式因子XIIa的各個測試方法得到的因子XIIa測量值結(jié)果排列(從最低到最高)來確定測試方法的診斷作用。將測試的人群分為4部分，即具有最低因子XIIa濃度值的205個個體為四部分中的第一部分，而具有最高因子XIIa濃度值的205個個體為四部分中的第四部分。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同形式的因子XIIa為不同臨床結(jié)果的風(fēng)險因子。因此，檢測不同形式的因子XIIa的不同方法，為各種不同結(jié)果的臨床使用提供了最好的方法。。
當(dāng)以初始入院后的住院期內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件(心肌梗塞)或心死亡的基本治療終點來評估時，發(fā)現(xiàn)最好的診斷指示是一個據(jù)信能測含有多個因子XIIa分子的復(fù)合物和/或顆粒的測試。因為除了其它因素，樣品未與能打斷樣品中因子XIIa復(fù)合物或與顆粒結(jié)合的因子XIIa的去垢劑接觸。
所用測試是一個微量滴定板形式的免疫測試，其中單克隆抗體2/215包被于NuncMaxisorb微量板上。單克隆抗體2/215以2μg/ml的磷酸鹽包被緩沖液(pH.7.4)包被于NuncMaxisorb microplate(每孔包被100μl抗體)。75μl不含(Triton)X-100的血漿加入微量滴定板孔，室溫孵育60分鐘。洗滌微量滴定板孔后，加入100μl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物為堿性磷酸酶標(biāo)記的同一抗體。孵育60分鐘后再次洗滌微量滴定板孔，然后加入100μl含酚酞磷酸鹽的底物溶液。室溫孵育60分鐘后用強(qiáng)堿性溶液(50g/l碳酸氫鈉，pH10.5)終止反應(yīng)，然后在550nm測定光吸收。
從圖23可見，測試含多個分子的因子XIIa組成的形式的方法，比如測多個因子XIIa分子聯(lián)系在一起組成的分子復(fù)合物和/或在顆粒如細(xì)胞或細(xì)胞殘留物或脂蛋白顆粒或脂蛋白顆粒殘留物的表面的因子XIIa，這樣的測試得到的因子XIIa濃度低的個體，在初始住院期間繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件風(fēng)險要高得多。由圖24可見選擇性測試其他形式的因子XIIa的測試方法未能提供這樣的臨床用途。
然而，當(dāng)所用的基本臨床終點被用做住院期后但在入院30天內(nèi)的繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件時，我們發(fā)現(xiàn)高濃度的不同形式的因子XIIa，即不同于上述測試方法測定的形式的因子XIIa，具有高度的指示作用。
如圖25，其中第4部分的病人的事件發(fā)生量比第1或第2部分高出8倍。圖25的微量滴定板測試的條件為單克隆抗體2/215以15μg/ml的碳酸氫鈉包被緩沖液(pH.9.6)包被于Nunc Maxisorb microplate(每孔包被100μl抗體)。75μl含0.5％(v/v)(Triton)X-100(Sigma，F(xiàn)ancy Road，Poole，Dorset，England)的血漿加入微量滴定板孔，室溫孵育60分鐘。洗滌微量滴定板孔后，加入100μl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物為堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體201/9。孵育60分鐘后再次洗滌微量滴定板孔，然后加入100μl含酚酞磷酸鹽的底物溶液。室溫孵育60分鐘后用強(qiáng)堿性溶液(50g/l碳酸氫鈉，pH 10.5)終止反應(yīng)，然后在550nm測定光吸收。從圖26可見選擇性測定其他形式的因子XIIa的測試方法不能提供這樣的臨床用途。
當(dāng)將死亡作為臨床終點時，我們發(fā)現(xiàn)第3個測試提供了最好的臨床用途。這一方法看來是測試與病人的死亡風(fēng)險相關(guān)的形式的因子XIIa，不管病人有無繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件。圖27是一個U形曲線，具有更低濃度或更高濃度的某種形式的因子XIIa的病人與那些這種形式的因子XIIa接近平均值的病人相比，都有顯著的高死亡風(fēng)險。
得到圖27所示事件的分布形式的微量滴定板測試法的條件為抗體2/215以2μg/ml的磷酸鹽包被緩沖液(pH.7.4)包被于NuncMaxisorb microplate(每孔包被100μl抗體)。75μl不含(Triton)X-100的血漿加入微量滴定板孔，室溫孵育60分鐘。洗滌微量滴定板孔后，加入100μl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗因子XIIa的多抗(酶研究實驗室，Skelty Road，Swansea，UK)。孵育60分鐘后再次洗滌微量滴定板孔，然后加入100μl含酚酞磷酸鹽的底物溶液。室溫孵育60分鐘后用強(qiáng)堿性溶液(50g/l碳酸氫鈉，pH 10.5)終止反應(yīng)，然后在550nm測定光吸收。從圖28可見選擇性測定其他形式的因子XIIa的測試法不能提供這種臨床用途。
實施例18測定一個患嚴(yán)重膿毒癥的住院病人的因子XIIa水平。
測定細(xì)胞性因子XIIa，條件為1ml檸檬酸鹽處理的全血與5μl碘125標(biāo)記的單克隆抗體2/215 Fab片段室溫孵育3小時。期間測定樣品放射性總量。用16000g離心分離細(xì)胞，去除血漿。離心得到的細(xì)胞用1ml pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)懸浮，16000g離心去除上清的方式洗滌6次。6次洗滌之后，測定連接在這一細(xì)胞物質(zhì)上的放射性和結(jié)合于因子XIIa的抗體并表示為占起始樣品放射性總量的百分比。這樣做就校正了向血液樣品加放射性抗體時的任何細(xì)小差異。用這種方法測試來自于膿毒病人的樣品的同時，還測試了相應(yīng)的來自于100個不患膿毒的病人的樣品。膿毒病人的細(xì)胞性因子XIIa的值為8.2％，而100個不患膿毒的病人的細(xì)胞性因子XIIa的值的范圍為0.51％到4.10％(平均值為1.50，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.75)。因此，膿毒病人的細(xì)胞性因子XIIa的濃度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。
實施例19本實施例顯示的是脂質(zhì)結(jié)合的因子XIIa的測定為懷疑為心肌梗塞和急性冠狀動脈綜合癥而住院的病人的心肌梗塞和心死亡的復(fù)發(fā)風(fēng)險提供預(yù)測。
資料來源于160名被懷疑為心肌梗塞的住院病人。測定了每個病人的脂質(zhì)結(jié)合形式的因子XIIa。研究所得結(jié)果看它們是否為住院6個月內(nèi)以繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件或心死亡為基本臨床終點的情況提供預(yù)測。
通過對選擇性測定不同種形式因子XIIa的各個測試方法得到的因子XIIa測量值結(jié)果排級(從低到高)來確定測試方法的診斷作用。將測試的人群分為4部分，即具有最低因子XIIa濃度值的40個個體為四部分中的第一部分，而具有最高因子XIIa濃度值的40個個體為四部分中的第四部分。統(tǒng)計各部分中出現(xiàn)繼發(fā)事件的病人數(shù)量。
抗體2/215 Fab片段用試劑盒“免疫純Fab制備試劑盒”(Pierce，3747 N MeridianRoad，PO Box 117，Rickford，IL 61105，U.S.A)，按其操作手冊制備。所得2/215Fab片段由Amersham Pharmacia Biotech公司(Pollards Wood，Nightingales Lane，Chalfont StGiles，HP8 4SP United Kingdom)進(jìn)行碘125標(biāo)記。
檸檬酸鹽血采自160名因胸痛住院的病人。
1ml檸檬酸鹽血與5μl放射性標(biāo)記抗體室溫孵育3小時。用16000g離心分離去除細(xì)胞，得到血漿。通過向每200μl血漿加500μl含51.54mM磷鎢酸、0.07MMgCl2，并以NaOH調(diào)至pH6.15的沉淀劑沉淀脂蛋白。加入沉淀劑混勻，孵育10分鐘，于16000g離心10分鐘。移除上清，通過將沉淀懸浮于1ml沉淀試劑、16000g離心10分鐘并除去上清的方式洗滌脂蛋白沉淀以除去液相殘留因子XIIa。洗滌過程重復(fù)3次后，用單孔液閃計數(shù)儀(Lab Logic，StJohn’s House，131 Psalter Lane，Sheffield，England S11 8UX)測定沉淀物質(zhì)的放射性。將所得結(jié)果如上述進(jìn)行分類，并統(tǒng)計四個部分中遭受繼發(fā)事件的個體的數(shù)量。
從圖29可見入院6個月內(nèi)，脂質(zhì)結(jié)合的因子XIIa濃度的增加與非致死性肌鈣蛋白陽性事件或心死亡繼發(fā)事件的風(fēng)險增加相關(guān)聯(lián)。
實施例20本實施例顯示的是通過與放射性標(biāo)記抗體孵育并繼以HPLC的方法測定到腎病病人尿液中特定形式的因子XIIa濃度增加。
從5個腎功能不全病人和5個健康志愿者中采集24小時尿樣。每個個體的全部樣本混合起來，分別取30ml的等份進(jìn)行分析。
抗體2/215 Fab片段用“免疫純Fab制備試劑盒”(Pierce，3747 N Meridian Road，POBox 117，Rockford，IL 61105)按操作手冊制備。所得Fab片段由公司Amersham PharmaciaBiotech(Pollards Wood，Nightingales Lane，Chalfont St Giles，HP8 4SP United Kingdom)進(jìn)行碘125標(biāo)記。
向來自各病人和志愿者的1ml尿液加入1μl放射性標(biāo)記抗體。4小時孵育后，用高效液相色譜(HPLC)分離尿液組分。HPLC系統(tǒng)為Agilent 1100系統(tǒng)。
HPLC的流動相為0.1M NaCl，0.05M Tris HCl，0.4％(W/V)Tris-檸檬酸鈉pH 7.5。固定相為一個1×30cm BioSep-SEC-S 3000層析柱和一個1×30cm BioSep-SEC-S 2000層析柱(Phenomenex，Queens Avenue，Hurdsfield Industrial Estate，Macclesfield，CheshireSK10 2BN，United Kingdom)。流速為0.5ml/分鐘，進(jìn)樣體積為100μl。
洗脫物的放射性用帶有碘125高靈敏度檢測系統(tǒng)的在線單孔液閃計數(shù)儀(Lab Logic，StJohn’s House，131 Psalter Lane，Sheffield，England S11 8UX)測定。
各個尿液樣品的對應(yīng)于因子βXIIa的峰(通過它與和放射性標(biāo)記抗體孵育的純βXIIa的滯留時間相同來確定)的面積通過積分得到。所得結(jié)果出示于表5，如圖30所示?？梢妬碜阅I功能不全的病人的數(shù)值明顯高于來自健康志愿者的測定值。
表5.通過與放射性標(biāo)記抗體孵育和HPLC分離測定到的10個尿樣中的因子βXIIa的值

實施例21本實施例顯示的通過微量滴定板測到的腎功能不全病人尿液特定形式的因子XIIa的濃度升高。
從5個腎功能不全病人和5個健康志愿者中采集24小時尿樣。每個個體的全部樣本混合起來，分別取30ml的等份進(jìn)行分析。
單克隆抗體2/215以15μg/ml的碳酸氫鈉包被緩沖液(pH.9.6)包被于Nunc(Nunc A/S，Karustrupuej 90，P O Box 280，4000 Roskilde，Denmark)Maxisorb microplate(每孔包被100μl抗體)。75μl含0.5％(v/v)(Triton)X-100的尿液加入微量滴定板孔，室溫孵育60分鐘。洗滌微量滴定板孔后，加入100μl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物為堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體201/9。孵育60分鐘后再次洗滌微量滴定板孔，然后加入100μl含酚酞磷酸鹽的底物溶液。室溫孵育60分鐘后用強(qiáng)堿性溶液(50g/l碳酸氫鈉，pH 10.5)終止反應(yīng)，然后在550nm測定吸光度值。
吸光度值見表6，圖示于圖31?？梢娔I功能不全的病人的測定結(jié)果顯著高出健康志愿者的測定結(jié)果。
表6.以微量滴定板免疫測試的光吸收值表示的5個腎功能不全病人和5個健康志愿者的尿液因子βXIIa的值

實施例22本實施例給出了一個產(chǎn)生適用于本發(fā)明的單克隆抗體的通用操作方法。
用來產(chǎn)生抗體的抗原是因子XII或源于它的片段。一個因子XII的片段自身可能已具有免疫原性。也可能太小而不具有免疫原性，這時它可以通過與如下要描述的其他肽連接而轉(zhuǎn)化為免疫原。此處“一個因子XIIa的抗原性片段”包既包括一個片段如肽段，也包括這種片段如其自身不具有免疫原性時被轉(zhuǎn)化成的具有免疫原性的形式。
一個因子XII的抗原性片段可以是因子XIIa，如αXIIa和βXIIa或源于它們的片段，像一個包括至少一個能識別因子βXIIa抗體的抗原決定簇的因子βXIIa片段的肽。制備免疫原的方法業(yè)內(nèi)人士已熟知。任何這些方法可以用來免疫，或者改進(jìn)因子XII或其抗原性片段的免疫原性。也可見專利WO90/08835。
例如，因子βXIIa可以用作抗因子XIIa的單克隆抗體或多克隆抗體的免疫原。因子βXIIa可以通過如下方法產(chǎn)生。首先是從新鮮或新鮮的凍存血漿分離因子XII，例如用結(jié)合硫酸銨沉淀和陽離子交換樹脂層析的方法如K.Fujikawa和E.W.Davie描述的方法(Methodsin Enzymol，1981，80，198-211)。將因子XII轉(zhuǎn)化為因子βXIIa并將因子βXIIa從所得混合物中分離的方法見K.Fujikawa和B.A.McMullen(Journal of Biol.Chem.，1983，258，10924-10933)以及B.A.McMullen和K.Fujikawa(Journal of Biol.Chem.，1985，260，5328)描述。為得到因子βXIIa，通常將因子XII進(jìn)行有限的切割。例如通常以摩爾比1∶500或質(zhì)量比1∶75的高度稀釋形式的胰蛋白酶或類胰蛋白酶的酶切消化或化學(xué)方法來切割。切割產(chǎn)物通常以層析法分離。
因子βXIIa的抗原性片段可以用酶學(xué)或化學(xué)方法降解因子βXIIa的方式產(chǎn)生。例如因子βXIIa的二硫鍵連接的輕鏈可以通過對因子βXIIa還原和羧端甲基化處理并以層析法分離片段(K.Fujikawa & B.A.McMullen Journal of Biol.Chem.，1983，258，10924)的方法得到?？蛇x擇地，如果序列已知，一個因子βXIIa的抗原性片段甚至因子βXIIa自身都可以通過合成的方法得到。任何已知的多肽合成的化學(xué)方法都可以使用，尤其是用自動儀器合成的方法。一個因子βXIIa的抗原性片段或因子βXIIa自身也可以用重組DNA技術(shù)獲得。Cool等(1985和1987，loc.cit.)鑒定了一個人凝血因子XII的cDNA和基因?？梢杂靡阎姆椒ǖ玫街亟M產(chǎn)物，例如可參照專利WO90/08835。
除非特別標(biāo)明，此處所用“因子βXIIa”和“βXIIa”包括因子βXIIa分子的抗原性片段。
根據(jù)本發(fā)明，雖然不是必須，但所用單克隆抗體最好，因為它與因子XII原酶沒有顯著的結(jié)合。在后一種情況下，與因子XII原酶的校正交叉反應(yīng)性為0.1％或更低。在評價本發(fā)明中一個抗體與因子XII校正交叉反應(yīng)性時要考慮的一個因素是即便“純”的因子XII制備物也幾乎不可避免地會污染有小量的因子XIIa(Silverberg and Kaplan，Blood 60，1982，64-70)。專利WO90/08835給出了詳細(xì)的評估與因子XII校正交叉反應(yīng)性的方法。除非特別說明，此處“交叉反應(yīng)性”是指校正交叉反應(yīng)性。
用來制備多克隆抗體的方法已為人所熟知，比如可見Methods in Enzymology，H.Van Vunakisand J.J.Longone(Eds)1981，72(B)and ibid，1983 92(E)。
例如，單克隆抗體也可以通過修改自Kohler和Milstein(G.Kohler and C.Milstein，Nature，1975，256，495)的方法生產(chǎn)。
例如，向雌性小鼠Balb/C和C57/BIO腹膜內(nèi)注射因子XII或其抗原性片段來免疫。比如用10到30μg，通常是20μg的因子βXIIa或相當(dāng)量的其他抗原。因子βXIIa或其它抗原最好偶聯(lián)于其他蛋白分子，例如純化的結(jié)核菌素或者更好地，牛甲狀球蛋白衍生物。偶聯(lián)可以通過像碳化二亞胺的方法或用異質(zhì)-雙功能試劑。免疫原通常加于佐劑最好是弗氏完全佐劑。免疫過程通常定期重復(fù)幾次，一般是用同樣劑量的同樣免疫原，如小鼠每隔3周以混合于弗氏完全佐劑的20μg因子βXIIa加強(qiáng)免疫直到觀察到合適的反應(yīng)水平。最好在宰殺前進(jìn)行一次pre-fusion增強(qiáng)，比如宰殺前3天進(jìn)行一次靜脈內(nèi)抗原注射。
抗體反應(yīng)性通過像抗血清的放射免疫曲線測試分析的方法進(jìn)行監(jiān)測。用恰當(dāng)標(biāo)記物如碘125標(biāo)記所需形式的因子XIIa，像細(xì)胞性因子XIIa、脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa、分子間形成復(fù)合物形式或形成聯(lián)合體的因子XIIa、與高或低親和性結(jié)合伴侶形成聯(lián)合體的因子XIIa中的一至數(shù)種。在一些情況下可能用125I放射性標(biāo)記的因子XII或其片段為宜，例如在這一階段用氯胺-T方法(P.J.McConahey and F.J.Dixon，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol，1966，29，185)制備的放射性標(biāo)記的βXIIa或另一種βXIIa抗原。純度的確定，可以用像對在還原性條件下跑的SDS-PAGE膠進(jìn)行放射自顯影的方法。
然后將免疫鼠的脾細(xì)胞與脊髓瘤細(xì)胞融合，如與NSO脊髓瘤細(xì)胞在40-50％PEG 4000或50％PEG 1500存在的情況下的融合。處理后的細(xì)胞植于培養(yǎng)板孔，用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。檢測培養(yǎng)液上清對所關(guān)注的形式的因子XIIa的反應(yīng)性。這些因子XIIa形式如細(xì)胞性因子XIIa、脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa、分子間形成復(fù)合物形式或形成聯(lián)合體的因子XIIa、與高或低親和性結(jié)合伴侶形成聯(lián)合體的因子XIIa。檢測方式如用過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG檢測的固相酶免疫測試。一般對所有對所用抗原顯示特異性的孔進(jìn)行再次篩選。再次篩選包括，比如看溶液中恰當(dāng)?shù)目乖瓕λ刑禺愋钥贵w的結(jié)合特性。恰當(dāng)?shù)目乖窍窦?xì)胞性因子XIIa、脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa、分子間形成復(fù)合物形式或形成聯(lián)合體的因子XIIa、與高或低親和性結(jié)合伴侶形成聯(lián)合體的因子XIIa等。較好的是，對這些進(jìn)行滴定以確定達(dá)到50％最大結(jié)合(50％ B max)所需的抗體稀釋程度。對冷抗原，即未標(biāo)記的抗原的劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行測定。較好的是對因子XII的劑量反應(yīng)曲線也進(jìn)行測定(如果不希望有與因子XII的交叉反應(yīng)性)。也可以用血漿酶(plasmin)和纖溶酶(fibronectin)。交叉反應(yīng)的程度可以根據(jù)如下公式計算 那些對目標(biāo)抗原表現(xiàn)出恰當(dāng)水平的結(jié)合的抗體，比如具有至少1010M-1的親和常數(shù)的那些，被用于進(jìn)一步的克隆化。
所形成的克隆通常是異型的。為了產(chǎn)生結(jié)合于目標(biāo)形式的因子XIIa的目標(biāo)抗體，通常較好的是對這些細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋的亞克隆，然后再進(jìn)行篩選。比如用酶免疫測試或放射免疫測試。目標(biāo)形式的因子XIIa可以是細(xì)胞性因子XIIa、脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa、分子間形成復(fù)合物形式或形成聯(lián)合體的因子XIIa、與高或低親和性結(jié)合伴侶形成聯(lián)合體的因子XIIa等。從各個克隆中選擇的亞克隆也可用放射免疫測試或ELISA進(jìn)行特異性和劑量反應(yīng)的評測。如需要，也可以篩選那些事先測定好的對因子XII具有明顯交叉反應(yīng)性的抗體。交叉反應(yīng)性最好是1.5％或更小，如1％或更小，如0.5％或更小，如0.1％或更小。
如上所示，通常首先針對目標(biāo)形式的因子XIIa進(jìn)行篩選，但這兩種或者，可選擇地，3種篩選可以用任何順序進(jìn)行。在一個篩選步驟中，如恰當(dāng)，單克隆抗體2/215或單克隆抗體201/9可以用作參照抗體。這在希望得到與單克隆抗體2/215或201/9有相同或類似的結(jié)合特定形式因子XIIa的特征的抗體時特別有用。
可以對劑量反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行斯卡查德分析(Scatchard analysis)以得到每個抗體的親和常數(shù)值。
可以將亞克隆或克隆的雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)Balb/C小鼠腹腔內(nèi)以產(chǎn)生腹水。免疫球蛋白可以從腹水中沉淀出來，如在4℃以等體積飽和硫酸銨沉淀。沉淀最好進(jìn)行純化，比如先離心，然后以pH7.5的與原腹水等體積的50mM Tris-HCl緩沖液溶解，再對同樣的緩沖液透析。免疫球蛋白部分可以進(jìn)一步用陽離子交換層析純化。例如將蛋白溶液上樣于Mono-Q陽離子交換柱(Pharmacia)，按產(chǎn)家推薦條件用溶于同樣緩沖液的鹽梯度洗脫。通常將含有免疫球蛋白的組分匯集起來于-20℃貯存?？蛇x擇地，雜交瘤細(xì)胞也可以培養(yǎng)于培養(yǎng)基來產(chǎn)生抗體，所得抗體用基本與上述從腹水分離抗體相同的方法分離?？蛇x擇地，雜交瘤也可以體外培養(yǎng)。雖然此處描寫的雜交瘤源于鼠脾細(xì)胞，本發(fā)明不限于鼠源或半鼠源的雜交瘤。融合的兩方(脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞)可以獲自合適的動物。也可以生產(chǎn)重組抗體。如需要，抗體可以做成嵌合的形式或人源的形式。雜交瘤最好體外培養(yǎng)。
雜交瘤的存放單克隆抗體2/215由雜交瘤2/215(BFxlla)產(chǎn)生，于1990年1月16日以存放號90011606存放于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心，生物制品部，PHLS Centre for Applied Microbiology andResearch，Porton Down，Salisbury SP4 0JG，England(即ECACC)，產(chǎn)生單克隆抗體201/9的雜交瘤201/9(ESBT41.1)于1990年1月18日以存放號90011893存放于ECACC。
權(quán)利要求
1.一種從一個樣品中檢測或測定一種形式或多種形式的因子XIIa的方法，所述方法包括實施一個程序，該程序能使所研究的一種或多種形式的因子XIIa優(yōu)先于其他形式的因子XIIa被檢測或測定。
2.一種如權(quán)利要求1所述的方法，包括通過一個測試來使得所研究的這一種形式或多種形式的因子XIIa能夠優(yōu)先于其他形式的因子XIIa被檢測和測定。
3.一種如權(quán)利要求1所述的方法，包括將所研究的這一種或這多種形式的因子XIIa從其他形式的因子XIIa分離出來，并檢測或測定所分離出來一種或者多種形式的因子XIIa。
4.一種如權(quán)利要求3所述的方法，其中所分離出來的一種或多種形式的因子XIIa的檢測或測定采用權(quán)利要求2所定義的分析方法。
5.一種如權(quán)利要求1所述的方法，包括將樣品與一種可以結(jié)合所研究的這一種或幾種形式的因子XIIa并且可以選擇性地結(jié)合其他形式因子XIIa的抗體相接觸，將所研究的這一種或幾種形式的因子XIIa與其他形式的因子XIIa分離，以及檢測和測定這一種或幾種形式的因子XIIa。
6.一種如權(quán)利要3～5中任何一項所述的方法，所述方法依據(jù)所研究的一種或多種形式的因子XIIa的物理、化學(xué)或免疫特性，將所研究的一種或多種形式的因子XIIa與其他形式的因子XIIa分離。
7.一種如權(quán)利要求6所述的方法，所述方法將所研究的一種或多種形式的因子XIIa通過色譜法、流式細(xì)胞技術(shù)和超離心過程與其他形式的因子XIIa分離，還可選擇性地繼續(xù)進(jìn)行所分離物質(zhì)的酶活性或免疫學(xué)特性的測評。
8.一種如權(quán)利要求6所述的方法，其中所研究的一種或多種形式的因子XIIa用一個能與所研究的一種或多種因子XIIa結(jié)合的抗體的免疫親和色譜方法分離，可選擇性地繼續(xù)進(jìn)行所分離物質(zhì)的酶活性或免疫學(xué)特性的測評。
9.一種如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的方法，其中分離步驟是在不會破壞這一種或多種形式的因子XIIa的條件下進(jìn)行。
10.一種如權(quán)利要求1～9中任何一項所述的方法，其中實驗樣品為體液或身體組織。
11.一種如權(quán)利要求10所述的方法，其中體液為血液、血漿或血清。
12.一種如權(quán)利要求10所述的方法，其中體液為尿液、腦脊液、唾液或淚液。
13.一種如權(quán)利要求1～12中任何一項所述的方法，其中所研究因子XIIa的形式為細(xì)胞因子XIIa。
14.一種如權(quán)利要求3～12中任何一項所述的方法，其中所研究因子XIIa的形式為細(xì)胞因子XIIa，所述細(xì)胞因子XIIa通過將細(xì)胞、細(xì)胞殘留物和/或細(xì)胞物質(zhì)從體液液相或組織分離而與其他形式的因子XIIa分開。
15.一種如權(quán)利要求14所述的方法，其中細(xì)胞、細(xì)胞殘留物和/或細(xì)胞物質(zhì)通過離心分離。
16.一種如權(quán)利要求13～15中任何一項所述的方法，其中細(xì)胞因子XIIa在檢測或測定前先與與其它形式的因子XIIa分離。
17.一種如權(quán)利要求1～12中任何一項所述的方法，其中所研究因子XIIa的形式為脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa。
18.一種如權(quán)利要求17所述的方法，其中所研究因子XIIa的形式為脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa，這些脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa通過將脂質(zhì)部分從體液液相或組織分開而與其他形式的因子XIIa分開。
19.一種如權(quán)利要求18所述的方法，其中脂質(zhì)部分包括脂蛋白和/或其殘留物。
20.一種如權(quán)利要求19所述的方法，其中脂質(zhì)部分用脂蛋白沉淀試劑沉淀。
21.一種如權(quán)利要求17～20中任何一項所述的方法，其中脂質(zhì)結(jié)合因子XIIa在與其他形式的因子XIIa分離前與一標(biāo)記抗體相接觸。
22.一種如權(quán)利要求1～12中任何一項所述的方法，其中所研究一種或多種形式的因子XIIa為任意一種或多種包括由兩個或多個因子XIIa、與低親和性伴侶結(jié)合的因子XIIa和與高親和性伴侶結(jié)合的因子XIIa在內(nèi)的復(fù)合物。
23.一種如權(quán)利要求1～22中任何一項所述的方法，其中檢測或測定是在不會破壞所研究一種或多種形式的因子XIIa的條件下進(jìn)行。
24.一種如權(quán)利要求1～23中任何一項所述的方法，其中分離步驟在所研究的一種或多種形式的因子XIIa不會被破壞的條件下進(jìn)行。
25.一種如權(quán)利要求1～24中任何一項所述的方法，其中一種或多種形式的因子XIIa用免疫測試的方法檢測或測定。
26.一種如權(quán)利要求25所述的方法，其中所用免疫測試方法是相對于其他形式的因子XIIa能優(yōu)先檢測或測定所研究的一種或多種形式的因子XIIa的方法。
27.一種如權(quán)利要求26所述的方法，其中的測試方法包括用一個能與所研究的一種或多種形式的因子XIIa結(jié)合的抗體。
28.一種如權(quán)利要求27所述的方法，其中抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，單克隆抗體201/9或其類似物，或者能與因子XIIa結(jié)合的多克隆抗體。
29.一種如權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的方法，其中的抗體用一個可以直接或間接檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。
30.一種如權(quán)利要求29所述的方法，其中的抗體被放射性標(biāo)記。
31.一種如權(quán)利要求25～30中任何一項所述的方法，其中所得抗原—抗體復(fù)合物是被直接檢測或測定的。
32.一種如權(quán)利要求25～31中任何一項所述的方法，其中所得抗原—抗體復(fù)合物用流動血細(xì)胞計數(shù)法、表面等離子體共振法、表面光波法或石英晶體微平衡法檢測。
33.一種如權(quán)利要求25～32中任何一項所述的方法，其中樣品為組織樣品，所研究的一種或多種形式的因子XIIa用免疫組織學(xué)的方法檢測或測定。
34.一種包括權(quán)利要求5的如權(quán)利要求27所述的方法，其中抗體固定于一個固相作為捕獲抗體。
35.一種如權(quán)利要求34所述的方法，其中作為捕獲抗體固定于固定相上的抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，單克隆抗體201/9或其類似物，或者能與因子XIIa結(jié)合的多克隆抗體。
36.一種如權(quán)利要求35所述的方法，其中捕獲抗體的抗體為單克隆抗體2/215或其類似物。
37.一種如權(quán)利要求35所述的方法，其中捕獲抗體的抗體為單克隆抗體201/9或其類似物。
38.一種如權(quán)利要求34～37中任何一項所述的方法，其中固定相與樣品結(jié)合，任何所產(chǎn)生的抗原—抗體復(fù)合物用權(quán)利要求28或權(quán)利要求29中所講的標(biāo)記抗體檢測或測定。
39.一種如權(quán)利要求38所述的方法，其中標(biāo)記的抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，單克隆抗體201/9或其類似物，或者能與因子XIIa結(jié)合的多克隆抗體。
40.一種如權(quán)利要求1～39中任何一項所述的方法，其中檢測或測定過程中的參數(shù)要進(jìn)行調(diào)整，以使所研究的一種或多種形式因子XIIa相對于其他形式的因子XIIa能被優(yōu)先檢測或測定。
41.一種如權(quán)利要求40所述的方法，其中檢測或測定過程中不加去垢劑。
42.一種如權(quán)利要求40所述的方法，其中檢測或測定過程中要加去垢劑。
43.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定因子αXIIa。
44.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定因子βXIIa。
45.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定因子βXIIa。
46.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的因子αXIIa。
47.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的因子βXIIa。
48.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于低親和性結(jié)合伴侶的因子βXIIa。
49.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的因子αXIIa。
50.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的因子βXIIa。
51.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于高親和性結(jié)合伴侶的因子βXIIa。
52.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合有兩個或更多因子XIIa分子的復(fù)合體。
53.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于細(xì)胞或細(xì)胞衍生物上的因子XIIa。
54.一種如權(quán)利要求1～42中任何一項所述的方法，其中的操作可以做到優(yōu)先檢測或測定結(jié)合于脂質(zhì)、脂蛋白及其殘留物上的因子XIIa。
55.一種如權(quán)利要求43～53中任何一項所述的方法，所述方法中的免疫測試是捕獲測試，其中，捕獲抗體為單克隆抗體2/215或其類似物，標(biāo)記抗體為單克隆抗體2/215或其類似物。
56.，一種包括權(quán)利要求5的如權(quán)利要求1～24中任何一項的方法，，其中因子XIIa以生色測試的方法檢測或測定。
57.一種如權(quán)利要求1～56中任何一項所述的方法，其中提供樣品的個體為有某種疾病或紊亂、正患某種疾病或紊亂、患完某種疾病或紊亂之后或者治療了某種疾病或紊亂之后。
58.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂涉及到凝血系統(tǒng)。
59.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂涉及到凝血、纖維蛋白溶解作用、激肽原產(chǎn)生、補體激活或血管發(fā)生、血管完整性維持和血壓、血管內(nèi)組成性抗凝因子的維持、組織防御或修復(fù)。
60.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂是/或涉及到急性或慢性炎癥、包括膿毒休克的病原性休克、糖尿病、過敏、凝血-出血紊亂(a thrombo-haemorrhagic disorder)、膿毒、自發(fā)性流產(chǎn)或腫瘤疾病。
61.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂是/或涉及到靜脈血凝結(jié)或血栓栓塞、心肌梗塞、急性冠狀動脈綜合癥或咽峽炎。
62.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂是/或涉及到血栓形成和血管狹窄。
63.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂是/或涉及到疑似心肌梗塞或急性冠狀動脈綜合癥。
64.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中疾病或紊亂是/或涉及到膿毒。
65.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中治療涉及到服用治療劑和/或手術(shù)。
66.一種如權(quán)利要求65所述的方法，其中治療是冠狀動脈血管成型術(shù)或溶栓。
67.一種如權(quán)利要求1～66中任何一項所述的方法，其中測試了從一個個體獲得的一系列樣品。
68.一種如權(quán)利要求67所述的方法，其中樣品是在患疾病或紊亂期間采集。
69.一種如權(quán)利要求66或權(quán)利要求67所述的方法，其中樣品在對疾病或紊亂的治療期間、治療前和/或治療結(jié)束后采集。
70.一種對某些疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果，或?qū)加谢驊岩苫加羞@種疾病或紊亂的研究對象的治療的診斷、監(jiān)測或預(yù)測的方法；所述方法包括將從被研究對象獲取的一個樣品中的一種或多種形式的因子XIIa優(yōu)先于其他形式的因子XIIa的檢測或測定，并將從該研究對象獲取的結(jié)果與用相同實驗獲得的如下至少一種或多種樣本的結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有這種疾病或紊亂的研究對象；(ii)患有這種疾病或紊亂的研究對象，該研究對象的這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果被監(jiān)測；(iii)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象；(iv)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象，所述研究對象的針對這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果的治療被監(jiān)測；(v)未患這種疾病或紊亂的研究對象；(vi)同一研究對象在疾病或紊亂發(fā)作之前或在對疾病或紊亂治療開始之前，以及(vii)同一研究對象在疾病或紊亂早期或晚期，或在對疾病或紊亂治療的早期或晚期，或在疾病或紊亂發(fā)作之前。
71.一種如權(quán)利要求70所述的方法，其中所研究的一種或多種形式的因子XIIa采用權(quán)利要求1～56中任何一項所述的方法檢測或測定。
72.一種如權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的方法，其中這種疾病或紊亂是權(quán)利要求58～64中任何一項所定義的疾病或紊亂。
73.一種如權(quán)利要求62或權(quán)利要求63所述的方法，其中的治療為權(quán)利要求65～66中所定義的治療。
74.一種如權(quán)利要求70～73所述的方法，其中的樣品是權(quán)利要求67～69中任何一項所定義的樣品。
75.一種如權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的方法，其中樣品獲自某因懷疑為心肌梗塞而入院的剛住院或住院后的個體，并且其中低水平的特定形式的因子XIIa與繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件風(fēng)險增高有關(guān)。
76.一種如權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的方法，其中樣品獲自某因懷疑為心肌梗塞而入院的剛住院或住院后的個體，并且其中高水平的特定形式的因子XIIa與繼發(fā)肌鈣蛋白陽性事件風(fēng)險增高有關(guān)。
77.一種如權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的方法，其中樣品獲自因某懷疑為心肌梗塞而入院的剛住院或住院后的個體，并且其中低水平的特定形式的因子XIIa與死亡風(fēng)險增高有關(guān)。
78.一種如權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的方法，其中樣品獲自因某懷疑為心肌梗塞而入院的剛住院或住院后的個體，并且其中高水平的特定形式的因子XIIa與死亡風(fēng)險增高有關(guān)。
79.一種如權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的方法，其中高水平的特定形式的因子XIIa與膿毒有關(guān)。
80.一種方法，所述方法包括對從患有某種疾病或紊亂或?qū)δ撤N疾病或紊亂進(jìn)行治療的個體獲得的樣品開展一系列測試，并選擇一個能提供與疾病或紊亂或其治療有關(guān)聯(lián)的因子XIIa水平信息的測試。
81.一種方法，所述方法提供一個使因子XIIa可以為某些疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、監(jiān)測或預(yù)測，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的人的治療提供相關(guān)信息的實驗；包括對從患有某疾病或紊亂或在治療的研究對象獲得的樣品開展一系列實驗，并確定哪個(些)實驗提供的因子XIIa水平與這種疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、監(jiān)測或預(yù)測，或這種疾病或紊亂的治療有關(guān)聯(lián)。
82.一種如權(quán)利要求81所述的方法，包括將從患有某疾病或紊亂或在治療的研究對象獲得的樣品中測得的結(jié)果與同樣方法測得的如下一或多個樣品的結(jié)果進(jìn)行比較(i)患有這種疾病或紊亂的研究對象；(ii)患有這種疾病或紊亂的研究對象，該研究對象的疾病或紊亂的過程或結(jié)果被監(jiān)測；(iii)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象；(iv)患有這種疾病或紊亂并在接受治療的研究對象，該研究對象的針對這種疾病或紊亂的過程或結(jié)果的治療被監(jiān)測；(v)未患這種疾病或紊亂的研究對象；(vi)同一研究對象在這種疾病或紊亂發(fā)作之前或在對這種疾病或紊亂治療開始之前，以及(vii)同一研究對象在這種疾病或紊亂早期或晚期，或在對這種疾病或紊亂治療的早期或晚期，或在這種疾病或紊亂發(fā)作之前。
83.一種如權(quán)利要求80～82所述的方法，其中的測試是權(quán)利要求1～56中任何一項所定義的方法。
84.一種如權(quán)利要求80～83中任何一項所述的方法，其中這種疾病或紊亂是權(quán)利要求58～64中任何一項所定義的疾病或紊亂。
85.一種如權(quán)利要求80～83中任何一項所述的方法，其中的治療是如權(quán)利要求65或權(quán)利66所定義的治療。
86.一種如權(quán)利要求80～85中任何一項所述的方法，其中的樣品是權(quán)利要求67～69中任何一項所定義的樣品。
87.一種如權(quán)利要求80～86中任何一項所述的方法，其所得結(jié)果整理到一個數(shù)據(jù)庫中。
88.一個包含用從一種如權(quán)利要求80～86中任何一項所述的方法得到的結(jié)果的數(shù)據(jù)庫。
89.一種包括從一個研究對象的樣品檢測或測定因子XIIa的方法，其特征在于該樣品為尿樣。
90.一種診斷或監(jiān)測一種疾病或紊亂的方法，或監(jiān)測這種疾病或紊亂的治療的方法，所述方法包括從患有或懷疑患有這種疾病或紊亂的研究對象的尿液中檢測或測定因子XIIa。
91.一種如權(quán)利要求90所述的方法，其中疾病是/或涉及腎功能、腎臟疾病或腎損傷，或者對這些疾病的治療。
92.一種如權(quán)利要求89～91中任何一項所述的方法，其中從這個研究對象得到的結(jié)果與用同樣實驗得到的來源于一種或者多種如下樣品的結(jié)果相比較(i)患有這種疾病的研究對象，如腎功能不全、腎臟疾病或腎損傷；(ii)患有這種疾病的研究對象，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷，所述研究對象的這種疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的過程或結(jié)果被監(jiān)測；(iii)患有這種疾病的研究對象，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷，并在進(jìn)行治療；(iv)患有這種疾病或紊亂，如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷，并在進(jìn)行治療的對象，其這種疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的治療情況的過程或結(jié)果被監(jiān)測；(v)沒有患有如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷之類疾病或紊亂的研究對象；(vi)同一研究對象，在這種疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷發(fā)作前，或在這種疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷的治療開始前；(vii)同一研究對象，在這種疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷或?qū)λ鼈兊闹委煹脑缙诨蛲砥?，或者在這種疾病或紊亂如腎功能不全、腎臟疾病以及腎損傷開始前。
93.一種如權(quán)利要求90～92中任何一項所述的方法，其中測試的方法是權(quán)利要求1～56中任何一項所定義的方法，樣品為尿液。
全文摘要
因子XIIa(活化因子XII)在血液中以多種形式存在。對其不同形式的測量結(jié)果可以為某些疾病或紊亂的感病性、過程或結(jié)果的診斷、監(jiān)測或預(yù)測提供相關(guān)信息，或?qū)加谢驊岩苫加心切┘膊』蛭蓙y的人的治療提供信息。
文檔編號C12Q1/56GK1729399SQ200380106749
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者大衛(wèi)·約翰·普利特查德 申請人:?？宋魉?希爾德診斷有限公司