高爾基體蛋白gp73定量測(cè)定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒，包括磁分離試劑的制備、酶反應(yīng)物的制備、反應(yīng)增強(qiáng)劑的配制、校準(zhǔn)品稀釋液的配制、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制、清洗濃縮液的配制和底物溶液的配制七個(gè)步驟。本實(shí)用新型高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒具有較高的靈敏度和特異性，更短的獲得檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間和更簡(jiǎn)便的操作方式，對(duì)肝癌的早期診斷具有重要意義。
【專利說(shuō)明】高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒，用于體外定量測(cè)定樣品血清中的高爾基體蛋白GP73含量。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌發(fā)病率在全世界是位列第四位、中國(guó)位列第二的惡性腫瘤，且在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，現(xiàn)總發(fā)病率已超過(guò)56萬(wàn)。肝癌發(fā)病之初較為隱匿，臨床難以檢出，臨床診斷檢出一般多為晚期，治療效果差，如若早期發(fā)現(xiàn)肝癌并且及時(shí)治療可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。
[0003]目前肝癌的檢測(cè)手段包括肝超聲影像分析和血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)，其中最常使用的血清學(xué)標(biāo)志物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌診斷中靈敏度不高，只有50%?60%的肝癌患者AFP呈陽(yáng)性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此，臨床需要一種更好地用于肝癌監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物。
[0004]近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤免疫等相關(guān)研究的飛速發(fā)展，研究者篩選出一些潛在的新的腫瘤標(biāo)志物，而高爾基體不但參與蛋白加工，還參與細(xì)胞分化及細(xì)胞間信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在細(xì)胞凋亡中扮演重要角色，其功能障礙可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其中，高爾基體糖蛋白73 (GP73)是最值得期待的血清標(biāo)志物之一。已經(jīng)有多個(gè)研究組驗(yàn)證了 GP73是一種新的肝癌標(biāo)志物。在以往的研究中多使用免疫印跡方法，這種方法不僅靈敏度低、特異性弱，在操作上也比較復(fù)雜，無(wú)法在臨床上普及應(yīng)用。經(jīng)專利檢索，GP73的檢測(cè)方法有多種包括ELISA、基因診斷等多種形式，但尚未見有將板式磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)應(yīng)用到高爾基體蛋白GP73的檢測(cè)中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本實(shí)用新型的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的高爾基體蛋白GP73板式磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。
[0006]本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種高爾基體蛋白GP73板式磁顆粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè)有微孔板和位于盒體底部的支撐板，其中微孔板由48或96個(gè)微孔組成，支撐板上開有多個(gè)孔，所述孔內(nèi)共放置有八個(gè)試劑瓶，所述八個(gè)試劑瓶?jī)?nèi)分別含有磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型的有益效果是:
[0009]本實(shí)用新型高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒具有較高的靈敏度和特異性，更短的獲得檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間和更簡(jiǎn)便的操作方式，對(duì)肝癌的早期診斷具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】[0010]圖1為本實(shí)用新型聞爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0011]圖2為圖1去掉盒蓋和微孔板后的俯視圖。
[0012]圖3為圖1中微孔板的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013]其中:
[0014]盒體I
[0015]盒蓋2
[0016]支撐板3
[0017]孔4
[0018]試劑瓶5
[0019]微孔板6
[0020]微孔7。
【具體實(shí)施方式】
[0021]參見圖1-圖3，本實(shí)用新型高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒，包括盒體I和盒體上方的盒蓋2，所述盒體I內(nèi)設(shè)有微孔板6和位于盒體I底部的由泡沫塑料制成的支撐板3，其中微孔板6由48或96個(gè)微孔7組成，支撐板3上開有多個(gè)孔4，所述孔4內(nèi)共放置有八個(gè)試劑瓶5，所述八個(gè)試劑瓶5內(nèi)分別含有磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0022]制備方法
[0023]步驟一、磁分離試劑的制備
[0024]一、磁珠緩沖液配制
[0025]1、稱取 TRIS 4.58g和 NaC16.81g 于 IL 容器中，然后稱取 0.96g TWEEN-20 于 20ml容器中加適量水使其完全溶解后，再倒入上述IL容器中；
[0026]2、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?br>
[0027]3、調(diào)節(jié)PH計(jì)測(cè)量其PH值，控制PH在7.95-8.05之間；
[0028]4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；
[0029]5、最后IL容器定容至1000ml,用0.2um濾器過(guò)濾；過(guò)濾完后貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫(kù)貯存。
[0030]二、磁分離試劑的制備
[0031]1、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ulDMS0中，取2mg抗GP73單克隆抗體溶于PH 9.5的0.lmol/L的PB緩沖液中至總體積為Iml ；
[0032]2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到上述GP73單克隆抗體溶液中，置室溫90min ；
[0033]3、然后將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ；
[0034]4、取0.5ml磁珠加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；[0035]5、每次加入1.5ml PH9.5的0.lmol/L的PB緩沖液，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；
[0036]6、加入 0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；
[0037]7、每次加入1.5ml PH7.2的0.lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30
秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；
[0038]8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0.05%的GP73磁分離試劑；
[0039]磁珠保存液配方為0.1% 854，0.05%吐溫-20，0.02%似吧，20%乙醇，41:保存。
[0040]9、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得本實(shí)用新型試劑盒中磁分離試劑。
[0041]步驟二、酶反應(yīng)物的制備
[0042]一、酶反應(yīng)物稀釋液的配制
[0043]1、取Tris 4.846g、HCl 2847 μ I于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢枋乖噭┩耆芙猓?br>
[0044]2、調(diào) PH,控制 PH 在 7.35-7.45 ；
[0045]3、稱取BSA 4g倒入上述燒杯中；
[0046]4、最后燒杯定容至400ml,用0.2um濾器過(guò)濾即得。
[0047]二、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與GP73抗原的偶聯(lián)
[0048]1、取GP73-3-cmo-BSA抗原Img放置于Iml玻璃管中；
[0049]2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的終濃度到達(dá)5mg/ml，然后充分混勻；
[0050]3、按照Imol抗原加入IOmol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到上述2溶液中，37°C恒溫箱中反應(yīng)1.5小時(shí)；
[0051]4、按照3mol抗原加入Imol的(HRP)的摩爾比往上述3的溶液中添加(HRP)，然后加入Iml的PH為7.4濃度為0.1M的PB緩沖液，置于37度恒溫箱中反應(yīng)3小時(shí)；
[0052]5、將上述4的溶液用ro-ΙΟ柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加獲得的酶反應(yīng)物稀釋液，混合均勻即得酶反應(yīng)物。
[0053]步驟三、反應(yīng)增強(qiáng)劑的配制
[0054]1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于IL容器中；用移液器將Proclin-300量取
0.2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
[0055]2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，然后調(diào)PH值，控制PH在7.35-7.45之間；
[0056]3、稱取Mak33 0.9g于上述IL容器中；最后定容至1000ml,完全溶解后,用0.2um濾器過(guò)濾。
[0057]步驟四、校準(zhǔn)品稀釋液的配制
[0058]1、稱取 Tris 7.268g 和 Hcl 4270 μ I 于 IL 的容器中，定容至 600ml ;
[0059]2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，校準(zhǔn)品稀釋液備用。
[0060]步驟五、校準(zhǔn)品的配制
[0061]校準(zhǔn)品濃度分別為50，130，300，450ng/ml。
[0062]步驟六、清洗濃縮液的配制[0063]1、稱取 Kcl 4g、NaC140g、蔗糖 IOg 于 IL 容器中；
[0064]2、稱取0.225g Tween-20于IOOml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL
容器中；
[0065]3、用移液器將Proclin-300量取0.225ml于盛有15ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
[0066]4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓?br>
[0067]5、調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7.45之間；
[0068]6、最后定容至1000ml,完全溶解后用0.2um濾器過(guò)濾即得。
[0069]步驟七、底物溶液的配制
[0070]一、底物溶液A的配制步驟
[0071]1、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對(duì)碘苯酚0.1mg于IL燒杯中；
[0072]2、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)PH，控制其范圍在7.95-8.05之間；
[0073]3、用0.2um濾器過(guò)濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻后即得。
[0074]二、底物溶液B的配制
[0075]1、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、過(guò)氧化脲0.1g和PC300 250ul于IL燒杯中；
[0076]2、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)PH控制其范圍在7.95-8.05之間；
[0077]3、用0.2um濾器過(guò)濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻后即得。
[0078]所得的產(chǎn)品分裝即為半成品，抽出三份經(jīng)過(guò)特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成高爾基體蛋白GP73微孔板式磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
[0079]工作原理:
[0080]本實(shí)用新型為雙抗體夾心法化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測(cè)方法。在標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入定量的酶標(biāo)GP73抗原、結(jié)合著磁性微粒的GP73單克隆抗體及穩(wěn)定增強(qiáng)劑。37°C孵育后，酶標(biāo)GP73抗原與標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中GP73競(jìng)爭(zhēng)的與結(jié)合著磁性微粒的GP73單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在外加磁場(chǎng)中直接沉淀，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉淀的復(fù)合物，然后加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測(cè)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。在檢測(cè)范圍內(nèi)，反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的GP73濃度成反比。
[0081]使用方法
[0082](I)樣品的前處理:
[0083]使用本試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，需先取出辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的GP73抗體、校準(zhǔn)品/待測(cè)樣品、GP73抗體磁顆粒、發(fā)光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30min，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C;準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對(duì)應(yīng)吸頭并且檢查化學(xué)發(fā)光儀是否工作正常。
[0084](2)操作步驟:
[0085]1、加50 μ I GP73校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測(cè)標(biāo)本至對(duì)應(yīng)微孔底部；[0086]2、加50 μ I酶反應(yīng)物至每一微孔中；
[0087]3、加50 μ I反應(yīng)增強(qiáng)劑至每一微孔中；
[0088]4、加50 μ I磁分離試劑至每一微孔中；
[0089]5、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s后，置37°C水浴30分鐘；
[0090]6、微孔板放至磁分離器上，確保每個(gè)微孔都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
[0091]7、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200 μ I稀釋后的清洗液至每一微孔中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時(shí)應(yīng)避免加樣力度過(guò)大而導(dǎo)致磁珠濺出，且混勻要徹底；
[0092]8、重復(fù)步驟6、7、6 —遍；
[0093]9、加100 μ I底物溶液至微孔中混勻3秒，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)；
[0094]10、如遇到高值HOOK樣本，為了避免出現(xiàn)高值HOOK效應(yīng)，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測(cè)試指標(biāo)選擇合適的稀釋倍數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。
[0095]以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Log值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對(duì)數(shù)曲線)，以各待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的GP73的濃度，其中縱坐標(biāo)為發(fā)光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為GP73濃度( 單位為ng/ml)。
[0096]性能指標(biāo)
[0097]I)準(zhǔn)確性:試劑盒校準(zhǔn)品與國(guó)家校準(zhǔn)品同時(shí)測(cè)定，兩條劑量-反應(yīng)曲線不顯著偏離平行。以國(guó)家校準(zhǔn)品為對(duì)照品，試劑盒校準(zhǔn)品試劑盒的實(shí)際值與標(biāo)示值之比應(yīng)該在
0.90-1.10的范圍內(nèi)
[0098]2)劑量-反應(yīng)曲線的線性:用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，在50_500ng/ml濃度范圍內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)的絕度值不低于0.9900
[0099]3)精密性:CV ^ 15% ;重復(fù)性:CV ^ 10%
[0100]4)最低檢出量-.(20ng/ml
[0101]5)質(zhì)控血清測(cè)定值:應(yīng)在質(zhì)控范圍內(nèi)
[0102]6)特異性:交叉反應(yīng)率應(yīng)小于0.2%
[0103]7)穩(wěn)定性:將試劑盒37°C放置3天，測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合上述I)~5)項(xiàng)要求
[0104]本實(shí)用新型具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0105]1、本實(shí)用新型將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)范圍寬，操作簡(jiǎn)單，無(wú)放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強(qiáng)。
[0106]2、本實(shí)用新型對(duì)所用的原材料進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量檢定，包括包被抗體的活性，磁顆粒的吸附性能和變異大小，(HRP)的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光持續(xù)時(shí)間等，對(duì)于(HRP)的標(biāo)記可以有不同的方法，通過(guò)反復(fù)探索和對(duì)比試驗(yàn)最終找到了簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法。
[0107]3、本實(shí)用新型采用一種新的專用穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及清洗濃縮液，使得反應(yīng)過(guò)程更加穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)靈敏有效，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，并且大大降低了產(chǎn)品成本。[0108]4、試劑盒中的磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測(cè)性能提供了有力保障。
[0109]5、本實(shí)用新型采用微孔板磁顆粒整合了兩種技術(shù)，主要體現(xiàn)在:(1)利用磁顆粒在相同體積的情況下表面積最大的原理，能夠結(jié)合更多的抗體，從而使得反應(yīng)的靈敏度更高，線性范圍更寬；(2)可以同時(shí)批量測(cè)量，適合大批量血清篩查。
【權(quán)利要求】
1.一種高爾基體蛋白GP73定量測(cè)定試劑盒，包括盒體(I)和盒體上方的盒蓋(2)，其特征是:所述盒體(I)內(nèi)設(shè)有微孔板(6)和位于盒體(I)底部的支撐板(3)，其中微孔板(6)由48或96個(gè)微孔(7)組成，支撐板(3)上開有多個(gè)孔(4)，所述孔(4)內(nèi)共放置有八個(gè)試劑瓶(5)，所述八個(gè)試劑瓶(5)內(nèi)分別含有磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK203479809SQ201320597351
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】奚偉紅, 王布強(qiáng), 王京, 嚴(yán)子禾, 高淑舫, 高磊 申請(qǐng)人:江蘇福隆生物技術(shù)有限公司