專利名稱：梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀，屬生物測量儀器。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有熒光相關(guān)譜儀利用測量微區(qū)內(nèi)少量發(fā)光分子的熒光漲落信號，獲得熒光粒子濃度、擴散速度等影響漲落的物理機制信息。熒光關(guān)聯(lián)譜目前主要應用包括測量生物分子的結(jié)構(gòu)變化、微觀化學反應、細胞內(nèi)酶動力學過程，等等。這些測量可以針對溶液體系，也可以針對活細胞?，F(xiàn)有技術(shù)基本測量裝置如圖1所示。其工作原理為熒光激發(fā)光(8)經(jīng)過衰減片(9)、全反射鏡(12)，再透過雙色分束片(2)，經(jīng)過高數(shù)值孔徑顯微鏡頭(1)聚焦在溶液或活細胞樣品(3)中，焦點(7)的體積一般遠遠小于一個立方微米。這個區(qū)域內(nèi)少量熒光粒子所發(fā)出的背向熒光被顯微鏡頭(1)收集，經(jīng)過雙色分束片(2)時被反射，與被散射的激發(fā)光分開。熒光經(jīng)過濾光片(4)后進一步去除散射的激發(fā)光和其他雜光，然后由透鏡(5)聚焦于共焦小孔(6)上，共焦小孔產(chǎn)生的空間濾波可以抑制焦點區(qū)(7)以外的熒光以及雜散光，焦點區(qū)中分子所發(fā)出的熒光信號被光子計數(shù)器(10)接受，并輸入到信號系統(tǒng)(11)進行信號采集與處理。信號系統(tǒng)對光子計數(shù)數(shù)據(jù)進行自相關(guān)函數(shù)運算，獲得自相關(guān)函數(shù)，然后利用最小二乘法擬合實驗數(shù)據(jù)，從而獲得熒光粒子的擴散系數(shù)和焦點區(qū)域內(nèi)熒光粒子數(shù)目等一系列參數(shù)。
上述裝置的測量過程包括兩個關(guān)鍵步驟通過硬件獲得激光焦點區(qū)域中少量熒光分子產(chǎn)生的光子計數(shù)信號；通過軟件擬合獲得待測分子的一些參數(shù)。該方法的主要缺陷是實驗中幾乎沒有可調(diào)節(jié)的參數(shù)。一旦實驗體系確定，擬合過程中的實驗參數(shù)基本不能變化。當測量成分比較復雜的體系時，很難區(qū)分不同實驗參數(shù)對測量結(jié)果的影響。并且，該方法沒有考慮待測分子與激光場的非熒光相互作用。當進行雙光子激發(fā)熒光測量時，高強度激光產(chǎn)生的梯度場可能影響分子的運動，從而使測量結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)誤差。另外，該方法只能測量與分子運動有關(guān)的參數(shù)，如結(jié)構(gòu)和質(zhì)量，不能測量與分子電子態(tài)分布有關(guān)的參數(shù)，如極化率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設計一種梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀，在已有的測量裝置中加入另一束激光，產(chǎn)生梯度場，影響焦點區(qū)內(nèi)分子的運動狀態(tài)，以完成熒光關(guān)聯(lián)譜儀的全部測量功能，同時通過一個強度可調(diào)的激光梯度場，對溶液樣品中待測生物分子或粒子的擴散運動進行控制，測量分子的極化特征以及與極化有關(guān)的生化過程，并且適合于包含多種組分體系的測量。
本發(fā)明設計的梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀，包括顯微物鏡、第一雙色分束片、濾光片、聚焦透鏡、共焦小孔、激發(fā)激光衰減片、單原子探測器和信號采集與處理系統(tǒng)，還包括第二雙色分束片和紅外激光衰減片；熒光激發(fā)光經(jīng)激發(fā)激光衰減片、第二雙色分束片反射，反射光透過第一雙色分束片后由顯微物鏡聚焦到被測樣品內(nèi)的某一點，激發(fā)該點內(nèi)的分子產(chǎn)生熒光，該熒光經(jīng)物鏡收集后再經(jīng)第一雙色分束片反射，進而透過濾光片，由聚焦透鏡匯聚到共焦小孔，經(jīng)過共焦小孔的熒光由單光子探測器接收，單光子探測器產(chǎn)生的光子接收信號進入信號采集和處理系統(tǒng)；紅外激光經(jīng)紅外激光衰減片后透過第二雙色分束片，與前述的激發(fā)激光合束，然后透過第一雙色分束片，再由顯微物鏡聚焦到樣品內(nèi)的上述同一點，產(chǎn)生的激光梯度場對樣品中該點處的分子運動產(chǎn)生控制作用。
本發(fā)明設計的梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀，由于引入了可以獨立調(diào)節(jié)的物理參數(shù)，本儀器能夠區(qū)分不同實驗因素對測量結(jié)果的影響。新的實驗裝置不但能夠完成現(xiàn)有熒光關(guān)聯(lián)譜測量裝置的全部功能，并且能夠定量測量粒子的極化率及其變化，以及測量影響極化率變化的一些生物過程，如氧化一還原反應。同時，本儀器適合于對包含多種組分的樣品進行測量。


圖1是已有技術(shù)中熒光關(guān)聯(lián)譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明設計的梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖1和圖2中，1是顯微物鏡，2是第一雙色分束片，3是樣品，4是濾光片，5是聚焦透鏡，6是共焦小孔，7是激光聚焦點，8是熒光激發(fā)激光，9是激發(fā)激光衰減片，10是單光子探測器，11是信號采集與處理系統(tǒng)，12是45°全反射鏡，13是第二雙色分束片，14是紅外激光衰減片，15是紅外激光。
具體實施例方式本發(fā)明實驗裝置如圖2所示本發(fā)明設計的梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀，包括顯微物鏡1、第一雙色分束片2、濾光片4、聚焦透鏡5、共焦小孔6、激發(fā)激光衰減片9、單原子探測器10和信號采集與處理系統(tǒng)，還包括第二雙色分束片13和紅外激光衰減片14。熒光激發(fā)光經(jīng)激發(fā)激光衰減片9、第二雙色分束片13反射，反射光透過第一雙色分束片2后由顯微物鏡1聚焦到被測樣品3內(nèi)的某一點7，激發(fā)該點內(nèi)的分子產(chǎn)生熒光，該熒光經(jīng)物鏡1收集后再經(jīng)第一雙色分束片2反射，進而透過濾光片4，由聚焦透鏡5匯聚到共焦小孔6，經(jīng)過共焦小孔6的熒光由單光子探測器10接收，單光子探測器產(chǎn)生的光子接收信號進入信號采集和處理系統(tǒng)11紅外激光經(jīng)紅外激光衰減片14后透過第二雙色分束片13，與前述的激發(fā)激光合束，然后透過第一雙色分束片2，再由顯微物鏡1聚焦到樣品內(nèi)的上述同一點7，產(chǎn)生的激光梯度場對樣品中該點處的分子運動產(chǎn)生控制作用。
本發(fā)明的發(fā)明點在于在全反射鏡(12)的位置改放一個雙色分束片(13)。一臺紅外激光器提供紅外連續(xù)激光束(15)，它的強度可以通過更換衰減片(13)進行控制。紅外激光(15)與用于進行熒光關(guān)聯(lián)譜測量的可見激光(8)通過雙色分束片(13)進行合束，并由成像系統(tǒng)聚焦于樣品(3)中同一個探測點(7)。由于熒光關(guān)聯(lián)測量采用的顯微光學體系(圖中虛線框標出部分)是消色差系統(tǒng)，本發(fā)明中采用的光路可以利用少量的光學器件保證兩束激光的焦點完全重合，實驗調(diào)節(jié)很簡單，并且使數(shù)據(jù)擬合過程簡化。紅外激光的波長應選擇在800納米附近，探測區(qū)內(nèi)激光能量控制在30毫焦以下。這可以使溶液中水分子的吸收最小，并且避免待測分子產(chǎn)生單光子和雙光子熒光激發(fā)。當紅外激光產(chǎn)生的梯度場與分子的熱運動勢接近時，分子的布朗運動收到擾動，其大小與激光的強度、空間分布和粒子的極化率有關(guān)。在實驗中，針對同樣實驗條件，通過選擇不同衰減片，調(diào)節(jié)紅外激光的能量，能夠獲得對應不同梯度場的一系列熒光關(guān)聯(lián)譜，使數(shù)據(jù)量加大。梯度場強度的變化完全獨立于其他實驗參數(shù)，使本儀器增強了區(qū)分不同實驗參數(shù)影響的能力。我們已經(jīng)從理論上推導出了包括梯度場影響的模擬公式。
下面介紹本發(fā)明的一個實施例。利用一臺自制的熒光關(guān)聯(lián)譜測量裝置和一臺超快激光系統(tǒng)，測試中超快激光工作于失鎖模狀態(tài)，輸出為800nm左右連續(xù)激光。到達探測區(qū)內(nèi)的梯度場激光最大功率為20mW。(實際應用中可以采用二極管激光器，結(jié)構(gòu)簡單并且十分便宜。)熒光激發(fā)光源為一臺氬離子激光器.波長為488nm，最大輸出功率為7mW。兩束激光功率強度可通過衰減片分別進行控制。實驗中光學系統(tǒng)(圖中虛線框中部分)為倒置式熒光顯微鏡，測量時采用數(shù)值孔徑為1.4的平場消色差油浸鏡頭。由于整個光學系統(tǒng)消色差性能很好，兩束激光束在樣品中的會聚點完全重合。
測量中采用的樣品為摻有熒光分子的聚苯乙烯小球，直徑分別為20，40和110nm，其吸收光譜峰位于500nm附近，熒光譜峰位于515nm附近。實驗顯示800nm的紅外連續(xù)激光不能在熒光小球上產(chǎn)生單光子或雙光子熒光激發(fā)。實驗發(fā)現(xiàn)，激光梯度場對粒子運動的影響明顯存在。微粒的極化率越大，激光梯度場的強度越大，粒子運動的影響就越大。采用20nm熒光小球，當梯度場激光的功率達到毫瓦時，小球的布朗運動受到明顯影響。由于實際應用中許多生物分子的極化率大于20nm熒光小球，該實驗結(jié)果證明可以利用本方法對生化分子的極化率進行測量。
權(quán)利要求
1.一種梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀，包括顯微物鏡、第一雙色分束片、濾光片、聚焦透鏡、共焦小孔、激發(fā)激光衰減片、單原子探測器和信號采集與處理系統(tǒng)，其特征在于還包括第二雙色分束片和紅外激光衰減片；熒光激發(fā)光經(jīng)激發(fā)激光衰減片、第二雙色分束片反射，反射光透過第一雙色分束片后由顯微物鏡聚焦到被測樣品內(nèi)的某一點，激發(fā)該點內(nèi)的分子產(chǎn)生熒光，該熒光經(jīng)物鏡收集后再經(jīng)第一雙色分束片反射，進而透過濾光片，由聚焦透鏡匯聚到共焦小孔，經(jīng)過共焦小孔的熒光由單光子探測器接收，單光子探測器產(chǎn)生的光子接收信號進入信號采集和處理系統(tǒng)；紅外激光經(jīng)紅外激光衰減片后透過第二雙色分束片，與前述的激發(fā)激光合束，然后透過第一雙色分束片，再由顯微物鏡聚焦到樣品內(nèi)的上述同一點，產(chǎn)生的激光梯度場對樣品中該點處的分子運動產(chǎn)生控制作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種梯度場熒光關(guān)聯(lián)譜儀,包括顯微物鏡、聚焦透鏡、激發(fā)激光衰減片、單原子探測器和信號采集與處理系統(tǒng)等,還包括第二雙色分束片和紅外激光衰減片。熒光激發(fā)光經(jīng)激發(fā)激光衰減片和第二雙色分束片反射,最后被聚焦到被測樣品內(nèi)的某一點,激發(fā)該點內(nèi)的分子產(chǎn)生熒光,該熒光經(jīng)物鏡收集后再經(jīng)反射、濾光,匯聚到共焦小孔,再由單光子探測器接收,產(chǎn)生的光子接收信號進入處理系統(tǒng)。紅外激光經(jīng)衰減后透過第二雙色分束片,與前述的激發(fā)激光合束,然后透過第一雙色分束片,再聚焦到樣品內(nèi)的上述同一點,產(chǎn)生的激光梯度場對樣品中該點處的分子運動產(chǎn)生控制作用。本發(fā)明的儀器能夠完成現(xiàn)有熒光關(guān)聯(lián)譜測量裝置的全部功能,并能測量粒子的極化率及其變化。
文檔編號G01N33/52GK1336541SQ0114202
公開日2002年2月20日 申請日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者馬輝, 丁堯, 孟凡波, 陳波, 金雷, 陳瓞延 申請人:清華大學