專利名稱：Tob基因在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物的Tob基因及其編碼產(chǎn)物，及其在診斷和治療記憶力下降、健忘癥等方面用途。此外，本發(fā)明還涉及含Tob蛋白的藥物組合物和保健品，以及Tob作為篩選提高記憶力、治療健忘癥或提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的相關(guān)藥物方面的用途。
已知ErbB-2基因編碼了一個(gè)受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor-type proteintyrosine kinase，RPTK)，在細(xì)胞生長分化方面發(fā)揮重要的作用。它的過量表達(dá)能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，但其中的機(jī)制還有待闡明。
1996年，日本的研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與ErbB-2基因產(chǎn)物p185erbB2相互作用的蛋白分子-Tob(Transducer of ErbB-2)，并克隆了人Tob基因的cDNA序列。Tob與已知的抗增殖因子BTG-1具有一定的同源性。研究顯示，與BTG-1相似，Tob也表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長的作用，但其作用為p185erbB2所拮抗。隨后在人和小鼠，Tob/BTG-1家族的其它成員相繼被發(fā)現(xiàn)，不過其功能研究僅限于抑制細(xì)胞增殖方面。
學(xué)習(xí)和記憶是腦的基本功能。在高等動(dòng)物，海馬是內(nèi)側(cè)顳葉的一個(gè)腦結(jié)構(gòu)，將之損毀后，新的記憶無法形成。海馬的突觸具有很強(qiáng)的可塑性。海馬突觸可被誘導(dǎo)產(chǎn)生及維持長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)，與LTP誘導(dǎo)或維持環(huán)節(jié)相關(guān)的任意一種蛋白質(zhì)的編碼基因被剔除(knockout)后，海馬就不再有LTP現(xiàn)象，并且動(dòng)物也就不能形成記憶。因此，海馬作為學(xué)習(xí)和記憶的重要結(jié)構(gòu)，LTP作為學(xué)習(xí)記憶的突觸機(jī)制，已被廣大神經(jīng)科學(xué)家所接受。
然而，迄今為止對于參與或影響記憶的各種蛋白質(zhì)還知之甚少。因此，本領(lǐng)域迫切需要發(fā)現(xiàn)新的與記憶有關(guān)的蛋白質(zhì)，以及開發(fā)改善記憶或治療健忘癥的藥物。
因此，本發(fā)明的目的就是提供一種與記憶有關(guān)的蛋白-Tob蛋白，及其在診斷、改善、或治療記憶力下降和健忘癥方面的用途。
本發(fā)明的另一目的是提供含有Tob蛋白的藥物組合物、保健品。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個(gè)體的健忘癥易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測該個(gè)體的Tob基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的Tob基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患健忘癥的可能性高于正常人群。
較佳地，被檢測的是人Tob的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常人Tob核苷酸序列比較差異。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種治療健忘癥的方法，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常Tob蛋白。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種提高哺乳動(dòng)物記憶力或運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的方法，包括步驟給需要的對象施用安全有效量的Tob蛋白。
在本發(fā)明第四方面，提供了一種保健品，它含有哺乳動(dòng)物的Tob蛋白或其活性片段。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的哺乳動(dòng)物的Tob蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。較佳地，所述的Tob蛋白選自下組動(dòng)物的Tob蛋白人、大鼠和小鼠。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測健忘癥易感性的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增Tob基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，或者與Tob蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種篩選治療健忘癥或提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的藥物的方法，它包括步驟(1)將Tob基因的cDNA裝入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，制備表達(dá)Tob蛋白的細(xì)胞株(2)向步驟(1)中的表達(dá)Tob蛋白的細(xì)胞株培養(yǎng)液中加入測試化合物，檢測Tob蛋白表達(dá)量的變化；促進(jìn)Tob蛋白表達(dá)量增加的化合物就是治療健忘癥或提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的候選藥物。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種分離的Tob蛋白，它包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在附圖中，

圖1是人、小鼠和大鼠Tob蛋白的保守區(qū)域的比較。圖中，humantob為人Tob；mousetob為小鼠Tob；rattob為大鼠Tob。
圖2是大鼠Tob mRNA的表達(dá)譜。其中1-9各泳道分別是腦、海馬、心臟、腸、腎、肝、肺、肌肉和脾臟。
圖3是大鼠Tob mRNA在海馬中的分布圖。Tob mRNA主要在海馬DG、CA1和CA3區(qū)被檢出。
圖4是小鼠Tob mRNA在腦內(nèi)的分布圖。Tob mRNA主要在海馬及小腦皮層被檢出。
圖5是水迷宮示意圖，圖中的“○”表示隱藏平臺的所在位置。
圖6顯示了Tob基因的反義序列核酸對大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)和記憶保持的影響。
圖7顯示了在對照組和反義核酸組大鼠海馬CA1區(qū)記錄到的LTP。
圖8顯示了在九種不同品系小鼠中，Tob反義核酸序列均對記憶能力有負(fù)面影響。第1組為BALB/c小鼠+鹽水；第2組為BALB/c小鼠+Tob隨機(jī)序列；第3-9組為不同品系小鼠+Tob反義序列。
如本文所用，術(shù)語“Tob蛋白”和“Tob多肽”可互換使用，指在哺乳動(dòng)物的海馬中特異性表達(dá)的、氨基酸序列與人、大鼠或小鼠的Tob氨基酸序列有80％以上，較佳地85％以上，更佳地90％以上同源性的多肽。此外，Tob的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物可用于本發(fā)明。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，不僅克隆了大鼠的Tob cDNA序列，而且還利用不同的動(dòng)物行為學(xué)模型，對Tob基因在學(xué)習(xí)和記憶過程中的功能進(jìn)行了研究。意外地發(fā)現(xiàn)，Tob與記憶以及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力有關(guān)。
以人和小鼠Tob1基因的cDNA保守區(qū)域?yàn)閰⒄赵O(shè)計(jì)了一對引物，通過PCR，在8周大鼠腦cDNA文庫中克隆了一段DNA序列。測序結(jié)果表明，該序列長度為604bp，與人和小鼠Tob1的cDNA相應(yīng)區(qū)域分別具有91％和90％的同源性(圖1)。以該段序列為探針，通過篩選成年大鼠腦cDNA文庫，已克隆到大鼠Tob基因全長cDNA。Northern印跡雜交結(jié)果顯示，大鼠Tob基因的表達(dá)模式與人和小鼠的比較相似(圖2)。原位雜交結(jié)果表明，Tob基因在大鼠海馬的神經(jīng)元中有特異性表達(dá)(圖3)。
以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過水迷宮(Water Maze)和環(huán)境恐懼(Fear-conditioningto Context)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯ob基因進(jìn)行了功能檢測。向海馬CA1區(qū)域定位注射Tob基因反義核酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠Tob基因的反義核酸可顯著抑制大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力(圖6)；抑制CA1區(qū)突觸的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP；圖7)。
以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用Hamilton微量注射器定時(shí)定量將小鼠Tob基因的反義核酸注射到小鼠的側(cè)腦室，并以注射生理鹽水和隨機(jī)序列核酸(Scramble)為對照組，而后考察實(shí)驗(yàn)組與對照組在步下法試驗(yàn)(Step-down Test)中的表現(xiàn)，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組(注射Tob反義核酸組)的記憶能力與對照組相比有顯著性減弱。為了進(jìn)一步證實(shí)Tob基因與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性，選用了9個(gè)不同品系的實(shí)驗(yàn)小鼠對之進(jìn)行功能復(fù)篩。結(jié)果表明，Tob基因反義核酸在各品系中均能顯著地抑制小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(圖8)。
此外，鑒于Tob mRNA在小腦皮層中的特異性表達(dá)，提示Tob蛋白與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力有關(guān)(圖4)。
根據(jù)蛋白質(zhì)同源性比較，人類的Tob蛋白與小鼠和大鼠Tob蛋白高度同源(相同性在90％以上)。哺乳動(dòng)物Tob蛋白的結(jié)構(gòu)以及組織分布的特異性均提示，Tob蛋白在不同的哺乳動(dòng)物中具有相同的功能，即可改善記憶力并且提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。因此人類的Tob蛋白同樣與人的記憶力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力有關(guān)，根據(jù)人Tob基因及其表達(dá)產(chǎn)物設(shè)計(jì)的藥物和診斷治療技術(shù)，可用于診斷和治療人類的健忘癥，并可改善記憶和提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。
Tob核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已知的人Tob、小鼠Tob或本發(fā)明所公開大鼠Tob的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
可用于本發(fā)明的Tob蛋白可通過將相應(yīng)的編碼序列引入宿主細(xì)胞(直接引入或通過引入含Tob編碼序列的載體)，并在合適的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)Tob蛋白，然后分離和純化出Tob蛋白。
具體而言，本發(fā)明的Tob蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療Tob蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如記憶力下降)，和用于篩選促進(jìn)Tob蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組Tob蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人Tob蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對Tob DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于Tob基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與Tob基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制Tob蛋白的分子，也包括那些并不影響Tob蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的Tob基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)Tob蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的各類抗體可以利用例如人、大鼠或小鼠Tob基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與Tob基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗Tob蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的Tob蛋白。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用Tob蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，羊等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Tob蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。在篩選時(shí)，可以將Tob蛋白加入生物分析測定中，通過測定化合物影響Tob蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。此外，還可將測試化合物與Tob蛋白一起施用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與對照相比存在動(dòng)物記憶力的變化就表明，該化合物是Tob蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑。
此外，還可將Tob基因的cDNA裝入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，制備高表達(dá)Tob蛋白的細(xì)胞株并以此細(xì)胞株中的Tob蛋白為靶位點(diǎn)，篩選對Tob蛋白有激活或抑制作用的藥物。并向所述的表達(dá)Tob蛋白的細(xì)胞株培養(yǎng)液中加入測試化合物，檢測Tob蛋白表達(dá)量的變化。促進(jìn)Tob蛋白表達(dá)的化合物就是治療健忘癥的候選藥物，而抑制促進(jìn)Tob蛋白表達(dá)的化合物可用作使人們忘記不希望要的回憶的藥物。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、或局部給藥。
正常的Tob多肽可直接用于疾病治療，例如，用于健忘癥方面的治療。在使用本發(fā)明Tob蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療健忘癥的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Tob蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的Tob蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
Tob蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于Tob蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的Tob蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶Tob基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人Tob基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測Tob蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的Tob蛋白水平，可以用作解釋Tob蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Tob蛋白起作用的疾病。
一種檢測樣品中是否存在Tob蛋白的方法是利用Tob蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與Tob蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Tob蛋白。
Tob蛋白的多聚核苷酸可用于Tob蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，Tob蛋白的多聚核苷酸可用于檢測Tob蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下Tob蛋白的異常表達(dá)。如Tob DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷Tob蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用Tob蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測Tob基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測Tob基因的突變也可用于診斷Tob蛋白相關(guān)的疾病。Tob蛋白突變的形式包括與正常野生型Tob DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的Tob蛋白不僅可用于治療記憶力下降或有缺陷的對象，也可用于提高正常個(gè)體的記憶力。因此，本發(fā)明還提供了一種保健品，它含有哺乳動(dòng)物的Tob蛋白或其活性片段。本發(fā)明保健品，可通過保健品領(lǐng)域常規(guī)的方法，通過將哺乳動(dòng)物的Tob蛋白或其活性片段與合適的稀釋劑、食品等混合在一起而制備。優(yōu)選的保健品是片劑、顆粒劑、口服劑形式。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例實(shí)施例1大鼠Tob cDNA序列的獲得以人和小鼠Tob1基因的cDNA保守區(qū)域?yàn)閰⒄赵O(shè)計(jì)了引物，通過PCR，在8周大鼠腦cDNA文庫(用常規(guī)方法構(gòu)建)中克隆了一段DNA序列。以該段序列為探針，通過篩選8周大鼠腦cDNA文庫，得到了大鼠Tob1基因全長cDNA。測序結(jié)果表明，該cDNA長度為2024bp，具體序列如SEQ ID NO1所示。其中，開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)為146～1243bp，編碼的大鼠Tob1蛋白含有365aa，序列如下MQLEIQVALN FIISYLYNKL PRRRVNIFGE ELERLLKQKY EGHWYPEKPY KGSGFRCIHV 60GEKVDPVIEQ ASKESGLDID DVRGNLPQDL SVWIDPFEVS YQIGEKGPVK VLYVDDSNEN 120GCELDKEIKN SFNPEAQVFM PISDPASSVS SSPSPPFGHS AAVSPTFMPR STQPLTFTTA 180TFAATKFGST KMKNSGRSSK VARTSPISLG LNVNVNDLLK QKAISSSMHS LYGLGLGSQQ 240QPQPQPQQPP SQPPPPPPPP QQQQQHQQQQ QQQQQQQQQP QQQTSALSPN AKEFIFPNMQ 300GQGSSTNGMF PGDSPLNLSP LQYSNAFNVF AAYGGLNEKS FVDGLNFSLN NIQYSNQQFQ 360PVMAN 365(SEQ ID NO2)同源比較表明，人、小鼠、大鼠Tob有很高的同源性。
1.cDNA的同源性大鼠Tob1基因cDNA與人和小鼠Tob1的cDNA在DNA水平上分別具有90％和93％的同源性。
2.蛋白質(zhì)的同源性大鼠Tob1蛋白與人和小鼠Tob1蛋白在氨基酸水平上分別具有97％和95％的同源性。
實(shí)施例2Tob的組織分布Northern印跡法提取大鼠各種組織的總RNA，變性膠電泳后將RNA轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，該膜與α-32P-dATP標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，最后通過放射自顯影顯示雜交結(jié)果，得知目的基因在不同組織中的表達(dá)分布情況。
Northern印跡雜交結(jié)果顯示，大鼠Tob1基因的表達(dá)模式與人和小鼠的比較相似(圖2)。
實(shí)施例3Tob在腦中的分布原位雜交按常規(guī)方法，對動(dòng)物腦組織樣品用多聚甲醛固定后制作石蠟包埋切片，組織切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、固定、消化、后固定、預(yù)雜交等過程，與地高辛(Digoxin)標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，之后通過堿性磷酸酶連接的抗地高辛抗體檢測目的基因在腦中的分布。
原位雜交結(jié)果表明，Tob1基因在大鼠海馬的神經(jīng)元中有特異性表達(dá)(圖3)。這與小鼠中Tob基因的分布情況相同(圖4)。
實(shí)施例4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及環(huán)境迷宮直徑＝150cm，高＝45cm；平臺直徑＝10cm，浸入水面約2cm；攝像機(jī)、采樣設(shè)備和軟件；水溫24-27℃，加入對大鼠無害的染料；使大鼠看不到隱藏在水面下的平臺。
二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和核酸序列雄性SD大鼠，體重為180g-210g。分為三組，Tob-反義核酸序列組8只；隨機(jī)核酸序列組8只；空白對照組(10只)。
Tob反義核酸序列(1)5’-act tgg att tca agc tgc at-3’(2)5’-act tct cgt tga ggc ctc cg-3’隨機(jī)核酸序列5’-gac tga cat gcg att gag ct-3’
三、手術(shù)在大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)埋植引導(dǎo)管，用于行為實(shí)驗(yàn)給藥，大鼠手術(shù)后7-12天，進(jìn)Morris水迷宮訓(xùn)練。
四、給藥在行為訓(xùn)練前6小時(shí)在CA1區(qū)給藥。Tob-反義序列和隨機(jī)序列的濃度均為1nmol/ul，劑量為每側(cè)CA1區(qū)1.5μl。
五、訓(xùn)練方法每次訓(xùn)練將大鼠分別從水迷宮的四個(gè)位置(如圖5所示)，面向缸壁，隨機(jī)放入(但確保大鼠從每個(gè)位置出發(fā)的機(jī)會是均等的)。讓它在水中搜索60s，如果找到平臺，就讓它在平臺上停留30s，然后放回籠子休息30s后，進(jìn)行下一次訓(xùn)練；如果沒有找到平臺，就人為地將它引導(dǎo)到平臺上，停留60s后，開始下一次訓(xùn)練。訓(xùn)練分兩步進(jìn)行，每只大鼠連續(xù)訓(xùn)練6次后，休息1小時(shí)，再進(jìn)行下一步的訓(xùn)練，一共訓(xùn)練12次。記錄大鼠找到平臺所需要的時(shí)間。
六、測試方法1.隱藏平臺的測試方法訓(xùn)練后48小時(shí)進(jìn)行測試，目的是為了檢測大鼠的記憶保持能力。測試一共進(jìn)行3次，每次大鼠從一個(gè)固定的位置出發(fā)，同樣是在水中搜尋60s。如果在60s內(nèi)找到平臺；就將它立即放回籠子，休息60s后，開始下一次測試；如果在規(guī)定60秒時(shí)間內(nèi)沒有找到平臺，就將它引導(dǎo)到平臺上停留30s后，放回籠子休息30s，然后開始下一次測試，同樣記錄大鼠找到平臺所需要的時(shí)間。
2.露出平臺的測試方法本測試是在所有測試結(jié)束后；將平臺露出水面進(jìn)行的。目的是為了觀察大鼠是否有視覺認(rèn)知方面的障礙，從而影響它尋找平臺的能力。測試一共進(jìn)行3次，每次大鼠都從一個(gè)固定的位置出發(fā)，但是露出平臺的位置卻是隨機(jī)變動(dòng)的。每次測試先將大鼠放在平臺上適應(yīng)30s，然后從固定的位置放入水中，搜尋60s。如果在60s內(nèi)找到平臺，就立即放回籠子休息60s后，開始下一次測試，如果沒有找到平臺，就將它從水中取出，放回籠子休息60s后開始下一次測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三組大鼠在平臺上適應(yīng)30s后，都可以迅速找到平臺，組間無顯著性差異。
七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。橫坐標(biāo)是訓(xùn)練次數(shù)及48小時(shí)記憶檢測，縱坐標(biāo)是大鼠找到平臺所需要的時(shí)間(為3次訓(xùn)練或檢測的平均值)。雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Tob基因的反義核酸序列后，大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)速度顯著減慢，48小時(shí)記憶保持能力也相應(yīng)降低。
實(shí)施例5海馬CA1區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)電生理記錄在該實(shí)施例中，將Tob基因的反義序列、隨機(jī)序列核酸或生理鹽水局部注射到大鼠海馬的CA1區(qū)，觀察其對CA1區(qū)突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(Long-termpotentiation，LTP)的影響，從海馬突觸可塑性的角度研究Tob基因在學(xué)習(xí)和記憶中的作用。
一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和核酸序列雄性SD大鼠，體重為200-250g。分為三組，Tob-反義核酸序列組8只；隨機(jī)核酸序列組8只；生理鹽水對照組6只。
Tob反義核酸序列(1)5’-act tgg att tca agc tgc at-3’(2)5’-act tct cgt tga ggc ctc cg-3’隨機(jī)核酸序列5’-gac tga cat gcg att gag ct-3’二、手術(shù)用烏拉坦(1250mg/kg體重，腹腔注射)麻醉大鼠。然后把大鼠固定在立體定位儀上。切開頭皮。清潔顱骨表面。分別在P4.9L3.8和P3.4L2.8兩個(gè)位點(diǎn)鉆直徑1.5mm的孔，P4.9L3.8處的孔用于插刺激電極，P3.4L2.8處的孔用于插記錄電極。室內(nèi)溫度保持在25度，動(dòng)物體溫保持在37度。
三、刺激和記錄電極刺激電極為同心圓電極，即在不銹鋼針管內(nèi)套1根漆包線，針管內(nèi)徑與漆包線直徑為0.2mm。記錄電極為單極電極，用1根直徑為0.2mm的漆包線制成。記錄電極和1根不銹鋼管(外徑0.7mm，內(nèi)徑為0.4mm)粘在一起。注射藥物的針頭通過此不銹鋼管到達(dá)記錄部位。
四、電位記錄1、電極的定位將刺激電極定位在海馬的Shaffer通路，把記錄電極定位在CA1區(qū)。以單脈沖方波(波寬50us)刺激Shaffer通路，在CA1記錄最佳興奮性突觸后電位(EPSP)。
2、給藥方法通過記錄電極旁的不銹鋼管把藥物注射針頭插到記錄部位，以0.2ul/min的速度將濃度為1.0nmol的反義序列核酸1.0ul或濃度為1.0nmol的隨機(jī)序列核酸1.0ul或生理鹽水1.0ul注射到記錄部位，9個(gè)小時(shí)后再注射1.0ul。
3、最佳刺激強(qiáng)度選擇單脈沖方波(波寬50us)刺激Shaffer通路，并從小到大調(diào)整刺激強(qiáng)度(100-800uA)，記錄不同刺激強(qiáng)度下的EPSP，并作刺激反應(yīng)強(qiáng)度曲線。以引起最大EPSP反應(yīng)的刺激強(qiáng)度的2/3，為最佳刺激強(qiáng)度。
4、電位的記錄第2次注射的2.5小時(shí)后，以最佳強(qiáng)度的單個(gè)電脈沖(50us)刺激Shaffer通路，記錄CA1區(qū)的EPSP反應(yīng)，每1分鐘刺激和記錄1次，連續(xù)30min。然后對Shaffer通路進(jìn)行強(qiáng)直刺激(20個(gè)電脈沖串，脈沖間隔5us，共3串刺激，每串間隔30s)。強(qiáng)直刺激后，同樣以最佳強(qiáng)度的單個(gè)電脈沖(50us)刺激Shaffer通路，記錄CA1區(qū)的EPSP反應(yīng)，每1分鐘刺激和記錄1次，連續(xù)6小時(shí)。強(qiáng)直刺激時(shí)的時(shí)間正好是第1次給藥后的12小時(shí)，第2次給藥后的3小時(shí)。6小時(shí)記錄結(jié)束后，以同樣的參數(shù)再次對Shaffer通路進(jìn)行強(qiáng)直刺激，然后，同樣以最佳強(qiáng)度的單個(gè)電脈沖(50us)刺激Shaffer通路，記錄CA1區(qū)的EPSP反應(yīng)，每1分鐘刺激和記錄1次，連續(xù)1小時(shí)。
五、數(shù)據(jù)處理與分析把連續(xù)5次或10次記錄到EPSP波形進(jìn)行平均疊加，計(jì)算平均疊加后的EPSP電位的上升相的斜率。以強(qiáng)直刺激前的EPSP斜率的平均值為100％，計(jì)算強(qiáng)直刺激前、后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的EPSP斜率。用EPSP斜率對時(shí)間作圖。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。注射Tob基因的反義核酸后，CA1區(qū)突觸電位的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)顯著地小于隨機(jī)序列對照組或生理鹽水對照組的LTP，提示CA1的Tob基因參與長時(shí)程增強(qiáng)的誘導(dǎo)和維持。
實(shí)施例6步下法試驗(yàn)測定Tob基因?qū)π∈笥洃浤芰Φ挠绊懖较滦袨榭捎貌较路?Step Down Test)[陳雙雙，管林初，鮑世民，金玫蕾，四種不同品系小鼠曠場行為和記憶的比較研究，心理科學(xué)1994年第17卷第1期，39-41頁]進(jìn)行測試實(shí)驗(yàn)裝置為20×20×30cm的透明塑料箱，箱底為金屬電路板，左角放置一個(gè)8×8×1.5cm的平臺為安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)開始前先進(jìn)行訓(xùn)練將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)自由活動(dòng)1分鐘，然后將小鼠輕輕趕上小平臺(一般情況下小鼠很快會從平臺上下來)，記錄小鼠從完全登上小平臺到下來時(shí)的間隔秒數(shù)(潛伏期)。連續(xù)重復(fù)3次后，再將小鼠趕上小平臺，并將箱底的電路板立即通電(50V，0.5mA)。當(dāng)小鼠再次跳下小平臺受到電擊后，即跳回平臺以逃避電擊，此時(shí)則視為訓(xùn)練完畢，將小鼠取出放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練后24小時(shí)再將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)的小平臺上，箱底的電路板不通電，記錄小鼠從放上小平臺到下來的間隔期秒數(shù)。訓(xùn)練后48小時(shí)再同樣記錄一次間隔期時(shí)間。為了更好地觀察和評價(jià)動(dòng)物的記憶行為，參照有關(guān)文獻(xiàn)增加了訓(xùn)練次數(shù)和48小時(shí)后的觀察。
在本實(shí)施例中，所用的第1組為BALB/c小鼠+鹽水；第2組為BALB/c小鼠+隨機(jī)序列核酸；第3-9組為不同品系小鼠+Tob反義序列核酸。Tob反義核酸序列和隨機(jī)核酸序列與實(shí)施例4相同。
結(jié)果如圖8A(24小時(shí))和8B所示(48小時(shí))，反義核酸實(shí)驗(yàn)組的記憶能力與對照組相比有顯著性減弱，且在各品系小鼠中均能顯著地抑制小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所中國科學(xué)院上海生理研究所中國科學(xué)院上海生物工程研究中心<120>Tob基因在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能及其應(yīng)用<130>005781<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2024<212>DNA<213>大鼠<220><221>CDS<222>(146)..(1243)<400>1gaccacggaa ggttgaagga taatcttcta gtaccagcac tttgaatgag aatttgtttc 60tctgccacaa actgattttt ttttttaaat tttatttttc tggtggagga gttgaaacaa 120acctaccttt tgtggcatcg cagct atg cag ctt gaa att caa gta gca cta172Met Gln Leu Glu Ile Gln Val Ala Leu1 5aat ttt att att tcc tat ttg tac aat aag ctt ccc agg aga cgt gtc220Asn Phe Ile Ile Ser Tyr Leu Tyr Asn Lys Leu Pro Arg Arg Arg Val10 15 20 25aac att ttt ggt gaa gaa ctt gaa aga ctt ctt aaa cag aaa tat gaa268Asn Ile Phe Gly Glu Glu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Gln Lys Tyr Glu30 35 40ggg cat tgg tat cct gag aag cca tac aaa ggc tca ggg ttt aga tgc316Gly His Trp Tyr Pro Glu Lys Pro Tyr Lys Gly Ser Gly Phe Arg Cys45 50 55ata cac gta ggg gag aag gtg gac ccg gtg atc gag caa gcg tcc aaa 364Ile His Val Gly Glu Lys Val Asp Pro Val Ile Glu 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Phe Pro Gly Asp Ser Pro Leu Asn Leu Ser Pro305 310 315 320Leu Gln Tyr Ser Asn Ala Phe Asn Val Phe Ala Ala Tyr Gly Gly Leu325 330 335Asn Glu Lys Ser Phe Val Asp Gly Leu Asn Phe Ser Leu Asn Asn Ile340 345 350Gln Tyr Ser Asn Gln Gln Phe Gln Pro Val Met Ala Asn355 360 36權(quán)利要求
1.一種對個(gè)體的健忘癥易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個(gè)體的Tob基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的Tob基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患健忘癥的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的是人Tob基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常人Tob核苷酸序列比較差異。
3.一種治療健忘癥的方法，其特征在于，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常Tob蛋白。
4.一種提高哺乳動(dòng)物記憶力或運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的方法，其特征在于，包括步驟給需要的對象施用安全有效量的Tob蛋白。
5.一種保健品，其特征在于，它含有哺乳動(dòng)物的Tob蛋白或其活性片段。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的哺乳動(dòng)物Tob蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的Tob蛋白選自下組動(dòng)物的Tob蛋白人、大鼠和小鼠。
8.一種檢測健忘癥易感性的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增Tob基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，或者與Tob蛋白特異性結(jié)合的抗體。
9.一種篩選治療健忘癥的藥物的方法，其特征在于，它包括步驟(1)將Tob基因的cDNA裝入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，制備表達(dá)Tob蛋白的細(xì)胞株(2)向步驟(1)中的表達(dá)Tob蛋白的細(xì)胞株培養(yǎng)液中加入測試化合物，檢測Tob蛋白表達(dá)量的變化；促進(jìn)Tob蛋白表達(dá)量增加的化合物就是治療健忘癥的候選藥物。
10.一種分離的Tob蛋白，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物的Tob基因及其編碼產(chǎn)物,及其在診斷和治療記憶力下降、健忘癥等方面用途。此外,本發(fā)明還涉及含Tob蛋白的藥物組合物和保健品,以及Tob作為篩選提高記憶力、治療健忘癥或提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的相關(guān)藥物方面的用途。
文檔編號G01N33/566GK1370843SQ01105448
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者景乃禾, 李葆明, 金玫蕾, 高翔, 王新明, 郭寧, 涂艷陽, 張雪寒 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所, 中國科學(xué)院上海生理研究所, 中國科學(xué)院上海生物工程研究中心