專利名稱：免疫反應(yīng)測定方法及其所使用的免疫反應(yīng)測定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠檢測樣本中所含的抗原或抗體(對象物質(zhì)(subject substances))的免疫反應(yīng)測定方法，以及此方法中所使用的一種免疫反應(yīng)測定試劑。
背景技術(shù)：
為明確各種疾病的診斷和判斷疾病的進(jìn)展情況，可以測定存在于人體體液內(nèi)的、具有疾病特征性的蛋白的水平。此技術(shù)已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
使用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)的免疫反應(yīng)測定方法主要用于此種蛋白的含量的測定。目前，多種原理已被應(yīng)用于對免疫反應(yīng)測定方法的改進(jìn)和開發(fā)。
其中，檢測抗原抗體反應(yīng)所形成的凝集復(fù)合物的測定方法，例如懸度測定法、濁度測定法、玻片凝集法及類似方法已廣為熟知的。這些方法在溶液中進(jìn)行，其中抗原和抗體是均勻分散的，因此總稱為均質(zhì)免疫反應(yīng)測定方法。
在這些方法中，反應(yīng)體系因凝集復(fù)合物的產(chǎn)生而變得混濁，其混濁度依賴于抗原和抗體的量。懸度測定法和濁度測定法是通過光學(xué)測定混濁度的方法。在懸度測定法中，混濁度是通過測量被反應(yīng)體系散射的光量而測定的。在濁度測定法中，對混濁度的測定則是基于測量由于反應(yīng)體系的散射而發(fā)生的光透射衰減?？傮w而言，兩種方法使用和測定相同的反應(yīng)體系。能被一種方法測定的對象也可被另一種方法測定。玻片凝集是使用肉眼觀察或類似方式對凝集復(fù)合物產(chǎn)生所引起的混濁度進(jìn)行測定的一種方法。玻片凝集可以使用與懸度測定法和濁度測定法相同的反應(yīng)體系。
各種添加劑被嘗試用于上述傳統(tǒng)的免疫反應(yīng)測定方法中，以便能加速抗原抗體反應(yīng)并高度敏感地檢測到微量的成分。例如，在反應(yīng)體系中加入一種水溶性的聚合物，如聚乙二醇、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、或類似物，以加速抗原抗體反應(yīng)的凝集復(fù)合物形成，通過這種方法以改進(jìn)反應(yīng)時間和測定的敏感性。這些水溶性聚合物中，已知聚乙二醇即使是在相對低的濃度下也有很好的效果。重量百分比為2-6％(以下簡寫為wt％)的、平均分子量在6,000的聚乙二醇用途廣泛。特別是當(dāng)濃度為4wt％時，其只產(chǎn)生極少量的非特異性混濁度，十分高效。
水溶性聚合物的分子量或濃度增加時，其促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)的作用也會提高(見于《自動化免疫分析》第一部分，Ritchie編寫，67-112頁(1978))。
對于抗原抗體反應(yīng)的測定，依賴于抗原濃度的信號性抗原抗體反應(yīng)的強度越大，S/N比越令人滿意，即測定越穩(wěn)定。然而，若想通過使抗原抗體反應(yīng)進(jìn)一步加速以達(dá)到上述效果，那么就需要提高所加入的傳統(tǒng)的水溶性聚合物的分子量或濃度。但這樣會增加含有此水溶性聚合物的溶液的粘度，使得分析的操作過程難于把握。
在均質(zhì)免疫反應(yīng)測定方法中，區(qū)帶現(xiàn)象(zone phenomenon)十分常見。區(qū)帶現(xiàn)象指的是，當(dāng)抗原抗體之一的量超出與其形成最大凝集復(fù)合物相當(dāng)?shù)闹亓糠秶鷷r，會妨礙凝集復(fù)合物的產(chǎn)生。著名的Heidelberger的格子假說(lattice hypothesis)解釋了多價抗體與大于一價的抗原的結(jié)合反應(yīng)，其詳細(xì)描述見于William E Paul所編輯的《免疫學(xué)概要》(1984)(日文版，Kiso Menekigaku，Tomio Tada負(fù)責(zé)，714-716頁(1987))。
在實際的均質(zhì)免疫反應(yīng)測定中，通常是用抗體檢測抗原的濃度，較高的測定值(即抗原的濃度)比較低的測定值通常更有意義。因此，由抗原過量所引起的區(qū)帶現(xiàn)象是常見的問題。在區(qū)帶以外的區(qū)域則形成含有由抗原抗體交互連接而成的復(fù)合物的巨大分子鏈。如果抗體濃度不變，分子鏈的數(shù)量和大小隨抗原的濃度增加而增大。因此，通過檢測其光學(xué)變化可測定分子鏈的數(shù)量和大小，進(jìn)而可定量測定抗原的濃度。此外，抗原抗體復(fù)合物在溶液中形成的混濁或凝集甚至可以通過肉眼進(jìn)行觀察，這取決于抗原抗體的濃度。因此，抗原的濃度也可通過肉眼觀測而進(jìn)行定性測定。
但是，在抗原過量的區(qū)域，由于抗原量遠(yuǎn)大于抗體量，結(jié)合位點被抗原飽和的抗體數(shù)量增加。因此，上述分子鏈的形成受到影響，反應(yīng)結(jié)果將無法分辨抗原濃度是低還是更高。因此將無法對抗原的濃度進(jìn)行正確的定量測定。為此，必須對所檢測的濃度范圍做出限定以避免上述情況。
本發(fā)明的目的之一是通過提供一種能夠簡便地提高測定值的免疫反應(yīng)測定方法，以及一種供此方法使用的免疫反應(yīng)測定試劑，以解決上述常見的問題。本發(fā)明的另一個目的是提供一種能夠解決抗原過量的區(qū)帶現(xiàn)象的免疫反應(yīng)測定方法，以及一種供本方法使用的免疫反應(yīng)測定試劑。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明用于測定樣品中的抗原或抗體(對象物質(zhì))的免疫學(xué)測定方法的特征包含步驟A將三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))加入至樣品中，和步驟B在步驟A生成的反應(yīng)體系中檢測由對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)所生成的抗原抗體復(fù)合物，所述反應(yīng)體系包含樣品、特異性結(jié)合物質(zhì)和三羧酸或三羧酸鹽，并且抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時此反應(yīng)體系的pH值是酸性的。
此外，本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑的特征包含三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))，且所制備的試劑能夠使得對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時的pH值是酸性的。
附圖簡述

圖1所示為使用本發(fā)明實施例或?qū)Ρ壤拿庖叻磻?yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測定的測定結(jié)果。
圖2所示為使用本發(fā)明另一個實施例的含有檸檬酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測定的pH值相關(guān)性的檢測結(jié)果。
圖3所示為使用本發(fā)明實施例的含有反烏頭酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測定的pH值相關(guān)性的檢測結(jié)果。
圖4所示為仍然使用本發(fā)明另一個實施例的含有檸檬酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測定的檸檬酸濃度相關(guān)性的檢測結(jié)果。
圖5所示為使用本發(fā)明實施例的含有反烏頭酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測定的反烏頭酸濃度相關(guān)性的檢測結(jié)果。
圖6所示為使用本發(fā)明實施例或?qū)Ρ壤暮腥人峄蛉人猁}以及另一種緩沖液的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測定的測定結(jié)果。
圖7所示為使用本發(fā)明另一個實施例或?qū)Ρ壤暮猩窖蚩谷薈RP多克隆抗體以及檸檬酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人CRP進(jìn)行免疫懸液測定的測定結(jié)果。
圖8所示為使用本發(fā)明另一個實施例或?qū)Ρ壤暮行∈罂谷薈RP多克隆抗體以及檸檬酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人CRP進(jìn)行免疫懸液測定的測定結(jié)果。
圖9所示為使用本發(fā)明實施例或?qū)Ρ壤暮行∈罂谷薈RP多克隆抗體以及反烏頭酸的免疫反應(yīng)測定試劑、通過免疫反應(yīng)測定方法對人CRP進(jìn)行免疫懸液測定的測定結(jié)果。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及一種能夠簡便地提高測定值的免疫反應(yīng)測定方法，以及一種供本方法使用的免疫反應(yīng)測定試劑。本發(fā)明還涉及一種能夠解決抗原過量的區(qū)帶現(xiàn)象的免疫反應(yīng)測定方法，以及一種供本方法使用的免疫反應(yīng)測定試劑。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在抗原抗體反應(yīng)體系中加入三羧酸或三羧酸鹽以維持反應(yīng)體系的pH值為酸性，可以改善由抗原抗體結(jié)合而引起的免疫反應(yīng)的測定值，并可以解決在抗原過量產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象。
本發(fā)明的實施方案的免疫反應(yīng)測定方法是一種測定樣品中的抗原或抗體(對象物質(zhì))的方法，其特征包含步驟A將三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))加入至樣品中，和步驟B在步驟A生成的反應(yīng)體系中檢測由對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)所生成的抗原抗體復(fù)合物，所述反應(yīng)體系包含樣品、特異性結(jié)合物質(zhì)和三羧酸或三羧酸鹽，并且抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時此反應(yīng)體系的pH值是酸性的。反應(yīng)體系可以同時含有三羧酸和三羧酸鹽。進(jìn)一步地，反應(yīng)體系中的三羧酸或三羧酸鹽優(yōu)選地使反應(yīng)體系具有緩沖能力，以維持反應(yīng)體系的pH值為酸性。在這種情況下不需要其他緩沖液來調(diào)整反應(yīng)體系的pH值為酸性，而免疫反應(yīng)的測定值又可得到有效的提高，并可以有效解決在抗原過量產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象。反應(yīng)體系中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度優(yōu)選地為至少0.01M，以使得反應(yīng)體系具有緩沖能力。反應(yīng)體系內(nèi)也可進(jìn)一步加入另外的緩沖液。
本發(fā)明的實施方案的免疫反應(yīng)測定試劑的特征為包含三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))，且所制備的試劑能夠使得對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時的pH值是酸性的。所述試劑可以同時含有三羧酸和三羧酸鹽。所述試劑被優(yōu)選地制備為能夠使得其中的三羧酸或三羧酸鹽具有緩沖能力，并且當(dāng)對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時pH值是酸性的。
對于本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑所使用的緩沖液，可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的緩沖液，例如，包括磷酸緩沖液(如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等等)、醋酸鈉、二甲胂酸鈉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、琥珀酸，等等。在這種情況下，可以根據(jù)反應(yīng)體系中的緩沖液的類型、含有對象物質(zhì)的樣品(標(biāo)本)的量、提供與抗原或抗體(對象物質(zhì))相關(guān)的抗體或抗原的方法等等，對所用的緩沖液的量進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到本發(fā)明的效果。
在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法中，反應(yīng)體系的pH值被優(yōu)選地設(shè)定為4-6。在此pH值范圍內(nèi)，因三羧酸或三羧酸鹽的存在，免疫反應(yīng)的測定值被大幅度提高，更利于解決在抗原過量出現(xiàn)的區(qū)帶現(xiàn)象?？紤]到這些效果，反應(yīng)體系的pH值被特別優(yōu)選地設(shè)定為4.5。
由于上述原因，在發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時，本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑的pH值被設(shè)定為4-6。更優(yōu)選地，pH值被設(shè)定為4.5。
在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法中，反應(yīng)體系中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度不超過0.3M。在這種情況下，因三羧酸或三羧酸鹽的存在，免疫反應(yīng)的測定值被大幅度提高，更利于解決在抗原過量出現(xiàn)的區(qū)帶現(xiàn)象。當(dāng)反應(yīng)體系中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度不超過0.2M時，這些效果優(yōu)選地進(jìn)一步增強。當(dāng)反應(yīng)體系中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度為0.1M時，這些效果特別優(yōu)選地更高。
由于上述原因，在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑中，抗原抗體反應(yīng)中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度優(yōu)選地為不超過0.3M，更優(yōu)選地為不超過0.2M，進(jìn)一步更優(yōu)選地為不超過0.1M。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑所使用的三羧酸或三羧酸鹽的例子包括檸檬酸、異檸檬酸、烏頭酸、及其相應(yīng)的鹽，這些均能夠以無水檸檬酸、檸檬酸單水化合物、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鈉二水化合物、檸檬酸二氫鉀、檸檬酸三鉀單水化合物、檸檬酸三銨、檸檬酸氫二銨、檸檬酸鈣四水化合物、無水檸檬酸鎂、檸檬酸三鋰四水化合物、檸檬酸銅(II)2.5水化合物、DL-異檸檬酸三鈉、反烏頭酸和無水順烏頭酸的形式購得，并可單獨或組合使用。其中，優(yōu)選的三羧酸或三羧酸鹽為檸檬酸、檸檬酸鹽、烏頭酸或烏頭酸鹽，原因是它們相對便宜、可室溫儲存、穩(wěn)定且易于處理。更加優(yōu)選地，所述烏頭酸是反烏頭酸。
在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑的體系中，還可加入本領(lǐng)域已知的任何成分，根據(jù)其使用情況選擇可實現(xiàn)本發(fā)明效果的用量。例如，當(dāng)本發(fā)明用于均質(zhì)型免疫反應(yīng)測定方法時，如懸度測定法、濁度測定法、玻片凝集法及類似方法，可在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑的體系中加入聚乙二醇。本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法的反應(yīng)體系中所含有的此成分的濃度優(yōu)選為2-6％(wt％)，因為此濃度較少引起非特異性凝集，同時可大幅度提高測定的敏感性，更加優(yōu)選地，其濃度為4％(wt％)。類似地，在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑中，此成分的濃度優(yōu)選為2-6％(wt％)，更加優(yōu)選地為4％(wt％)。
為減少由于抗原或抗體的自凝集而產(chǎn)生的非特異性混濁，可在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑的反應(yīng)體系中加入表面活性劑，如吐溫20、辛基葡糖苷、十二烷基磺酸鈉(SDS)、蔗糖單月桂酸酯、CHAPS等等。表面活性劑在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法的反應(yīng)體系中的濃度優(yōu)選地不超過0.3％，因為此濃度對抗原抗體反應(yīng)的抑制較輕，更優(yōu)選地不超過0.1％。類似地，在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑中，此表面活性劑的濃度優(yōu)選為不超過0.3％，更加優(yōu)選地為不超過0.1％。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑可優(yōu)選地應(yīng)用于均質(zhì)測定體系中，包括但不限于懸度測定法、濁度測定法和玻片凝集法，這些體系在抗原過量可產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。在這種情況下，有望優(yōu)選地產(chǎn)生更好的效果。特別是當(dāng)本發(fā)明被應(yīng)用于懸度測定法和濁度測定法等廣泛使用自動化檢測儀器的檢測方法時，測定在抗原過量產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象所需的步驟可被優(yōu)選地省略或簡化。
在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法中，抗原抗體復(fù)合物優(yōu)選地是一種凝集復(fù)合物。在步驟B，對凝集復(fù)合物的檢測優(yōu)選地通過測定由凝集復(fù)合物所引起的光學(xué)變化而進(jìn)行。更優(yōu)選地，所述光學(xué)變化是光散射強度或透射光量的改變。
在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑中，作為對象物質(zhì)的抗原或抗體包括但不特別限于任何通常可通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、細(xì)菌、病毒、半抗原等等。其中優(yōu)選的是蛋白質(zhì)，其為臨床化驗中通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行測定的主要對象物質(zhì)。所述蛋白質(zhì)的例子包括激素(例如，LH(黃體生成素)、FSH(卵泡刺激素)、hCG(人絨毛膜促性腺激素)等等)、各類免疫球蛋白及其亞型、補體成分、各種感染性疾病的標(biāo)志物、人C反應(yīng)蛋白(在此簡稱人CRP)、白蛋白、類風(fēng)濕因子、血型抗原等等。其中，對象物質(zhì)優(yōu)選地為人白蛋白或CRP。
三羧酸和三羧酸鹽具有螯合能力，即有效地隔離反應(yīng)體系中二價和三價金屬離子的特性，所述金屬離子例如Ca2+、Fe3+等等。因此，當(dāng)抗原的分子結(jié)構(gòu)中存在金屬離子時，特異性結(jié)合抗原的抗體優(yōu)選地在抗原中的金屬離子被釋放時仍然能夠與抗原特異性地結(jié)合。在這種情況下，即使抗原的分子結(jié)構(gòu)中存在金屬離子并且金屬離子的釋放使抗原分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，此抗原仍能夠被檢測。
當(dāng)抗原的分子結(jié)構(gòu)中存在金屬離子，并且金屬離子的釋放使抗原分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，可在反應(yīng)體系中添加抗原所含有的金屬離子，以使得在抗原抗體反應(yīng)過程中，反應(yīng)體系內(nèi)存在所述金屬離子。
所添加的金屬離子的量取決于所用的三羧酸或三羧酸鹽所具有的螯合能力或其濃度、抗原保持金屬離子的能力等等。
在分子結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的抗原的一個例子是CRP，其結(jié)構(gòu)隨著結(jié)構(gòu)中是否存在Ca2+而改變。當(dāng)本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑中的抗原為CRP，而山羊抗人CRP多克隆抗體中包括一種無法與不含有Ca2+的人CRP結(jié)合的抗體，并且所使用的三羧酸為檸檬酸時，則相對于0.02M的檸檬酸，反應(yīng)體系中要優(yōu)選地加入0.02M的Ca2+。
當(dāng)一種抗原具有多個與一種抗體結(jié)合的位點時，此抗體優(yōu)選地是能夠與此抗原的多個結(jié)合位點相結(jié)合的單克隆抗體。單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞系通過分離并培養(yǎng)來自于融合細(xì)胞的單個細(xì)胞而建立，所述融合細(xì)胞同時具有產(chǎn)生單克隆抗體的能力和增殖的能力，其通過一種能產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與一種骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合過程而獲得。由此雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的所有抗體均具有相同的特性。雜交瘤細(xì)胞系具有很強的增殖能力并可以凍存。如果得到適當(dāng)?shù)目刂疲s交瘤細(xì)胞系不會耗竭。通過在培養(yǎng)基中或腹腔中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系并對其進(jìn)行純化，可持久地獲得具有相同特性的抗體。另一方面，通過將一種抗原注射入動物體內(nèi)，可使其血液中出現(xiàn)能夠與該抗原相結(jié)合的多種抗體，通過收集并純化其全部或部分血液可得到多克隆抗體。因此，多克隆抗體的特性取決于動物的個體差異、飼養(yǎng)環(huán)境、條件等等，因此很難持續(xù)獲得具有相同特性的抗體。而如果使用單克隆抗體，則有可能持續(xù)使用具有相同特性的抗體并可穩(wěn)定地使用該抗體作為試劑。這樣才有可能在使用免疫反應(yīng)測定方法或免疫反應(yīng)測定試劑的免疫反應(yīng)測定中獲得穩(wěn)定的結(jié)果。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑中所使用的抗體可以包括但不特別限于IgG、IgM、IgE、IgA和IgD的任何一型的抗體，只要其可以特異性結(jié)合抗原。其中，優(yōu)選IgG抗體，因為IgG抗體具有較少的非特異性反應(yīng)性并且相對地容易購得。用于生產(chǎn)抗體的動物包括但不限于兔、山羊和小鼠。由這些動物產(chǎn)生的抗體相對容易獲得并被廣泛使用。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法典型地可按下述步驟進(jìn)行將三羧酸或三羧酸鹽加入到緩沖液中以維持反應(yīng)體系的pH值為酸性，優(yōu)選地為4-6，更優(yōu)選地為4.5。在抗原抗體反應(yīng)中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度優(yōu)選地為不超過0.3M，更優(yōu)選地為不超過0.2M，特別優(yōu)選地為不超過0.1M。三羧酸或三羧酸鹽也可以用作緩沖液。將含有針對一種抗原或抗體(對象物質(zhì))的抗體或抗原的溶液或樣品(標(biāo)本)之一與緩沖溶液混合，然后將另一種與所得緩沖液混合，以形成反應(yīng)體系。對反應(yīng)體系中的免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測。
在反應(yīng)體系中加入三羧酸或三羧酸鹽及加入緩沖液以維持其為酸性的方法，以及調(diào)整反應(yīng)體系的pH值的方法，并不限于上述的方法。例如，三羧酸或三羧酸鹽和緩沖液可以按滿足上述要求的方式加入到含有針對一種抗原或抗體(對象物質(zhì))的抗體或抗原的溶液中。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑典型地可按下述步驟進(jìn)行制備。
分別制備針對一種抗原或抗體(對象物質(zhì))的抗體或抗原以及三羧酸或三羧酸鹽，然后進(jìn)行下面的步驟。只要能夠達(dá)到三羧酸或三羧酸鹽的效果，含有針對一種抗原或抗體(對象物質(zhì))的抗體或抗原的溶液中可以含有任何成分。含有三羧酸或三羧酸鹽的溶液的pH值優(yōu)選地為4-6，更優(yōu)選地為4.5，以便具有緩沖能力，以維持抗原抗體反應(yīng)過程中的pH值為酸性。緩沖液和三羧酸或三羧酸鹽溶解于純水中，并調(diào)整其濃度以使得抗原抗體反應(yīng)中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度優(yōu)選地為不超過0.3M，更優(yōu)選地為不超過0.2M，特別優(yōu)選地為不超過0.1M。如果能夠滿足上述條件，緩沖液和三羧酸或三羧酸鹽可分別配制成溶液。三羧酸或三羧酸鹽也可以用作緩沖液。
三羧酸或三羧酸鹽可以加入到含有針對一種抗原或抗體(對象物質(zhì))的抗體或抗原的溶液中。在這種情況下，三羧酸或三羧酸鹽可以按滿足上述要求的方式配制成溶液，再以此溶液通過透析或凝膠過濾的方法，將三羧酸或三羧酸鹽加入到含有針對一種抗原或抗體(對象物質(zhì))的抗體或抗原的溶液中，以便交換低分子量成份。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑，將三羧酸或三羧酸鹽加入到免疫反應(yīng)體系中，將反應(yīng)體系的pH值調(diào)定為酸性，由此提高抗原抗體結(jié)合免疫反應(yīng)的測定值，并解決在抗原過量所產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象。在使用水溶性聚合物的傳統(tǒng)方法中，必須加入高濃度的水溶性聚合物或使用高分子量的水溶性聚合物，以提高抗原抗體反應(yīng)檢測的測定值，以在保持滿意的S/N比的同時進(jìn)行穩(wěn)定的測定。但在這種情況下，溶液的粘稠度增加，因此給操作用于分析的溶液帶來困難。反之，本發(fā)明所使用的三羧酸或三羧酸鹽是小分子量物質(zhì)，這樣可避免增加溶液的粘稠度，并使得用于分析的溶液易于操作。
進(jìn)一步地，在抗原過量所產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象可以得到解決，由此可減小因?qū)ο笪镔|(zhì)濃度過高導(dǎo)致的測定值的降低。因此，可拓寬高測定值和陽性樣品的區(qū)域，由此擴大可檢測濃度的范圍。
實施例下面將通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行描述。本發(fā)明不僅限于這些實施例。
(實施例1)下文將描述一種制備試劑的方法，其中將人白蛋白作為對象物質(zhì)。在此實施例中，將描述一種制備用于玻片凝集法、懸度測定法或濁度測定法的試劑的方法，所述試劑包含抗體溶液和含有三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液。
下述緩沖液等以經(jīng)過Milli-Q SP TOC(Millipore制造)過濾的純水配制。所有試劑，如鹽、緩沖液等等，如未經(jīng)特別指出，均來自Wako精細(xì)化工廠。聚乙二醇6000和反烏頭酸為超純試劑，其他均為保證試劑。
首先制備抗體溶液。收集經(jīng)人白蛋白免疫的兔的抗血清，通過蛋白A柱層析法純化得到兔抗人白蛋白多克隆抗體。結(jié)合蛋白A的凝膠為Amersham Pharmacia產(chǎn)品。用于純化的平衡緩沖液含有1.5M的甘氨酸和3.0M氯化鈉，pH值為8.9。洗脫緩沖液包含0.1M的檸檬酸，pH值為4.0。純化如下進(jìn)行。將體積比交換柱內(nèi)裝的膠的體積多5倍的平衡緩沖液通過交換柱使之平衡，之后用平衡緩沖液雙倍稀釋含有相應(yīng)于交換柱全部結(jié)合能力10-20％的量的抗體的抗血清。稀釋液通過交換柱使得血清中的抗體和蛋白A結(jié)合。之后，平衡緩沖液被連續(xù)地通過交換柱直到不能被蛋白A結(jié)合的血清成分不再從交換柱中流出，如此完成對交換柱的洗滌。之后，將洗脫緩沖液通過交換柱洗脫與蛋白A結(jié)合的抗體。洗脫的抗體成分被放置在分子量截留為10,000的透析柱上。利用大約100倍體積的含0.05M 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(Dojin生產(chǎn)，下面簡稱為MOPS)，0.15M氯化鈉，0.04wt％NaN3和pH值為7.4的緩沖溶液進(jìn)行透析數(shù)次以交換緩沖液中的成分。其后，通過在280nm處測定吸光度來檢測抗體的濃度。用和透析過程中使用的緩沖液相同的緩沖液調(diào)整抗體濃度到3.0mg/ml。所得溶液被認(rèn)為是抗體溶液?？贵w濃度無需如此嚴(yán)格限制。制備好的抗體溶液可以保存在室溫下，然而，優(yōu)選地保存在低溫以防止抗體的變性，更優(yōu)選的保存在4℃。
包含三羧酸或三羧酸鹽的緩沖溶液按如下制備。檸檬酸和反烏頭酸可以用作三羧酸或三羧酸鹽來制備兩種緩沖液。
包含檸檬酸的緩沖液按如下制備。稱取相應(yīng)于終濃度為0.05M量的檸檬酸單水化合物，稱取相應(yīng)于終濃度為4wt％量的聚乙二醇6000。將檸檬酸單水化合物和聚乙二醇6000溶解在大約為90％目標(biāo)制備體積的純水中。將NaOH水溶液加到所得溶液中以調(diào)整pH到4.5，用純水把所得溶液調(diào)整到目標(biāo)體積。制備好的緩沖液保存在室溫。
包含反烏頭酸的緩沖液按如下制備。稱取相應(yīng)于終濃度為0.05M量的反烏頭酸，稱取相應(yīng)于終濃度為4wt％量的聚乙二醇6000。將反烏頭酸和聚乙二醇6000溶解在大約為90％目標(biāo)制備體積的純水中。將NaOH水溶液加到所得溶液中以調(diào)整pH到4.5，用純水把所得溶液調(diào)整到目標(biāo)體積。制備好的緩沖液保存在室溫。
將至少一種如此制備的包含三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液與抗體溶液混合來制備免疫反應(yīng)測定試劑。
(實施例2)接下來，下面將描述一種制備以人CRP為對象物質(zhì)的試劑的方法。人CRP是一種含有5個具有相同結(jié)構(gòu)的亞基的物質(zhì)，因此對于單一抗體有多個結(jié)合位點。因此，單一的抗CRP單克隆抗體能被用于制備用于均質(zhì)免疫反應(yīng)測定的試劑。可以使用的單克隆抗體不止一種。
在這個實施例中，制備一種包含兩種抗體溶液，也就是多克隆抗體溶液和單克隆抗體溶液，以及一種含有三羧酸或三羧酸鹽緩沖液的試劑。
首先，將描述一種利用多克隆抗體溶液制備試劑的方法?？贵w溶液按如下制備。利用蛋白G柱層析法從用人CRP免疫的山羊中所收集的抗血清中純化山羊抗人CRP多克隆抗體。安裝在柱上的蛋白G固定膠購自Amersham-Pharmacia。用于純化的平衡緩沖液包含0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH值為7.0。洗脫緩沖液包含0.1M甘氨酸和pH值為2.7。柱層析法純化和透析的緩沖液交換按照與實施例1相似的方式進(jìn)行。之后，通過檢測280nm處的吸光度來測定抗體濃度。用與透析過程中所使用的緩沖液相同的緩沖液調(diào)整抗體濃度到1.0mg/ml，制成抗體溶液。
人CRP的結(jié)構(gòu)的改變?nèi)Q于鈣離子的存在與否。因此，當(dāng)組成試劑的抗體中含有不能與無鈣離子的人CRP結(jié)合的抗體時，三羧酸或三羧酸鹽的螯合作用使得無鈣離子的人CRP增加，由此顯著地減少了抗原抗體反應(yīng)率。上述制備的多克隆抗體溶液中含有一種不能與無鈣離子的人CRP結(jié)合的抗體。因此，鈣離子被加入到下面描述的含三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液中以保持人CRP的結(jié)構(gòu)。
包含三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液按如下制備。使用檸檬酸作為三羧酸或三羧酸鹽。
稱取相應(yīng)于終濃度為0.05M量的檸檬酸單水化合物，稱取相應(yīng)于終濃度為0.02M量的氯化鈣，稱取相應(yīng)于終濃度為4wt％量的聚乙二醇6000。將檸檬酸單水化合物、氯化鈣和聚乙二醇6000溶解在大約為90％目標(biāo)制備體積的純水中。將NaOH水溶液加到所得溶液中以調(diào)整pH到4.5，用純水把所得溶液調(diào)整到目標(biāo)體積。制備好的緩沖液保存在室溫。
下面，將描述利用單克隆抗體溶液的試劑。做為一種單克隆抗體，所用的抗體即使當(dāng)反應(yīng)體系中加入螯合劑，如0.02M乙二胺四乙酸時仍不會喪失和人CRP的結(jié)合能力。也就是說，當(dāng)鈣離子從人CRP釋放后，此抗體仍能特異性地結(jié)合到無鈣離子的人CRP。
一種抗體溶液按如下制備。本實施例中使用的鼠抗人CRP單克隆抗體是通過將產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞(工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號為FERM BP-6620)注射到鼠腹腔內(nèi)使其增生后獲取的。用實施例1描述的柱層析法從獲取的腹水中純化抗體。
腹水按如下獲取。利用retired雌性BALB/c鼠來生成腹水。通過在混合有5-15％體積的胎牛血清的RPMI 1640(SIGMA生產(chǎn))培養(yǎng)基中使雜交瘤細(xì)胞增殖，之后用RPMI 1640培養(yǎng)基離心洗滌，用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，達(dá)到1×106到107細(xì)胞/毫升濃度，來制備用于注射到腹腔的雜交瘤細(xì)胞懸液。將0.5-1.0毫升的姥鮫烷注射到鼠的腹腔中。7天后，將0.5-1.0毫升的上述細(xì)胞懸液注射到鼠中。當(dāng)觀察到有腹水形成后，從鼠中收集腹水。
柱層析法純化后的抗體樣本被放置在分子量截留為10,000的透析柱上。利用大約100倍體積的含0.04wt％NaN3(8g/l氯化鈉，0.2g/l氯化鉀，1.15g/l磷酸氫二鈉十二水，0.2g/l磷酸二氫鉀，pH值7.4)的PBS緩沖溶液進(jìn)行透析數(shù)次以交換緩沖液中的成分。其后，通過檢測280nm處的吸光度來測定抗體的濃度。用和透析過程中所使用的緩沖液相同的緩沖液調(diào)整抗體濃度到1.0mg/ml，制成抗體溶液。
包含三羧酸或三羧酸鹽的緩沖溶液按如下制備。以檸檬酸和反烏頭酸作為三羧酸或三羧酸鹽來制備兩種緩沖液。在這個實施例中，人CRP中是否擁有的鈣離子所引起的人CRP結(jié)構(gòu)的改變不影響抗體。因此，鈣離子不用加入到緩沖液中。
包含檸檬酸的緩沖液按如下制備。稱取相應(yīng)于終濃度為0.05M量的檸檬酸單水化合物，稱取相應(yīng)于終濃度為4wt％量的聚乙二醇6000。將檸檬酸單水化合物和聚乙二醇6000溶解在大約為90％目標(biāo)制備體積的純水中。將NaOH水溶液加到所得溶液中以調(diào)整pH到4.5，用純水把所得溶液調(diào)整到目標(biāo)體積。制備好的緩沖液保存在室溫。
包含反烏頭酸的緩沖液按如下制備。稱取相應(yīng)于終濃度為0.05M量的反烏頭酸，稱取相應(yīng)于終濃度為4wt％量的聚乙二醇6000。將反烏頭酸和聚乙二醇6000溶解在大約為90％目標(biāo)制備體積的純水中。將NaOH水溶液加到所得溶液中以調(diào)整pH到4.5，用純水把所得溶液調(diào)整到目標(biāo)體積。制備好的緩沖液保存在室溫。
上述制備的抗體溶液的濃度并非僅限于此。制備好的抗體溶液可以保存在室溫下，然而，優(yōu)選地保存在低溫以防止抗體的變性，更優(yōu)選的保存在4℃。
將至少一種如此制備的包含三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液與抗體溶液混合來制備免疫反應(yīng)測定試劑。
應(yīng)用實施例1和2中制備好的試劑的一種方法是混合含有抗原的樣本(標(biāo)本)、一種抗體溶液，和含有三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液以制備反應(yīng)體系?？梢允褂萌魏位旌戏椒??；旌媳壤拇_定依賴于所需抗原濃度的測定范圍。通過測定這些混合物制備的反應(yīng)體系中生成的抗原抗體免疫反應(yīng)，可以確定樣本中抗原的濃度。
通過混合，添加的成分如一種緩沖液、三羧酸或三羧酸鹽、聚乙二醇等可以被稀釋為低于起初濃度的濃度。如果稀釋濃度和起初濃度的差異在10％以內(nèi)，測定的結(jié)果與起初濃度獲得的結(jié)果沒有大的差異，也就是沒有大的影響。為了避免稀釋引起的濃度之間的差異，制備試劑中的各種物質(zhì)時要考慮到混合所引起的稀釋，以便使得每種物質(zhì)的濃度是目標(biāo)濃度。
應(yīng)注意到抗體可以被固定在一種小顆粒載體上，如乳膠、金膠，磁性顆粒，或者，抗體可以被一種酶，一種染料，一種熒光物質(zhì)等標(biāo)記，盡管這些沒有在實施例1和2中描述。
緩沖液成分和抗體溶液的pH值并不局限在上面描述的組成和pH值。例如，當(dāng)某種組成的試劑制備后，可以用含有三羧酸或三羧酸鹽的酸性緩沖液進(jìn)行透析以允許抗體溶液含有三羧酸或三羧酸鹽來保持反應(yīng)體系中酸性的pH值。
在實施例1和2中，用NaOH調(diào)整pH，相應(yīng)的，可以應(yīng)用氫氧化物如KOH、LiOH、NH40H，Ca(OH)2，Mg(OH)2等。
在實施例1和2中，使用檸檬酸和反烏頭酸作為緩沖液中的三羧酸或三羧酸鹽。其他三羧酸或三羧酸鹽也可以應(yīng)用，包括，例如，異檸檬酸，無水檸檬酸，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水化合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸三鉀單水化合物，檸檬酸三銨，檸檬酸氫二銨，檸檬酸鈣四水化合物，無水檸檬酸鎂，檸檬酸三鋰四水化合物，檸檬酸銅(II)2.5水化合物，DL-異檸檬酸三鈉，和無水順烏頭酸，這些都可以單獨或混合使用。在混合使用中，pH值可以按如下調(diào)整如果純水中溶解液的pH值比目標(biāo)pH值更偏堿性，可以用鹽酸等；如果pH值是更偏酸性的，可以應(yīng)用上面描述的氫氧化物或其他等。相應(yīng)的，三羧酸或三羧酸鹽混合比例可以用于調(diào)整pH值。
在實施例1和2中，含有三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液主要因為三羧酸或三羧酸鹽而具有緩沖能力。添加到試劑中的三羧酸或三羧酸鹽的濃度并無特別的限制。或者，其他的緩沖液可以被用于維持試劑的主要的緩沖能力，或者和三羧酸聯(lián)合應(yīng)用來保持緩沖能力。
(實施例3)
在這個實施例中，通過與免疫反應(yīng)測定方法中常用的中性反應(yīng)體系比較，顯示了含有三羧酸或三羧酸鹽的酸性反應(yīng)體系在抗原抗體反應(yīng)中的作用。利用免疫學(xué)的懸度測定法測定人白蛋白來進(jìn)行比較。實施例1中制備的試劑被用于制備含有三羧酸或三羧酸鹽的酸性反應(yīng)體系。
這里，作為含有三羧酸或三羧酸鹽的緩沖液，含有檸檬酸或其鹽作為主要緩沖物并具有與在實施例1中制備的相似組成的緩沖液被稱為檸檬酸緩沖液，而含有反烏頭酸或其鹽作為主要緩沖物并具有與在實施例1中制備的相似組成的緩沖液被稱為烏頭酸緩沖液。
做為一個對比例，MOPS用于制備構(gòu)成中性反應(yīng)體系的緩沖液，這個緩沖液的濃度和pH值設(shè)定為常用數(shù)值，也就是，0.05MMOPS，4wt％聚乙二醇6000，和pH值為7.4。這里，稱之為MOPS緩沖液。相同的抗體溶液被檸檬酸緩沖液和烏頭酸緩沖液分享(shared)。
人白蛋白(Wako Pure化學(xué)公司生產(chǎn))做為抗原溶解在緩沖液(0.05M MOPS，pH值7.4)中形成0，5，10，30，50或100mg/dl不等濃度?？贵w和抗原溶液(標(biāo)本)在使用前都存放在4℃，各種緩沖液存放在室溫。
一個自制的設(shè)備用于測定，其按如下制作。一個具有680nm波長，調(diào)定于270Hz和15mW輸出功率的半導(dǎo)體激光指示器(KikohGiken制造，型號為MLXS-D-12-680-35)作為光源。精確測定可見和紅外光的硅制光電二極管(Hamamatsu Photonics制造，型號為S2387-66R)作為測定儀。將厚度為0.1cm的光學(xué)玻璃片粘和一起做成一個小杯，其為體積大約為200ul的正方形棱鏡形狀。小杯放置在離光源0.5cm處，小杯的一邊和光源垂直，測定儀放置在距離小杯5.5cm處，與光源有著90°的夾角。在小杯和測定儀之間放置光線遮蔽管來避免零散的光線進(jìn)入測定儀。依賴于測定儀測定到的光量的電流信號被電流-電壓轉(zhuǎn)換電路(106V/A)和一個放大器(有效的放大器)放大為100倍的電壓信號。之后，電壓信號通過鎖定同步(lock-in)的放大器(NF公司生產(chǎn)，型號為5610B)完成相位-敏感測定，然后通過GPIB控制輸入到電腦。
對于每種緩沖液，不同濃度的人白蛋白按如下測定。反應(yīng)體系的混合比例為178ul緩沖液，9ul人白蛋白溶液和7ul的抗體溶液。反應(yīng)體系中抗體和白蛋白的終濃度分別為大約0.11mg/ml以及測定使用的白蛋白溶液濃度乘以0.046。
首先，在小杯中按上面描述的體積加入緩沖液和人白蛋白溶液，攪拌混合。然后，往小杯中按上面描述的體積加入抗體溶液，攪拌混合，以形成抗原抗體反應(yīng)。在加入抗體溶液前10秒開始測定散射光量，每0.5秒一次連續(xù)測定300秒。測定值用電壓值表示。通過在測定每個反應(yīng)之前對在小杯中放置的純水進(jìn)行測定，以此為基礎(chǔ)對測定數(shù)值進(jìn)行糾正以消除小杯污染對測定的影響。不同時間獲得的測定值被200-300秒平均。得到的平均結(jié)果被認(rèn)為是各種濃度的人白蛋白溶液的測定值?；谠诩尤肟贵w溶液前10秒獲得的測定值可以確定抗原自身凝集的發(fā)生，不同濃度的人白蛋白溶液的測定值要減去這個測定值的平均值。測定在室溫下進(jìn)行(大約20℃)測定后，通過利用pH計(Shindengen電子廠生產(chǎn)，商標(biāo)名PHBOY-P2)測定混合液pH值來觀察各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液對反應(yīng)體系pH值的影響。
結(jié)果是用于每個測定的各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液的pH值和起初緩沖液的pH值是一致的。
圖1顯示了相應(yīng)于各種緩沖液的最大到100mg/dl的不同濃度的白蛋白溶液的測定結(jié)果的曲線。垂直軸表示的是電壓值，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人白蛋白溶液。圖1說明測定的電壓值越高，進(jìn)入測定儀的散射的光量越多。散射的光量越多說明反應(yīng)體系的混濁度越高和抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物越大量。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人白蛋白溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有白蛋白時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。
象圖1顯示的，當(dāng)檸檬酸緩沖液和反烏頭酸緩沖液用于抗原抗體反應(yīng)測定時的測定值(相應(yīng)的在圖1中，用實心圓和空心圓表示)要高于當(dāng)用MOPS緩沖液作為對照樣本時的測定值(圖1中用實心三角表示)。當(dāng)應(yīng)用MOPS緩沖液時，測定值從30mg/dl附近的頂峰開始顯著減少，原因是在抗原過量區(qū)域的區(qū)帶現(xiàn)象。相反的，當(dāng)應(yīng)用檸檬酸緩沖液時，頂峰類似于MOPS緩沖液在30mg/dl附近，因在抗原過量區(qū)域產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象所產(chǎn)生的測定值的減少被抑制。當(dāng)應(yīng)用反烏頭酸緩沖液時，頂峰被觀察到有輕度的改變，因在抗原過量產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象所產(chǎn)生的測定值的減少被進(jìn)一步抑制。
根據(jù)上面描述的結(jié)果，可以確定本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法能被用于增加抗原抗體反應(yīng)的測定值。因此，也能確定抗原過量區(qū)域產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象能被解決。
可以確定本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定試劑能被用于增加抗原抗體反應(yīng)的測定值。因此，也能確定抗原過量區(qū)域產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象能被解決。
在臨床檢測中，檢測尿中排泄的微量白蛋白能做為糖尿病腎病的早期診斷標(biāo)記物。在多個測定方法和試劑(見Shin-Tonyobyosei-JinshoHasshoyobo-to-Shintenboshi[新糖尿病腎病，預(yù)防發(fā)生和發(fā)展]，Yukio Shigeta，Yoshizo Umitsu等，第131頁(1992))中，0.1-20mg/dl范圍做為量化范圍。對于傳統(tǒng)的應(yīng)用于利用免疫學(xué)的懸度測定法的測定和這些測定的試劑的中性緩沖液，必須要通過增加抗體濃度或通過稀釋減少抗原濃度來消除抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象，其根據(jù)是均質(zhì)免疫反應(yīng)是一種平衡反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑，提供了一種測定人白蛋白的方法和試劑，其中抗體濃度可以更低，不需要抗原的稀釋，并能消除在抗原過量區(qū)域形成的區(qū)帶現(xiàn)象。例如，根據(jù)本實施例的測定結(jié)果，提供了一個測定范圍，其中至少20mg/dl的測定值是陽性的，與用傳統(tǒng)的中性緩沖液體系測定相比，其能夠測定有著更廣的濃度范圍的白蛋白，并且可以不考慮抗原過量區(qū)域造成的區(qū)帶現(xiàn)象的影響。
(實施例4)接下來，利用檸檬酸和反烏頭酸作為三羧酸或三羧酸鹽來研究其影響基于免疫學(xué)的懸度測定法的抗原抗體反應(yīng)的pH值依賴性。結(jié)果將在下面描述。人白蛋白溶液按實施例3描述的同樣方式制備。人白蛋白溶液濃度為0，5，10，30，50，或100mg/dl。使用實施例1中描述的抗體溶液。
為了研究檸檬酸的pH值依賴性，分別制備了一種含有0.05M檸檬酸和4wt％量的聚乙二醇6000的溶液和一種含有0.05M檸檬酸三鈉和4wt％量的聚乙二醇6000，然后混合一起得到有著3.5，4.0，4.5，5.0，5.5或6.0pH值的檸檬酸緩沖液。
為了研究反烏頭酸的pH值依賴性，調(diào)整一種含有0.1M反烏頭酸和4wt％量的聚乙二醇6000的溶液得到有3.5，4.0，4.5，5.0，5.5或6.0pH值的反烏頭酸緩沖液。
MOPS緩沖液作為對比例。設(shè)備和測定方法類似于實施例3。測定在室溫下進(jìn)行(大約20℃)。測定后，利用pH計測定有著各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液的pH值以觀察混合液對反應(yīng)體系pH值的影響。
結(jié)果顯示在圖2和圖3。用于每個測定的各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液的pH值與緩沖液的pH值相同。
圖2顯示了相應(yīng)于各種pH值的檸檬酸緩沖液的最大到100mg/dl的不同濃度的白蛋白溶液的測定結(jié)果的曲線。垂直軸表示的是電壓值，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人白蛋白溶液。圖3顯示了相應(yīng)于各種pH值的反烏頭酸緩沖液的最大到100mg/dl的不同濃度的白蛋白溶液的測定結(jié)果的曲線。類似圖2，垂直軸表示的是電壓值，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人白蛋白溶液。圖2和3中曲線圖按與圖1相同的方式評價。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人白蛋白溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有白蛋白時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。
應(yīng)用4.0到5.5pH值范圍的檸檬酸緩沖液和4.5到5.0pH值范圍的烏頭酸緩沖液的測定顯示定量化在低的濃度范圍沒有遇到麻煩，且與使用MOPS緩沖液(圖2和圖3中用x表示)的對比例相比，其測定值有所增加。進(jìn)一步的，解決了抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。對于兩種緩沖液此類效應(yīng)在pH4.5時最大化(在圖2中用實心三角表示和在圖3中用空心圓表示)。
對于檸檬酸緩沖液，當(dāng)pH值為小于4.0(在圖2中用實心圓表示)或為6.0或更高時(圖2中用空心四方形表示)，沒有觀察到測定值的增加且測定值要低于基于MOPS緩沖液的測定值，進(jìn)一步，觀察到其沒有解決抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。在另一方面，對于反烏頭酸緩沖液，當(dāng)pH值是5.5或更高(在圖3中用空心三角和實心四方形表示)，沒有觀察到測定值的增加且測定值實際上等于或低于基于MOPS緩沖液的測定值，進(jìn)一步，觀察到其沒有解決抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。
進(jìn)一步，對于烏頭酸緩沖液，當(dāng)pH值為4.0，增加了非特異性混濁度使得在低濃度范圍的定量測定遇到了麻煩，然而，觀察到其增加了測定值并解決了抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低(在圖3中用實心圓表示)。
上面描述的結(jié)果總結(jié)如下?？紤]到測定值的增加，或抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低，檸檬酸pH值優(yōu)選在4.0-6.0范圍和反烏頭酸pH值優(yōu)選在4.0-5.5范圍。特別的，如果也要考慮到定量化，當(dāng)pH值為4.5時，上述效應(yīng)是最高的。說明pH值為4.5時有著最高效應(yīng)。
根據(jù)上面描述的結(jié)果，說明在應(yīng)用三羧酸或三羧酸鹽的免疫反應(yīng)測定方法中，反應(yīng)體系的pH值優(yōu)選設(shè)定在4.0到6.0范圍內(nèi)。也說明當(dāng)反應(yīng)體系的pH值設(shè)定為4.5時，能得到最高的效應(yīng)。
同樣的，說明當(dāng)一個抗原抗體反應(yīng)發(fā)生時，應(yīng)用三羧酸或三羧酸鹽的免疫反應(yīng)測定試劑被優(yōu)選制備使得反應(yīng)體系的pH值設(shè)定在4.0到6.0范圍內(nèi)。也說明當(dāng)一個抗原抗體反應(yīng)發(fā)生時，免疫反應(yīng)測定試劑被制備使得反應(yīng)體系的pH值設(shè)定為4.5時，能得到最高的效應(yīng)。
(實施例5)接下來，利用檸檬酸和反烏頭酸作為三羧酸或三羧酸鹽來研究基于免疫學(xué)的懸度測定法的抗原抗體反應(yīng)效應(yīng)的濃度依賴性。結(jié)果將在下面描述。
以人白蛋白做為對象物質(zhì)。人白蛋白溶液按實施例3描述的同樣方式制備。對于檸檬酸的濃度依賴性實驗，人白蛋白溶液濃度制備為0，5，10，30，50，或100mg/dl。對于反烏頭酸的濃度依賴性實驗，人白蛋白溶液濃度制備為0，10，20，30，40，60，80，100，或200mg/dl。使用實施例1中描述的抗體溶液。
為了研究檸檬酸的濃度依賴性，制備了一種含有0.01，0.02，0.1，0.2或0.3M檸檬酸和4wt％量的聚乙二醇6000的檸檬酸緩沖液(pH值4.5)。
為了研究烏頭酸的濃度依賴性，制備了一種含有0.01，0.02，0.05，0.1，0.2或0.3M反烏頭酸和4wt％量的聚乙二醇6000的反烏頭酸緩沖液(pH值4.5)。
使用MOPS緩沖液作為對比例。設(shè)備和測定方法類似于實施例3，除了在應(yīng)用反烏頭酸緩沖液的測定中，測定儀測定的依賴于光量的電流信號被放大為大約70倍的電壓信號。測定在室溫下進(jìn)行(大約20℃)。測定后，利用pH計測定有著各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液的pH值以觀察混合液對反應(yīng)體系pH值的影響。
結(jié)果顯示如下。當(dāng)應(yīng)用0.01和0.02M檸檬酸緩沖液和反烏頭酸緩沖液時，用于每個測定的各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液的pH值分別變?yōu)?.8和4.7。對于其他的緩沖液而言，混合液與緩沖液的pH值是一致的。根據(jù)實施例4的結(jié)果，pH值改變的影響可以被認(rèn)為是微小的且可被忽略。
圖4顯示了混合有最大到100mg/dl的不同濃度的白蛋白溶液的不同濃度的檸檬酸緩沖液的測定結(jié)果的曲線。圖5顯示了混合有最大到200mg/dl的不同濃度的白蛋白溶液的不同濃度的反烏頭酸緩沖液的測定結(jié)果的曲線。
在每個圖中，垂直軸表示的是電壓值，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人白蛋白溶液。圖4中曲線圖按與圖1相同的方式評價。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人白蛋白溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有白蛋白時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。
盡管緩沖液、抗體溶液和人白蛋白溶液的混合造成了檸檬酸和反烏頭酸濃度的輕度降低，降低的幅度不超過10％。因此，這種混合不認(rèn)為對結(jié)果有著顯著影響。
對于檸檬酸緩沖液，當(dāng)檸檬酸濃度不超過0.2M(在圖4中用圓和三角表示)時，測定值比使用MOPS緩沖液(在圖4中用x表示)的對比例的測定值高。測定值的增高能得到確認(rèn)。因此，也觀察到其解決了抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。檸檬酸緩沖液濃度越低，上面描述的效應(yīng)越高。當(dāng)檸檬酸濃度為0.3M(在圖4中用實心四方形表示)時，測定值比在MOPS緩沖液中的測定值要低，觀察到測定值沒有增高，也觀察到其沒有解決抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。
對于反烏頭酸緩沖液，所有0.01到0.3M濃度的測定值都要比使用MOPS緩沖液(在圖5中用x表示)的對比例的測定值高。也就是說，其對測定值的增高得到確認(rèn)。因此，也觀察到其解決了抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。當(dāng)濃度不超過0.2M時，這些效應(yīng)是更高的，當(dāng)濃度不超過0.1M時，效應(yīng)是尤其高的(在圖5中用圓和三角表示)，和濃度為0.05M時最高(在圖5中用實心三角表示)。當(dāng)濃度在0.2到0.05M時(在圖5中用三角和實心四方形表示)，反烏頭酸緩沖液濃度越低，效應(yīng)越高。當(dāng)濃度小于0.05M時(在圖5中用實心三角和圓表示)不能確認(rèn)效應(yīng)之間的顯著差異。
上面描述的結(jié)果總結(jié)如下?？紤]到測定值的增加，或抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低，為了獲得比常用的中性緩沖液更高的效應(yīng)，檸檬酸濃度優(yōu)選在不超過0.2M和反烏頭酸濃度優(yōu)選在不超過0.3M。特別的，也發(fā)現(xiàn)，兩種物質(zhì)的濃度更優(yōu)選在不超過0.1M，這樣，效應(yīng)能得到提高。
根據(jù)上面描述的結(jié)果，說明在應(yīng)用三羧酸或三羧酸鹽的免疫反應(yīng)測定方法中，反應(yīng)體系的三羧酸或三羧酸鹽濃度優(yōu)選設(shè)定在不超過0.3M。進(jìn)一步，當(dāng)反應(yīng)體系的三羧酸或三羧酸鹽濃度被設(shè)定為不超過0.1M時，可以獲得進(jìn)一步提高的效應(yīng)。
同樣的，說明應(yīng)用三羧酸或三羧酸鹽的免疫反應(yīng)測定試劑中，反應(yīng)體系的三羧酸或三羧酸鹽濃度優(yōu)選設(shè)定在不超過0.3M。進(jìn)一步，當(dāng)反應(yīng)體系的三羧酸或三羧酸鹽濃度被設(shè)定為不超過0.1M時，可以獲得進(jìn)一步提高的效應(yīng)。
(實施例6)接下來，利用免疫學(xué)的懸度測定法確認(rèn)當(dāng)三羧酸或三羧酸鹽與其他緩沖液混合使用對抗原抗體反應(yīng)的效應(yīng)。結(jié)果描述如下。進(jìn)行的比較基于人白蛋白的測定。人白蛋白溶液按實施例3中描述的制備。人白蛋白溶液濃度為0，5，10，20，30，50，70，100，200，300，或500mg/dl。使用一種按實施例1中描述的抗體溶液。使用檸檬酸和反烏頭酸作為三羧酸或三羧酸鹽。琥珀酸和上面描述的緩沖液一起使用。制備一種包含0.1M琥珀酸，0.02M檸檬酸和4wt％量的聚乙二醇6000的緩沖液(pH值4.5)，和一種包含0.1M琥珀酸，0.02M反烏頭酸和4wt％量的聚乙二醇6000的緩沖液(pH值4.5)。作為沒有三羧酸或三羧酸鹽存在的對比例，一種包含0.12M琥珀酸和4wt％量的聚乙二醇6000的緩沖液被制備。
將熒光分光光度計(Shimadzu公司生產(chǎn)，型號為RF-5300PC)用于測定。一個恒溫小杯架(Shimadzu公司生產(chǎn)，型號為206-15440)被放置在分光光度計的標(biāo)本槽內(nèi)。恒溫小杯架和一個恒溫水浴箱(TAITEC生產(chǎn)，商品名為COOLNIT BATH EL-15)相連。維持在25℃的水通過水浴箱循環(huán)使得測定保持在恒溫下進(jìn)行。用分光光度計測定的條件是激發(fā)光和熒光各有670nm的波長，熒光側(cè)和激發(fā)側(cè)兩者的帶寬都是3nm，靈敏度設(shè)定為高。
測定按如下進(jìn)行。2.87ml緩沖液和0.1ml抗體溶液攪拌混合。0.03ml人白蛋白溶液加入混合液中，攪拌混合。在反應(yīng)體系中抗體和人白蛋白的終濃度分別為大約0.1mg/ml和測定的白蛋白濃度乘以0.01。混合液轉(zhuǎn)入一個四方形小杯用于熒光分析。四方形小杯放在分光光度計上。一個T型的熱電偶(來于RS Components，型號為219-4696)插入小杯中。時間相關(guān)性的測定在加入人白蛋白的2分鐘后開始，每0.04秒一次持續(xù)300秒。用連接到T型熱電偶的多導(dǎo)溫度計(Advantest生產(chǎn)，型號為TR2114)來監(jiān)測測定過程中小杯的溫度。通過在測定每個反應(yīng)之前對在小杯中放置的純水進(jìn)行測定，以此為基礎(chǔ)對測定數(shù)值進(jìn)行糾正以消除小杯污染對測定的影響。不同時間獲得的測定值被200-300秒平均。得到的平均結(jié)果被認(rèn)為是各種濃度的人白蛋白溶液的測定值。測定后，通過利用pH計測定混合液pH值來觀察各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液對反應(yīng)體系pH值的影響。
結(jié)果顯示如下。用于每個測定的各種緩沖液、抗體溶液和不同濃度人白蛋白溶液的混合液的pH值與緩沖液的pH值是一致的。測定中小杯的溫度保持在25.5±1℃，用熱電偶測定。
圖6顯示了相應(yīng)于各種緩沖液的最大到500mg/dl的不同濃度的白蛋白溶液的測定結(jié)果的曲線。垂直軸表示的是散射光量的強度，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人白蛋白溶液。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人白蛋白溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有白蛋白時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。
做為結(jié)果，與只包含琥珀酸的對比例(在圖6中用實心三角表示)相比，包含檸檬酸或反烏頭酸的緩沖液(在圖6中用圓表示)增加了測定值。也就是，效應(yīng)是肯定的。因此，也觀察到其解決了抗原過量區(qū)域引起的區(qū)帶現(xiàn)象所造成的測定值的降低。
根據(jù)上面描述的結(jié)果，甚至當(dāng)三羧酸或三羧酸鹽和其他緩沖液一起使用時，效應(yīng)能是肯定的。
(實施例7)接下來，將應(yīng)用按實施例2制備的山羊抗人CRP多克隆抗體溶液的試劑對人CRP測定的效應(yīng)和在免疫反應(yīng)測定方法中常用的中性反應(yīng)體系做了比較。結(jié)果描述如下。用含有0.05M MOPS，0.04wt％和NaN3的緩沖液(pH7.4)稀釋純化的人CRP(國際Chemicon生產(chǎn)，號為21042246)而制備了測定中應(yīng)用的不同濃度的CRP溶液。制備的人CRP溶液濃度為0，10，20，30，50，70，100，或200mg/dl?？贵w溶液包含了使用按實施例2制備的多克隆抗體溶液的試劑。使用MOPS緩沖液作為不包含三羧酸或三羧酸鹽的對比例。
將按實施例3描述的相同設(shè)定的設(shè)備和按實施例3描述的相同的測定條件應(yīng)用于測定。利用和實施例3描述的相同的測定方法和測定數(shù)值處理方法，只有抗原溶液是不同的。
反應(yīng)體系中抗體和人CRP的終濃度分別是大約0.036mg/dl和測定中使用的人CRP溶液濃度乘以0.046。
結(jié)果顯示如下。圖7顯示了和最大濃度到200mg/dl的人CRP溶液混合的緩沖液的測定結(jié)果的曲線。垂直軸表示的是電壓值，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人CRP溶液。圖7的曲線按和圖1中相同的方式評價。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人CRP溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有CRP時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。
根據(jù)圖7，與使用MOPS緩沖液的對比例測定抗原抗體反應(yīng)(在圖7中用空心圓表示)相比，當(dāng)用按實施例2制備的包含有山羊抗人CRP多克隆抗體溶液、0.02M氯化鈣和檸檬酸的緩沖液所制備的試劑進(jìn)行測定(在圖7中用實心圓表示)時，更高的測定值得到明顯的肯定。
(實施例8)接下來，將應(yīng)用按實施例2制備的鼠抗人CRP單克隆抗體溶液的試劑對人CRP測定的效應(yīng)和在免疫反應(yīng)測定方法中常用的中性反應(yīng)體系做了比較。結(jié)果描述如下。
同實施例7一樣的方式制備用于測定的不同濃度的人CRP溶液。制備的人CRP溶液濃度為0，10，20，30，50，70，或100mg/dl。抗體溶液包含了使用按實施例2制備的單克隆抗體溶液的試劑。使用MOPS緩沖液作為不包含三羧酸或三羧酸鹽的對比例。
將按實施例6描述的相同設(shè)定的設(shè)備和按實施例6描述的相同的測定條件應(yīng)用于使用包含檸檬酸做為三羧酸或三羧酸鹽的試劑的測定。利用和實施例6描述的相同的測定方法和測定數(shù)值處理方法，僅抗原溶液是不同的。
反應(yīng)體系中抗體和人CRP的終濃度分別是大約0.033mg/dl和測定中使用的人CRP溶液濃度乘以0.010。
將按實施例3描述的相同設(shè)定的設(shè)備和按實施例3描述的相同的測定條件應(yīng)用于使用包含反烏頭酸做為三羧酸或三羧酸鹽的試劑的測定。利用和實施例3描述的相同的測定方法和測定數(shù)值處理方法，僅抗原溶液是不同的。
反應(yīng)體系中抗體和人CRP的終濃度分別是大約0.036mg/dl和測定中使用的人CRP溶液濃度乘以0.046。
結(jié)果顯示如下。圖8顯示了表示測定結(jié)果的曲線，其中使用了含有檸檬酸做為三羧酸或三羧酸鹽的試劑和將最高到100mgdl的不同濃度的人CRP加到各種緩沖液中。垂直軸表示的是散射光量的強度，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人CRP溶液。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人CRP溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有CRP時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。測定中小杯的溫度保持在25.5±1℃，用熱電偶測定。
根據(jù)圖8，使用MOPS緩沖液的對比例來測定抗原抗體反應(yīng)時，當(dāng)濃度達(dá)到20mg/dl之前，人CRP溶液之間的測定值沒有顯著差異。這樣，就不能充分地測定出人CRP濃度的差異(在圖8中用空心圓表示)。甚至當(dāng)測定值達(dá)到至少30mg/dl，不同測定值之間的差異和人CRP濃度的分辨率仍是低的。另一方面，當(dāng)利用包含檸檬酸的試劑進(jìn)行測定時，在測定不同濃度的人CRP溶液時可以清楚地得到更高的測定值。這樣，甚至，在所測定的人CRP溶液濃度達(dá)到20mg/dl時，也能測定出人CRP濃度的差異(在圖8中用實心圓表示)。
圖9顯示了表示測定結(jié)果的曲線，其中使用了含有反烏頭酸做為三羧酸或三羧酸鹽的試劑和將最高到100mgdl的不同濃度的人CRP加到各種緩沖液中。垂直軸表示的是散射光量的強度，而水平軸表示的是用于測定的不同濃度的人CRP溶液。曲線按圖1的方式評價。從相應(yīng)于同一緩沖液的、具有不同濃度的人CRP溶液所獲得測定值中減去一個當(dāng)該緩沖液不含有CRP時的測定值(0mg/dl)得到曲線值。測定中小杯的溫度保持在25.5±1℃，用熱電偶測定。
根據(jù)圖9，當(dāng)使用MOPS緩沖液的對比例用于測定抗原抗體反應(yīng)時，濃度達(dá)到10mg/dl之前的人CRP溶液之間的測定值沒有顯著差異。這樣，就不能充分地測定出人CRP濃度的差異(在圖9中用空心圓表示)。另一方面，當(dāng)利用包含反烏頭酸的試劑用于測定時，在測定不同濃度的人CRP溶液可以清楚地得到更高的測定值。這樣，甚至在測定濃度在10mg/dl以下的人CRP溶液時，也能測定出人CRP濃度的差異(在圖9中用實心圓表示)。
按上面實施例7和8描述的顯示，可以肯定本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定試劑能提高人CRP測定的測定值。
工業(yè)實用性如上所示，本發(fā)明能提供一種能明顯地提高測定值的免疫反應(yīng)測定方法和用于該方法的免疫反應(yīng)測定試劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明能提供一種能解決在抗原過量區(qū)域出現(xiàn)的區(qū)帶現(xiàn)象的免疫反應(yīng)測定方法和用于該方法的免疫反應(yīng)測定試劑。
權(quán)利要求
1.一種用于測定以包含在樣品中的抗原或抗體為對象物質(zhì)的免疫反應(yīng)測定方法，包括步驟A在樣品中加入三羧酸或三羧酸鹽和一種作為特異性結(jié)合物質(zhì)的能夠特異性地結(jié)合對象物質(zhì)的抗體或抗原；以及步驟B在由步驟A構(gòu)成的一種反應(yīng)體系中檢測由對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)所生成的抗原抗體復(fù)合物，所述反應(yīng)體系包含樣品、特異性結(jié)合物質(zhì)和三羧酸或三羧酸鹽，其中的反應(yīng)體系的pH值當(dāng)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行時是酸性的。
2.權(quán)利要求1中的免疫反應(yīng)測定方法，其中緩沖液被另外加入到反應(yīng)體系。
3.權(quán)利要求1或2中的免疫反應(yīng)測定方法，其中反應(yīng)體系的pH值是4到6。
4.權(quán)利要求1到3中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中反應(yīng)體系中三羧酸或三羧酸鹽的濃度不超過0.3M。
5.權(quán)利要求1到4中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中三羧酸是檸檬酸或烏頭酸。
6.權(quán)利要求1到5中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中反應(yīng)體系包含2-6wt％聚乙二醇。
7.權(quán)利要求1到6中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中抗原抗體復(fù)合物是凝集復(fù)合物。
8.權(quán)利要求7的免疫反應(yīng)測定方法，其中在步驟B中通過檢測凝集復(fù)合物造成的光學(xué)變化來測定凝集復(fù)合物。
9.權(quán)利要求1到8中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中抗原在其分子結(jié)構(gòu)中攜帶有金屬離子，而能特異性結(jié)合此抗原的抗體在金屬離子從此抗原釋放后仍能夠特異性地結(jié)合不含金屬離子的抗原。
10.權(quán)利要求1到9中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中抗原是一種具有相應(yīng)于至少一種抗體的多個結(jié)合位點的物質(zhì)，而抗體是一種能夠結(jié)合抗原的多個結(jié)合位點的單克隆抗體。
11.權(quán)利要求1到8中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中抗原是人白蛋白。
12.權(quán)利要求1到10中的任一項的免疫反應(yīng)測定方法，其中抗原是人C-反應(yīng)蛋白。
13.用于權(quán)利要求1的免疫反應(yīng)測定方法中的免疫反應(yīng)測定試劑，其中所述試劑包含三羧酸或三羧酸鹽以及能夠特異性結(jié)合對象物質(zhì)的作為特異性結(jié)合物質(zhì)的抗體或抗原，并且所述試劑被制備成當(dāng)對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時其pH值是酸性的。
14.權(quán)利要求13的免疫反應(yīng)測定試劑，其進(jìn)一步包含一種緩沖液。
15.權(quán)利要求13或14的免疫反應(yīng)測定試劑，其中pH值當(dāng)抗原抗體反應(yīng)發(fā)生時是4到6。
16.權(quán)利要求13到15中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其中當(dāng)抗原抗體反應(yīng)發(fā)生時三羧酸或三羧酸鹽的濃度不超過0.3M。
17.權(quán)利要求13到16中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其中三羧酸是檸檬酸或烏頭酸。
18.權(quán)利要求13到17中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其進(jìn)一步包含聚乙二醇，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)發(fā)生時，聚乙二醇濃度是2-6wt％。
19.權(quán)利要求13到18中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其中抗原在其分子結(jié)構(gòu)中攜帶有金屬離子，而能特異性結(jié)合此抗原的抗體在金屬離子從抗原釋放后仍能夠特異性地結(jié)合不含金屬離子的抗原。
20.權(quán)利要求13到19中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其中抗原是一種具有相應(yīng)于至少一種抗體的多個結(jié)合位點的物質(zhì)，而抗體是一種能夠結(jié)合抗原的多個結(jié)合位點的單克隆抗體。
21.權(quán)利要求13到18中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其中抗原是人白蛋白。
22.權(quán)利要求13到20中的任一項的免疫反應(yīng)測定試劑，其中抗原是人C-反應(yīng)蛋白。
23.一種免疫學(xué)測定一種包含在樣品中的對象物質(zhì)的方法，其包含在三羧酸或三羧酸鹽存在下和酸性條件下對象物質(zhì)與能特異性結(jié)合對象物質(zhì)的特異性結(jié)合物質(zhì)形成一個抗原抗體復(fù)合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種免疫學(xué)測定一種包含在樣本中的對象物質(zhì)的方法，其步驟包括在三羧酸或三羧酸鹽存在下和酸性條件下使對象物質(zhì)和能特異性結(jié)合到對象物質(zhì)的特異性結(jié)合物質(zhì)形成一種抗原抗體復(fù)合物。本發(fā)明還提供了在此方法中使用的包含三羧酸或三羧酸鹽的試劑。試劑中包含有一種對象物質(zhì)以及能免疫學(xué)和特異性地與對象物質(zhì)結(jié)合的特異性結(jié)合物質(zhì)。制備此試劑以使得對象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)能在酸性條件下結(jié)合在一起以形成抗原和抗體復(fù)合物。
文檔編號G01N33/53GK1463364SQ02802082
公開日2003年12月24日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者龜井明仁, 權(quán)丈紀(jì)子, 河村達(dá)朗, 平井真人 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社