專利名稱：一種新型抗原檢測方法及利用該方法制成的檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型抗原檢測方法，具體涉及一種利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基建立的抗原檢測方法。本發(fā)明還涉及利用該方法制成的檢測裝置。
背景技術(shù)：
抗原檢測是通過抗體對抗原分子上特異決定簇的有效識(shí)別來實(shí)現(xiàn)的?？乖瓩z測，特別是蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測對醫(yī)學(xué)研究、后基因組計(jì)劃的完成及臨床檢驗(yàn)具有非常重要的作用。目前，特異識(shí)別抗原的常用技術(shù)是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))，它是通過特異抗體識(shí)別抗原決定簇，并通過連接于抗體上的酶、熒光物質(zhì)、放射性同位素來完成抗原信息的識(shí)別、放大，從而實(shí)現(xiàn)檢測目的。近年來，雖然ELISA檢測方法有了很大的發(fā)展，但是，當(dāng)檢測樣品量有限、抗原濃度極低或抗體效價(jià)不高時(shí)，就無法用傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)進(jìn)行檢測。
隨著PCR擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)，Santo等在1992年建立了免疫PCR技術(shù)(Santo，T.，et al.Science.258120-122)。免疫PCR技術(shù)和ELISA的基本過程相似，只是用連接蛋白將一段可擴(kuò)增的生物素標(biāo)記的DNA分子連接在抗體Fc片段上，并通過PCR技術(shù)將抗原信號(hào)放大、檢出。連接蛋白是鏈霉親和素-蛋白A復(fù)合物，它具有兩個(gè)專一結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)是由鏈霉親和素衍生而來的生物素位點(diǎn)，另一個(gè)是由蛋白A衍生而來的Fc片段結(jié)合位點(diǎn)。DNA片段是生物素化的線性質(zhì)粒DNA(pUC19)?？贵w是正?？贵w。檢測過程是將連接蛋白和生物素化的DNA pUC19以1∶1的摩爾比混合，產(chǎn)生嵌合蛋白-DNApUC19聚合物，再通過連接蛋白上蛋白A位點(diǎn)與抗體Fc段結(jié)合，形成抗體-連接蛋白-DNA片段的復(fù)合體。檢測時(shí)，通過抗原和抗體結(jié)合實(shí)現(xiàn)抗原-DNA信號(hào)轉(zhuǎn)換，再通過PCR擴(kuò)增將抗原信號(hào)放大。免疫PCR技術(shù)能夠檢測出580個(gè)抗原分子，靈敏度比用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物的傳統(tǒng)ELISA技術(shù)提高了105倍。但是免疫PCR技術(shù)存在以下問題由于連接蛋白的存在，檢測時(shí)產(chǎn)生較強(qiáng)的本底信號(hào)(因?yàn)榈鞍譇基團(tuán)可與樣品中的任何抗體IgG的Fc片段進(jìn)行結(jié)合)；連接蛋白未商品化；不能同時(shí)進(jìn)行多分子檢測。
1995年Hendrickson等(Hendrickson，ER，et al.Nucleic Acids Res.1995，23522-529)改進(jìn)了免疫PCR技術(shù)。它是用雙功能化學(xué)交聯(lián)分子取代了連接蛋白，將寡核苷酸與抗體的Fc片段進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，使檢測背景減少，靈敏度進(jìn)一步提高。Schweitzer等2000年建立的免疫RCA技術(shù)(Rolling circleamplification)(Schweitzer，B，et al.PNAS 2000，9710113-10119)，基本原理與Hendrickson等在1995年改進(jìn)的免疫PCR技術(shù)基本相同，所不同的是連接的寡核苷酸最后以滾環(huán)復(fù)制的方式擴(kuò)增，使檢測靈敏度進(jìn)一步提高。以上兩種改進(jìn)的免疫PCR技術(shù)都必須使用交聯(lián)分子，而且交聯(lián)前需活化抗體的Fc片段及寡核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，因此在檢測過程中操作難度大、易使抗體活性喪失；操作還只能在高純度抗體的條件下進(jìn)行，且針對每一種抗體都須與DNA分子進(jìn)行連接，費(fèi)時(shí)、成本高，普及應(yīng)用都比較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基建立的抗原檢測方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用該方法制成的檢測裝置。
本發(fā)明的方法不需要任何連接蛋白或交聯(lián)分子，而是利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體的直接結(jié)合，將抗原信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增放大，檢測出新型抗原。
本發(fā)明所稱的特異寡核苷酸配基包括能與抗體Fc片段特異結(jié)合的任何形式的寡核苷酸，常用的有單鏈DNA和單鏈RNA。
為增加其穩(wěn)定性，本發(fā)明所稱的特異寡核苷酸配基序列中的堿基可經(jīng)化學(xué)修飾。也可以如在不改變與Fc片段結(jié)合特性的前提下，在配基序列兩端增加一些堿基，使通用序列變?yōu)閿y帶大量人為信息的多樣性配基，以滿足同時(shí)檢測多種抗原的需要。
本發(fā)明所稱的特異寡核苷酸配基序列可經(jīng)SELEX技術(shù)篩選獲得或通過其他的方法如分子生物學(xué)、生物信息學(xué)的方法獲得。
本發(fā)明所稱的抗體可以是任何種屬(如人、兔、小鼠、雞、羊等)、任何種類(如IgG、IgM、IgE等)、任何來源(如動(dòng)物產(chǎn)生、基因工程制備等)的單克隆抗體或多克隆抗體或基因工程單鏈抗體。
本發(fā)明的方法的原理和技術(shù)路線是將待測抗原固定在硝酸纖維素膜等介質(zhì)上，用封閉液封閉后，將膜與抗體及經(jīng)SELEX技術(shù)篩選獲得的同類抗體Fc片段的特異寡核苷酸配基孵育一定時(shí)間，用洗滌液充分洗滌纖維素膜，將未結(jié)合的特異寡核苷酸配基及游離抗體除去，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增與抗原結(jié)合的抗體Fc片段上的寡核苷酸配基。PCR擴(kuò)增所用引物同時(shí)標(biāo)記有熒光試劑或同位素，通過檢測熒光或同位素的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)抗原信號(hào)檢測。
本發(fā)明強(qiáng)調(diào)的是該抗原檢測方法中抗體與寡核苷酸配基之間無任何連接分子。
因?yàn)槟骋活惪贵wFc片段的寡核苷酸配基為該類抗體的通用性配基，應(yīng)能識(shí)別該類所有的抗體，所以通過上述方法，以針對該通用配基的特異核酸序列為引物，可將該類抗體識(shí)別的所有抗原信號(hào)都轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)加以放大、檢測。
將某一類抗體Fc片段通用寡核苷酸配基核酸序列人為修飾后(如末端人為加上一些不影響其結(jié)合活性的核酸序列)，先與特定抗體結(jié)合并通過紫外交聯(lián)等方法加以固定，即成為針對不同抗原的特定的核酸標(biāo)記抗體。根據(jù)修飾序列長短不同，堿基序列不同，可使通用寡核苷酸配基成為代表不同抗原的多樣性配基，可構(gòu)建微陣列或生物芯片，利用上述原理完成多種抗原的同時(shí)檢測。
本發(fā)明所指的寡核苷酸可以是ssDNA，也可以是RNA。通過SELEX篩選出序列后，可以直接化學(xué)合成或通過其他分子生物學(xué)的方法獲得。
本發(fā)明是利用SELEX技術(shù)篩選抗體Fc片段的高親合性寡核苷酸配基(包括單鏈DNA和RNA)，通過寡核苷酸配基對Fc片段的特異性識(shí)別、直接結(jié)合(中間不需要任何連接分子)及PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)抗原信息的有效傳遞和放大。
本發(fā)明的新型抗原檢測方法在各種抗原檢測方面有廣泛的應(yīng)用。例如，1.利用該技術(shù)原理可以建立一種新型抗原檢測方法平臺(tái)；2.利用該技術(shù)原理組裝成檢測試劑盒，能夠快速高效的提高現(xiàn)有各類抗體免疫檢測的靈敏度、特異性；3.利用該技術(shù)原理可以發(fā)展成一種新型實(shí)用蛋白質(zhì)芯片或其他各類抗原檢測生物芯片構(gòu)建技術(shù)；4.利用該技術(shù)組裝的檢測試劑盒或構(gòu)建的生物芯片可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究與臨床檢測，并帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。
本發(fā)明的方法具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)1)高靈敏度與抗體Fc片段特異結(jié)合的寡核苷酸是利用SELEX(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment)技術(shù)篩選出來的。SELEX技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一種新型生物學(xué)技術(shù)(綜述見孫蕾等，指數(shù)式富集法配體進(jìn)化-組合化學(xué)技術(shù)的新進(jìn)展，國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，1999，26193-197)。它是應(yīng)用大容量(庫容量可達(dá)1018)的隨機(jī)寡核苷酸文庫，并結(jié)合PCR體外擴(kuò)增技術(shù)以指數(shù)級富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸配基(aptamer)。用此方法篩選出的特異寡核苷酸配基與靶分子結(jié)合的親和力高(Kd為0.05～50nmol.L-1)、特異性強(qiáng)、易形成穩(wěn)定的復(fù)合物。本發(fā)明利用Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體的直接結(jié)合及PCR技術(shù)檢測抗原，不但保留了免疫PCR和免疫RCA利用寡核苷酸擴(kuò)增、傳遞、放大抗原信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，而且由于抗體對Fc片段的特異性識(shí)別與結(jié)合，避免了連接分子的存在，使得抗原信號(hào)的檢測背景非常低，特異性更強(qiáng)，靈敏度會(huì)大大提高；2)抗體的通用性識(shí)別由于抗體的Fc片段是高度保守序列，因此針對某種屬的某一類抗體(如小鼠IgG、IgE、IgM等)Fc片段篩選出的特異寡核苷酸配基，應(yīng)能識(shí)別該類所有的抗體，作用類似于ELISA中的酶標(biāo)二抗；3)可進(jìn)行多種抗原超微多樣性檢測通用的寡核苷酸配基經(jīng)過人為序列修飾后，使寡核苷酸配基不僅具有通用性，同時(shí)也能形成識(shí)別不同抗原的多樣性配基，并可構(gòu)建成微陣或生物芯片用于多種抗原的同時(shí)檢測；4)操作簡便，易于普及由于獲得的特異寡核苷酸配基與抗體及抗原孵育一定時(shí)間后，將未結(jié)合的核酸配基除去，即可通過PCR技術(shù)檢測，不需要將寡核苷酸配基經(jīng)過化學(xué)方法偶聯(lián)到抗體蛋白分子上，因此操作簡便，便于一般實(shí)驗(yàn)室或臨床檢驗(yàn)科室的普及應(yīng)用。


圖1是利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基建立的新型抗原檢測方法原理示意圖。其中PCR所用引物為針對寡核苷酸配基的互補(bǔ)序列。
圖2是某一類抗體Fc片段通用特異寡核苷酸配基序列經(jīng)人為增加一些堿基后，變成多樣性配基序列用于多種抗原同時(shí)檢測示意圖。為了增加配基的多樣性，人為序列可以加在5’端、3’端、或5’端和3’端同時(shí)加上，長度可以多樣。其中PCR所用引物只針對寡核苷酸配基兩端人為添加序列。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1.單一抗原的免疫檢測利用小鼠IgG Fc片段特異寡核苷酸配基制備小鼠IgG類單抗核酸標(biāo)記試劑，并以此為傳感器檢測該類抗體識(shí)別的抗原。具體方法如下將抗原固定在硝酸纖維素膜上，封閉液封閉后，將膜與小鼠IgG類單抗及小鼠IgG Fc片段特異寡核苷酸配基在37口下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌濾膜數(shù)次后，將濾膜重新置于含有PCR反應(yīng)液(包括引物及標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系)的薄壁PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用引物上標(biāo)記的熒光試劑檢測熒光信號(hào)，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)未進(jìn)行PCR擴(kuò)增(相應(yīng)試劑都存在)的對照。扣除對照熒光信號(hào)即為待測抗原的信號(hào)。
實(shí)施例2.用于原發(fā)性肝癌早期診斷新型免疫微陣列的制備及其應(yīng)用具體步驟如下1.制備AFP(甲胎蛋白)、Ft(鐵蛋白)、GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)及GGT同功酶的特異核酸標(biāo)記抗體由于目前臨床所用上述4種抗體皆為小鼠IgG類單抗，所以將小鼠IgG抗體Fc片段通用寡核苷酸配基的核酸序列進(jìn)行人為修飾，如在5’末端分別人為加上4種不影響其結(jié)合活性的核酸序列A、B、C、D，長度40-80bp，即成為4種特定的標(biāo)記核酸。將這4種不同的標(biāo)記核酸分別與上述4種抗體一一對應(yīng)結(jié)合，通過紫外交聯(lián)加以固定，即成為針對4種不同抗原的特定的核酸標(biāo)記抗體。
2.按目前常規(guī)方法制備針對上述A、B、C、D序列的微陣列。
3.將抗原(如患者血清)固定在硝酸纖維素膜上，封閉液封閉后與上述4種不同核酸標(biāo)記抗體在37口下共同孵育30分鐘，用洗滌液沖洗濾膜數(shù)次后，將濾膜重新置于含有PCR反應(yīng)液(包括引物及標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系)的薄壁PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物分別為針對上述A、B、C、D4種人為序列(即同時(shí)存在8種引物)，引物上同時(shí)標(biāo)記有熒光試劑。用微陣列技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，即可檢測4種抗原，從而對原發(fā)性肝癌進(jìn)行早期診斷。
權(quán)利要求
1.一種新型抗原檢測方法，其特征是利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體直接結(jié)合，將抗原信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增放大，檢測出抗原。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的特異寡核苷酸配基是能與抗體Fc片段特異結(jié)合的單鏈DNA。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的特異寡核苷酸配基是能與抗體Fc片段特異結(jié)合的單鏈RNA。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或基因工程單鏈抗體。
5.權(quán)利要求2至3所述的方法，其特征在于在不改變與Fc片段結(jié)合特性的前提下，配基序列兩端可人為地增加一些堿基，使通用序列變?yōu)閿y帶大量人為信息的多樣性配基，以滿足同時(shí)檢測多種抗原的需要。
6.利用權(quán)利要求1所述方法制成的檢測試劑盒及裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型抗原檢測方法。該方法利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體直接結(jié)合，將抗體信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增放大，檢測出抗原。利用該方法可以組裝成檢測試劑盒或開發(fā)成為實(shí)用蛋白質(zhì)芯片或其他檢測各類抗原的生物芯片。該方法檢測抗原具有快速、高靈敏度、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1428606SQ0114492
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月24日
發(fā)明者邵寧生, 廖世奇, 柳川, 薛沿寧, 沈倍奮, 楊光, 何曉東, 劉元強(qiáng), 仇杰, 董信春 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院