專利名稱：一次性血糖測(cè)定用電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型的一次性測(cè)定葡萄糖氧化酶血糖用的電極及其制備方法。
物理換能器有電化學(xué)、光譜、熱、壓電及表面聲波技術(shù)等，按物理換能器不同分為電化學(xué)、光、半導(dǎo)體、壓電晶體、熱和介體等生物傳感器。生物電化學(xué)傳感器又分為安培型和電位型兩種。在上述生物傳感器中，研究和應(yīng)用最多的是酶?jìng)鞲衅?。將酶作為試劑與電極結(jié)合是1962年由Clark和Lyons首先提出的(L.C.Clark，C.Lyons，Ann.N.Y.Acad.Sci，1962，102，582)。從此，在酶電極和生物傳感器方面，每年都有大量工作發(fā)表，涉及酶的固定化、膜的組成、電極媒介體和電極的構(gòu)造等。根據(jù)酶與電極間電子轉(zhuǎn)移的機(jī)理，大致可將生物傳感器分為三代第一代為采用酶的天然介體(氧的催化原理設(shè)計(jì)的酶?jìng)鞲衅鞣Q為第一代生物傳感器；而將人工合成的電子傳遞媒介體摻入酶層中，改進(jìn)了分析常數(shù)和簡(jiǎn)化了處理步驟，能進(jìn)行無試劑測(cè)量，稱為第二代生物傳感器；第三代生物傳感器是指在無媒介體存在下，利用酶與電極間的直接電子轉(zhuǎn)移制作的酶?jìng)鞲衅?。近年來，生物傳感器及生物芯片引起人們的極大關(guān)注，相當(dāng)多的公司和研究單位開展了生物傳感器的研究與開發(fā)，相關(guān)的論文和專利與日俱增。
根據(jù)最近的文獻(xiàn)報(bào)道，已研制成功的有氨基酸、膽固醇、乙酰膽堿、嘌呤類以及生物芯片等生物傳感器。目前這方面的主要任務(wù)是繼續(xù)研制和開發(fā)新的生物傳感器，更重要的是要研制可商品化的高靈敏度、高選擇性、精密度好、壽命長和價(jià)廉的傳感器。其中最關(guān)鍵的是酶和媒介體的固定化，以及媒介體的選擇，處理的好壞直接影響傳感器的各項(xiàng)指標(biāo)和壽命。葡萄糖氧化酶電極，30余年來一直在不斷地研究，發(fā)表的論文在100篇以上，至今仍在不斷探索新的制造方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)下限低、抗干擾能力強(qiáng)、使用壽命長的一次性葡萄糖氧化酶血糖測(cè)定用電極及其制備方法。
本發(fā)明提出的一次性葡萄糖氧化酶血糖測(cè)定用電極，由電極基板、鋁膜電極引線、絕緣膜、基體碳電極、電子媒體修飾層、Ag/AgCl參比修飾層、PVC絕緣膜構(gòu)成，見

圖1所示。其中，電極基板1是整個(gè)電極的支撐體，鋁膜電極引線2直接制作在電極基板1上面，其上再貼制有絕緣膜3，該絕緣膜上預(yù)留有2個(gè)洞孔，在兩個(gè)孔中分別刮制有碳膜電極，并與2條鋁引線連通。電極基板1的一端或兩端的鋁膜裸露，用于與儀器接插；非裸露部分貼制有PVC絕緣膜4，用于構(gòu)成樣品檢測(cè)區(qū)；樣品檢測(cè)區(qū)的PVC絕緣膜4上開有與絕緣膜3上洞孔對(duì)應(yīng)的洞孔，其中絕緣膜3上的一個(gè)洞孔內(nèi)制作有電子媒介體修飾層和含有葡萄糖氧化酶的殼聚糖修飾層，另一個(gè)洞孔內(nèi)制作有Ag/AgCl參比修飾層，構(gòu)成含電子媒介體的葡萄糖氧化酶修飾碳電極5和含Ag/AgCl的參比碳電極6，簡(jiǎn)稱葡萄糖氧化酶電極和Ag/AgCl參比電極。這兩個(gè)電極體系也稱為葡萄糖生物傳感器。
本發(fā)明中，電子媒介體修飾層可采用1-二茂鐵基乙胺。電極基板1可采用PVC或覆塑紙板。
本發(fā)明還提出了上述一次性葡萄糖氧化酶血糖測(cè)定用電極的制作方法。具體步驟如下1、基體電極制作在電極基板1上制作2條鋁膜電極引線2，制作方法可以用燙金技術(shù)。再覆蓋上預(yù)留有2個(gè)洞孔的透明絕緣膜3，該絕緣膜3可以采用雙向拉伸聚丙烯POPP壓敏膠帶；采用含碳粉和雙組份環(huán)氧樹脂調(diào)制的碳漿，在兩個(gè)洞孔中刮制基體碳膜電極，碳膜電極分別與兩條鋁線2連通；然后再貼制上PVC絕緣膜4，膜上預(yù)留有與膜3上洞孔對(duì)應(yīng)的洞孔，作為樣品檢測(cè)孔；2、葡萄糖生物傳感器的制作在一個(gè)洞孔中的碳膜電極上滴加1-二茂鐵基乙胺乙醇溶液，待乙醇揮發(fā)后，得含電子媒介體的碳膜，將預(yù)先配制的殼聚糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液的混合修飾液修飾在上述碳膜上；在另一個(gè)洞孔中的碳膜電極上修飾Ag/AgCl參比層，其厚度為20-50微米，該參比層可使用含Ag/AgCl、碳粉和雙組份環(huán)氧樹脂調(diào)制的碳漿制作；最后，將電極置于戊二醛溶液中室溫熏蒸10-30分鐘，即得所需電極。
上述制作步驟中，1-茂鐵基乙胺乙醇溶液由1-茂鐵基乙胺溶解于無水乙醇中得到，其濃度為1-5％，為黃色澄清溶液。殼聚糖溶液由殼聚糖加冰醋酸調(diào)成糖漿狀后再用水稀釋得到，濃度為1-2％(W/W)。葡萄糖氧化酶溶液由葡萄糖氧化酶用50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)溶解而得到，其濃度為2-4％，為淡黃色澄清溶液，在兩者的混合修飾液中前者和后者的用量比是2∶1-4∶1。戊二醛溶液由25％戊二醛溶液用50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋1倍而得到。
本發(fā)明提供的上述血糖測(cè)定用電極，其各部分的作用原理如下葡萄糖氧化酶用于特異性地識(shí)別葡萄糖并將其氧化為δ-葡萄糖酸內(nèi)酯；1-二茂鐵基乙胺為葡萄糖氧化酶與電極間的新型電子傳遞，作為酶促反應(yīng)的氧化劑參與葡萄糖的氧化，它的主要作用是酶反應(yīng)和電極間的電子傳遞媒介，使氧化酶降低檢測(cè)電位，提高電極的選擇性。同時(shí)選用生物相容性好的新型天然高分子材料殼聚糖為電極敏感材料葡萄糖氧化酶的固定材料，大大提高了電極的穩(wěn)定性、壽命和重現(xiàn)性，同時(shí)該膜材料可提高電極的抗干擾能力。其中基板采用紙板，容易加工，降低了成本。更重要的是紙容易降解，屬綠色環(huán)保產(chǎn)品。
本發(fā)明的電極生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，電極靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)下限低、抗干擾能力強(qiáng)、壽命長達(dá)一年，在實(shí)際血樣測(cè)試中性能良好，可用于一次性血糖測(cè)定。具體可見下述的測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1、傳感器對(duì)葡萄糖的響應(yīng)本實(shí)驗(yàn)采用磁力攪拌注射法測(cè)定恒電位計(jì)時(shí)電流曲線，溶液用磁力攪拌(攪速為180rpm)，控制電位為0.30V，連續(xù)記錄電流-時(shí)間曲線，用微量進(jìn)樣器每次注射一定體積(如10μl)的1.0mol/l葡萄糖溶液，結(jié)果見圖2所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨葡萄糖濃度增加，曲線的噪音升高，這可能是磁力攪拌引起的電極表面葡萄糖濃度的微小變化產(chǎn)生的。測(cè)定增加葡萄糖濃度產(chǎn)生的電流與葡萄糖濃度的關(guān)系曲線見圖2。當(dāng)y為電流(nA)，x為葡萄糖濃度(mmol/l)，線性回歸方程為y＝54.807x+8.1667(R2＝0.9997)，檢測(cè)下限為1.825μmol/l，線性范圍5.0μmol/l~15mmol/l，當(dāng)濃度高于15.0mmol/l，出現(xiàn)負(fù)偏差，電流增加值低于理論值，電極反應(yīng)由葡萄糖的擴(kuò)散控制轉(zhuǎn)向由酶的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程控制。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，在相同實(shí)驗(yàn)條件和檢測(cè)電位下，裸電極對(duì)葡萄糖無電流響應(yīng)。
2、傳感器的抗干擾能力為測(cè)定電極的抗干擾能力，采用攪拌注射法，在含0.2mmol/l的葡萄糖的底液中，依次加入0.2mmol/l L-抗壞血酸、尿酸、甘油、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、高半胱氨酸、Tyr、Trp、GABA、Ala、Gly、Glu、Asn、Tau、Glu、Asp和谷胱甘肽(R-SH)，發(fā)現(xiàn)尿酸和L-抗壞血酸對(duì)測(cè)定沒有明顯干擾，其它均無電流響應(yīng)。
3、傳感器的重復(fù)性、壽命和響應(yīng)時(shí)間電極重復(fù)性良好，11次連續(xù)測(cè)試含0.2mmol/l葡萄糖測(cè)試液的電流值的RSD為2.07％。該電極在4℃冰箱中保存11個(gè)月，電極對(duì)0.2mol/l的葡萄糖溶液響應(yīng)電流下降值小于12％。此外，電極的響應(yīng)時(shí)間短，對(duì)于0.2mmol/l的葡萄糖響應(yīng)時(shí)間僅0.5-1.0s。
4、傳感器對(duì)血清中葡萄糖的測(cè)定用本傳感器測(cè)定四例血清樣品(1-4)，測(cè)定結(jié)果見表1，與上海市中山醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定結(jié)果基本一致。其中，1和2為正常人血清，3和4為糖尿病人血清，顯然本方法可用于糖尿病的診斷。取血清3的脫蛋白提取液1ml于5ml容量瓶中，加0.01mol/l葡萄糖貯液0.125ml后定容，使加入的葡萄糖濃度為2.5×10-4mol/l，用本傳感器三次測(cè)定的平均回收率97.87％(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝3.26％)。表1 傳感器測(cè)定人血清中葡萄糖結(jié)果樣品 正常人血清 糖尿病人血清No.1 2 3 4濃度(mmol/l) 5.746 5.290 17.948 17.606RSD(n＝3，％) 2.261.141.451.70參考值(mmol/l)a5.4 5.2 17.617.6a由中山醫(yī)院檢驗(yàn)科7170A自動(dòng)生化分析儀(Hitachi，Japan)測(cè)定。
本發(fā)明的電極可用于人全血、血清和尿液中葡萄糖的測(cè)定，還可用于其它含葡萄糖水溶液(如果汁等)中葡萄糖的測(cè)定。
圖2為本發(fā)明電極在樣品檢測(cè)孔處的剖面圖示。
圖3為本發(fā)明中傳感器對(duì)葡萄糖的響應(yīng)曲線，其中圖2(a)為對(duì)每次注射葡萄糖的響應(yīng)曲線，圖2(b)為傳感器響應(yīng)電流與葡萄糖濃度的關(guān)系。
圖中標(biāo)號(hào)1為電極基板，2為鋁引線，3為透明絕緣層，4為PVC絕緣層，5為含電子媒介體的葡萄糖氧化酶修飾碳電極，6為Ag/AgCl修飾的參比碳電極。
該電極性能良好，已成功用于血清中葡萄糖的測(cè)定，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為本紙質(zhì)葡萄糖生物傳感器的測(cè)試結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)為紙板基材容易降解，對(duì)環(huán)境污染小，且容易加工，成本低。
實(shí)施例2、基于PVC基體的一次性血糖電極基體電極制作聚氯乙烯(PVC)片材(0.06×1×4cm)上通過燙金技術(shù)在上面制作鋁質(zhì)電極引線，覆蓋有兩個(gè)預(yù)留圓孔(直徑為1.5mm)的透明雙向拉伸聚丙烯POPP壓敏膠帶，主要用于非接觸部分鋁質(zhì)電極的絕緣。兩端或一端的鋁質(zhì)電極引線裸露，用于與儀器連接。在兩個(gè)預(yù)留圓孔刮制基體碳膜電極(使用含碳粉和雙組分環(huán)氧樹脂調(diào)制的碳漿)，碳基體電極分別與兩條鋁線連通，然后貼制蘭色壓敏PVC絕緣膜2，待環(huán)氧樹脂固化，即得PVC基體電極(電極樣式為B型)；PVC葡萄糖生物傳感器的制作在點(diǎn)樣處的兩個(gè)碳電極中的一個(gè)滴加2.5％(w/w)1-二茂鐵基乙胺乙醇溶液5微升，待乙醇揮發(fā)即可，然后將2％(w/w)殼聚糖溶液和4％(w/w)葡萄糖氧化酶按體積比3∶1混合，取10微升修飾在該含電子媒介體的碳膜上，另一個(gè)電極修飾Ag/AgCl參比修飾層(使用含Ag/AgCl、碳粉和雙組分環(huán)氧樹脂調(diào)制的碳漿)，其中厚度約30微米，于4℃冰箱中過夜干燥后，電極然后于盛有12.5％(w/w)戊二醛溶液的容器中室溫熏蒸20min即成。
實(shí)用表明該P(yáng)VC葡萄糖生物傳感器性能與實(shí)施例1電極性能相當(dāng)，沒有明顯差異。該電極防潮性能較好，機(jī)械強(qiáng)度較高。
權(quán)利要求
1.一種一次性葡萄糖氧化酶血糖測(cè)定用電極，由電極基板、鋁膜電極引線、絕緣膜、PVC絕緣膜構(gòu)成，其特征在于電極基板(1)為整個(gè)電極的支撐體，鋁膜電極引線(2)直接制作在基板(1)上，其上再貼制有開有2個(gè)洞孔的絕緣膜(3)，兩個(gè)孔中分別刮制有碳膜電極，并與兩條鋁引線連通；電極基板(1)的一端或兩端裸露，用于與儀器接插，非裸露部分再覆蓋有PVC絕緣膜(4)，該絕緣膜(4)上開有與絕緣膜(3)上的兩個(gè)洞孔對(duì)應(yīng)的洞孔；在其中一個(gè)洞孔內(nèi)依次制作有含電子媒介體修飾層和含有葡萄糖氧化酶的殼聚糖修飾層，在另一個(gè)孔內(nèi)制作有含Ag/AgCl的參比修飾層(6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血糖測(cè)定用電極，其特征在于電子媒介體采用1-二茂鐵基乙胺，電極基板(1)采用PVC或覆塑紙板。
3.如權(quán)利要求1所述的一次性葡萄糖氧化酶血糖測(cè)定用電極的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)基體電極的制作在電極基板(1)上制作兩條鋁膜電極引線(2)，再覆蓋上預(yù)留有兩個(gè)洞孔的透明絕緣膜(3)；采用由碳粉和雙組份環(huán)氧樹脂調(diào)制成的碳漿，在兩個(gè)洞孔中刮制基體碳膜電極，并使其分別與兩鋁引線(2)連通；然后再貼制上PVC絕緣膜(4)，該膜上預(yù)留有與膜(3)上洞孔對(duì)應(yīng)的洞孔；(2)葡萄糖生物傳感器的制作在一個(gè)洞孔中的碳膜電極上滴加1-二茂鐵基乙胺乙醇溶液，待乙醇揮發(fā)后，得含電子媒介體的碳膜，將預(yù)先配制的殼聚糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液的混合修飾液修飾在上述碳膜上；在另一個(gè)洞孔中的碳膜電極上修飾Ag/AgCl參比層，其厚度為20-50微米，該參比層可使用含Ag/AgCl、碳粉和雙組份環(huán)氧樹脂調(diào)制的碳漿制作；最后，將電極置于戊二醛溶液中室溫熏蒸10-30分鐘，即得所需電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的電極的制備方法，其特征在于所述制作步驟中，1-茂鐵基乙胺乙醇溶液由1-茂鐵基乙胺溶解于無水乙醇中得到，其濃度為1-5％；殼聚糖溶液由殼聚糖加冰醋酸調(diào)成糖漿狀后再用水稀釋得到，濃度為1-2％(W/W)；葡萄糖氧化酶溶液由葡萄糖氧化酶用50mmol/L磷酸緩沖液溶解而得到，其濃度為2-4％；在兩者的混合修飾液中前者和后者的用量比是2∶1-4∶1；戊二醛溶液由25％戊二醛溶液用50mmol/L磷酸緩沖液稀釋1倍而得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一次性葡萄糖氧化酶血糖測(cè)定用電極及其制備方法。以PVC板或覆膜紙板為電極基底材料,在上面制作鋁質(zhì)電極引線,覆蓋兩個(gè)預(yù)留有洞孔的絕緣膜,在孔中刮制基體碳膜電極,電極分別與兩條鋁線連通。然后分別在碳電極上分別制作電子傳遞媒介體1－二茂鐵基乙胺修飾層和Ag/AgCl參比修飾層,將含葡萄糖氧化酶的殼聚糖溶液修飾在含電子媒介體的碳膜上,于盛有戊二醛溶液的容器中熏蒸即成。該電極生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,電極靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)下限低、抗干擾能力強(qiáng)、壽命長達(dá)一年,在實(shí)際血樣測(cè)試中性能良好,可用于血糖測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N27/30GK1373361SQ02111330
公開日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2002年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月11日
發(fā)明者陳剛, 柴建青, 雷杰 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)