專利名稱：血細(xì)胞分離體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用外源凝集素分離血細(xì)胞的體系，尤其涉及從含有核成紅細(xì)胞(erythroblast)的樣品中有效除去非成核紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞，以分離和濃縮胎兒有核成紅細(xì)胞的體系。該有核成紅細(xì)胞是存在于孕婦的母體外周血或臍帶血中的胎兒有核細(xì)胞。并進(jìn)一步涉及用于檢驗染色體和基因的體系。
背景技術(shù)：
在基因診斷領(lǐng)域，長期期望研制出用于不危及胚胎即胎兒的產(chǎn)前診斷方法?，F(xiàn)在臨床應(yīng)用的基因診斷方法是侵入裝置，如羊水診斷、絨毛取樣和胎兒血液收集，尤其是經(jīng)羊水診斷的胎兒細(xì)胞取樣會作出確定的診斷，但也要承擔(dān)大約1/300流產(chǎn)的高度風(fēng)險。
另外，當(dāng)從存在于母體外周血中的母體血清生物化學(xué)標(biāo)記物，如AFP(α-胎蛋白)、hCG(絨毛膜促性腺激素)、uE3(尿雌激素三醇3，在懷孕期間胎兒腎上腺分泌的，用于胎兒-胎盤功能檢驗的一類雌激素)和抑制素A(一類促性腺激素)的改變預(yù)見胎兒畸形的方法需要使用非侵入裝置時，它們僅是用于需要采取羊水診斷的篩選方法，而且不能依賴其作出任何確定的診斷。
另一方面，關(guān)于母親和孩子血型不相容性的臨床研究清楚顯示胎兒細(xì)胞設(shè)法到達(dá)母體的循環(huán)體系。因而，如果能從母體血液中分離出混入的胎兒細(xì)胞，并且如果它們是有核細(xì)胞的話，它們的DNA和染色體能用于安全地作出確定的胎兒診斷。在1969年，Walknowska等人報道他們培養(yǎng)了母體外周淋巴細(xì)胞，并在30位懷有男胎孕婦的21位中發(fā)現(xiàn)一種46XY染色體組型。然而，從類似淋巴細(xì)胞的全部組群中提取含Y染色體的淋巴細(xì)胞是相當(dāng)困難的，且用尼龍羊毛柱或密度離心法對其進(jìn)行分離和濃縮的嘗試沒有成功產(chǎn)生有用的結(jié)果。另外，過去懷孕殘存的胎兒細(xì)胞的存在也是一個問題，并且考慮到對想得到的初生胎兒的檢測，確定的胎兒診斷的安全方法沒有任何進(jìn)展。
最近幾年，有短暫壽命和通常于母體中幾乎不存在的細(xì)胞——有核成紅細(xì)胞，作為存在于母體血液中的胎兒有核細(xì)胞吸引了一些注意力，而且它們用于作為診斷細(xì)胞的可能性的研究變得非常活躍。然而，它們在母體血液中的比例極低，占所有有核細(xì)胞的1/105至1/107，而且就像用淋巴細(xì)胞進(jìn)行胎兒細(xì)胞診斷，完成從母體有核細(xì)胞如白細(xì)胞中分離和檢測足夠數(shù)量的胎兒有核成紅細(xì)胞的過程存在技術(shù)障礙。
當(dāng)試圖通過使用運鐵蛋白受體抗體或磁珠的流式細(xì)胞計數(shù)的裝置來分離有核成紅細(xì)胞時，抗體的特異性問題阻礙了對含Y染色體的有核成紅細(xì)胞的有效檢測。
另一方面，有代替細(xì)胞分離的收集方法，對有核成紅細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒別，并且用顯微操縱術(shù)每次挑選一個，但將有核成紅細(xì)胞從大量母體有核細(xì)胞中區(qū)別出來的方法需要相當(dāng)?shù)膶I(yè)技術(shù)，并且極其耗時。因而，這種方法需要特殊的儀器，并且處理一個單一樣品要花費幾天時間。目前，可以從1cc的母體外周血中檢測到單個有核紅細(xì)胞。然而，為了建立普遍和實用的胎兒檢驗方法，用于以統(tǒng)計確定的方式檢驗基因和染色體，必需至少考慮30個胎兒細(xì)胞。當(dāng)考慮到從孕婦體內(nèi)安全收集的血液數(shù)量至多為10cc時，這種取樣方法變得不切實際。因此，迄今為止，仍強烈需求一種快速和方便的高產(chǎn)量分離和濃縮有核紅細(xì)胞的方法。
本發(fā)明人完成了針對碳水化合物鏈特殊相互作用的研究，并且獲得一個專利(日本專利第3139957)，該專利涉及用以各種碳水化合物鏈為支鏈的復(fù)合糖聚合物包覆培養(yǎng)皿等的基質(zhì)表面的細(xì)胞培養(yǎng)基，由此能選擇性粘附對這些碳水化合物鏈有親和性的外源凝集素。而且，他們發(fā)現(xiàn)使用外源凝集素的分離方法能用于分離和濃縮有核成紅細(xì)胞和未成熟的造血細(xì)胞，因而使對10-30個胎兒有核細(xì)胞的檢測成為可能(國際公開WO00/58443)。
當(dāng)分離和回收如有核成紅細(xì)胞的血細(xì)胞時，一般首先使用密度離心法對外周血進(jìn)行預(yù)處理，但發(fā)現(xiàn)在這種用密度離心法的預(yù)處理階段，有核成紅細(xì)胞受到破壞。例如，有核成紅細(xì)胞的比重在約1.077-1.095之間變化，當(dāng)使用有某種比重的高密度流體(如Ficoll等)時，有時在Ficoll層下面和上面的紅細(xì)胞層中都能檢測出有核成紅細(xì)胞，所以用密度分離法進(jìn)行的樣品分離會導(dǎo)致一些有核成紅細(xì)胞的損失。認(rèn)為這是由于含胎兒血色素和將要去核的胎兒有核成紅細(xì)胞的比重不確定。
而且，為了了解在用這種方法進(jìn)行有核成紅細(xì)胞分離和提純中的染色體的變異等等情況，它們必須用FISH(熒光原位雜交法)方法等進(jìn)行檢查，但這在制備作這項檢驗的樣品的過程中產(chǎn)生需要克服的實際問題。
因此，為了完全解決上述問題，本發(fā)明的主題是提供一種新的能用于臨床實踐的血細(xì)胞分離體系，基于使用外源凝集素對有核成紅細(xì)胞(NRBC)進(jìn)行的精確分離和回收。也就是，本發(fā)明提供一種使用外源凝集素從有限數(shù)量母體血液樣品的母體細(xì)胞中精確分離稀少胎兒有核細(xì)胞時，在預(yù)處理階段，在很大程度上防止成紅細(xì)胞損失的體系，因此有選擇性且高產(chǎn)量地分離、濃縮和回收想得到的未成熟胎兒細(xì)胞或NRBC’s，且提供一種生產(chǎn)含用這種體系分離和回收胎兒細(xì)胞的檢驗制劑的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的血液分離體系(1)包括從取自孕婦的血液樣品中主要除去非成核紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，以得到初級(粗)分離樣品的初步(粗)分離裝置，在高度防止含于母體血液樣品的各種類型血細(xì)胞中的胎兒有核細(xì)胞損失的情況下，用所述初級分離裝置分離和主要除去作為有核細(xì)胞的白細(xì)胞、非成核紅細(xì)胞、血小板等；(2)包括從所述初級分離裝置得到的一次分離樣品中除去殘存的非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞，以得到含濃縮胎兒有核細(xì)胞的二次(精確)分離樣品的二次(精確)分離裝置，二次分離裝置涉及所述初級分離樣品在滅活細(xì)胞和預(yù)定外源凝集素濃度的條件下，在表面固定著復(fù)合糖聚合物(glycoconjugate polymer)的基質(zhì)上培養(yǎng)，含于所述初級分離樣品中的胎兒有核細(xì)胞通過外源凝集素-碳水化合物相互作用與外源凝集素選擇性結(jié)合，使其濃縮和粘附于所述基質(zhì)，以形成二次分離樣品；和(3)包括制備用二次分離裝置得到的二次分離樣品的制備裝置，制備裝置涉及在預(yù)定條件下，將所述胎兒有核細(xì)胞被濃縮和粘附于其上的所述基質(zhì)離心，從而得到一種檢驗制劑，其中來自母體血液的胎兒有核細(xì)胞以有利于用FISH方法等進(jìn)行基因/染色體檢驗的狀態(tài)，以確定診斷的水平存在。
本發(fā)明的血液分離體系優(yōu)選進(jìn)一步包括使用得自上述制備裝置的檢驗制劑來檢驗其中所含胎兒有核細(xì)胞的染色體和/或基因的一種檢驗裝置。
而且，本發(fā)明也提供使用上述血細(xì)胞分離體系，生產(chǎn)用于產(chǎn)前胎兒診斷的檢驗制劑的方法，和用這種生產(chǎn)方法生產(chǎn)的檢驗制劑，其中未成熟胎兒細(xì)胞以有利于用FISH方法等進(jìn)行基因/染色體檢驗的狀態(tài)，以確定診斷的水平存在。
附圖簡述

圖1是示出本發(fā)明血細(xì)胞分離體系實例的框圖。
圖2是示出用300μg/ml外源凝集素(SBA)將來自母體血液的固定于復(fù)合碳水化合物聚合物所包覆的基質(zhì)上的血細(xì)胞的顯微鏡(×200)照片。
圖3是示出，用8μg/ml外源凝集素(SBA)將來自母體血液的固定于復(fù)合碳水化合物聚合物所包覆的基質(zhì)上的血細(xì)胞的顯微鏡(×200)照片。
圖4是示出圖3所示的被固定細(xì)胞的顯微鏡(×1000)照片。
圖5是示出可用于本發(fā)明血細(xì)胞分離體系的基質(zhì)實例的橫截面圖。
優(yōu)選實施方式的描述下文中，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
首先，用于本發(fā)明的體系和方法的血液樣品來自孕婦。作為血液收集工具，可以使用通常使用的血液收集用具，如注射器、真空血液收集試管或血袋。所收集的血液可以是包括來自胎盤或骨髓液的靜脈血、臍帶血、絨毛血在內(nèi)的任何類型的血液，但為了盡可能地限制對母體的侵入，最優(yōu)選外周靜脈血。對血液樣品的數(shù)量沒有特殊的限制，考慮到侵入母體帶來的問題，一般約1-10ml。為了防止得到的血液樣品凝結(jié)，優(yōu)選加入EDTA、肝磷脂、CPD/ACC等。為了得到有意義的結(jié)果，優(yōu)選使用在使用前24小時內(nèi)，更優(yōu)選6小時內(nèi)，取自孕婦的新鮮血液樣品。
本發(fā)明的血液細(xì)胞分離體系包括用于主要除去大部分的作為從上述血液樣品中除去的細(xì)胞部分的非成核紅細(xì)胞和母體白細(xì)胞的初級分離裝置。特別是，初級分離裝置優(yōu)選是使用具有比重(specificdensity)的液體的密度離心裝置或過濾分離裝置。
形成本發(fā)明血細(xì)胞分離體系的初級分離裝置的第一個實施方式是密度離心裝置，其中使用了用現(xiàn)有的密度調(diào)節(jié)劑如蔗糖、改性蔗糖、甘油或聚乙烯吡咯烷酮包衣的膠體二氧化硅，預(yù)先設(shè)定密度梯度流體的密度。實施例包括來自Pharmacia公司的Ficoll-Paque、Ficoll-Hypaque和Percoll，或來自Asuka-Sigma公司的Histopaque。過去通常用于從全血中分離血液成分的密度梯度流體比重設(shè)定為1.077(如Ficoll-Paque和Histopaque-1077)。在這種情況下，離心導(dǎo)致比重高的粒細(xì)胞和紅細(xì)胞在密度梯度流體下面，而單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞如白細(xì)胞上升到密度梯度流體之上。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用比重為1.077的密度梯度流體時，胎兒有核細(xì)胞如NRBC的一部分在離心后會擴(kuò)散入密度梯度流體之中，因此，正如常規(guī)方法那樣，如果只提取含單核細(xì)胞的一層，就會損失大量的稀少胎兒有核細(xì)胞。因而，在本發(fā)明的分離體系中，比重高于1.077的密度梯度流體優(yōu)選用作初級分離裝置，并且能用于防止胎兒有核細(xì)胞的損失。
如下述實施例所示，密度梯度流體的比重增加，將提高胎兒有核細(xì)胞的回收率，但將同時導(dǎo)致不希望有的白細(xì)胞的混入增加。然而，因為本發(fā)明有利用將在下面描述的碳水化合物-外源凝集素相互作用進(jìn)行的淘選裝置(panning device)和二次分離裝置，所以能分離和除去混入的白細(xì)胞，以回收更多的胎兒有核細(xì)胞。而且，本發(fā)明的密度離心裝置包括離心管、比重為1.077-1.105，優(yōu)選1.080-1.095和更優(yōu)選1.090-1.095g/cm2，置于離心管中的密度梯度流體，和離心分離器。將取自孕婦的血液樣品置于含密度梯度流體的離心管中，并且將其放置于離心分離器中，以500-2000rpm(50-800G)，離心20-40分鐘，其中得到作為處于密度梯度流體上層，含大量胎兒有核細(xì)胞的部分的初級分離樣品。
在某些情況下，本發(fā)明的初級分離裝置也可以具有進(jìn)一步除去混入的白細(xì)胞等的淘選裝置。這個淘選裝置包括，如，一個培養(yǎng)皿等如用牛胎盤血清(FCS)進(jìn)行表面處理過的聚苯乙烯培養(yǎng)皿，用于利用平皿的非特異粘附性，分離和除去如單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的白細(xì)胞成分。
特定的淘選過程可以是本領(lǐng)域常用的。例如，將樣品置于培養(yǎng)皿上，并在預(yù)定時間內(nèi)培養(yǎng)，然后沒有粘附在培養(yǎng)皿上的細(xì)胞作為懸浮液回收。
培養(yǎng)皿優(yōu)選為一次性塑料型培養(yǎng)皿，包括市售塑料培養(yǎng)皿產(chǎn)品如來自Nunc、Falcon、Iwaki Seiyaku或Sumitomo Bakelite的聚苯乙烯培養(yǎng)皿在內(nèi)的任何類型。將FCS加入這些培養(yǎng)皿中，然后于4℃下保持2小時，以用FCS中的蛋白質(zhì)對其表面進(jìn)行包覆。結(jié)果，疏水性的塑料表面變成親水性，可以使用任何條件，只要不使用超過37℃，F(xiàn)CS中的蛋白成分在37℃開始變化，或低于冷凍溫度。除此以外，用碳水化合物作為包覆試劑也是有效的，其中易于對塑料表面進(jìn)行包覆的PV-糖(Netech的產(chǎn)品，Seikagaku Kogyo銷售)適合使用。包覆是通過將PV-糖粉末溶于蒸餾水得到10-1000μg/ml溶液，優(yōu)選使用50-500μg/ml溶液獲得的。將該PV-糖溶液放入培養(yǎng)皿中，并在室溫下保持至少30分鐘，于是PV-糖被吸收，培養(yǎng)皿表面成為親水的。能形成PV-糖的碳水化合物實例包括，葡萄糖類如PV-G(葡萄糖)、PV-MA(麥芽糖)、PV-GA(葡萄糖酸)、PV-CA(纖維二糖)和PV-Lam(昆布二糖)；半乳糖類如PV-LA(乳糖)、PV-LACOOH(羧化乳糖)和PV-MeA(蜜二糖)；和PV-Man(甘露二糖)和PV-GlcNAc(N-乙?；鶜ざ?，但它們可以是包括天然多糖在內(nèi)的任何類型，只要它們是能對培養(yǎng)皿表面進(jìn)行有效包覆的糖類。優(yōu)選使用它們，因為它們易于包覆聚苯乙烯培養(yǎng)皿，并不會損傷或破壞許多胎兒細(xì)胞。尤其，那些形成復(fù)合糖聚合物材料的糖類是葡萄糖酸(PV-GA)、蜜二糖(PV-MeA)或甘露糖(PV-Man)，它們是特別有利的，這是由于它們達(dá)到高水平的白細(xì)胞吸收的能力和保持胎兒細(xì)胞損失降低的去除過程。作為包覆試劑，PV-糖也優(yōu)選有等同或優(yōu)于FCS的分離性能的，并且比FCS更易于以穩(wěn)定批量獲得和更容易貯存的合成聚合物。
離心后，將初級分離樣品放置于親水培養(yǎng)皿中，并靜置至少5分鐘，白細(xì)胞成分較大比例地粘附于培養(yǎng)皿表面，但為了達(dá)到白細(xì)胞粘附和除去的適當(dāng)比例，優(yōu)選保留15分鐘至2小時。在此期間，可以使用保持初級分離樣品中所得細(xì)胞不死亡的任何溫度，但優(yōu)選使用18-37℃，在此溫度下，白細(xì)胞粘附活躍。
淘選過程不限于使用塑料培養(yǎng)皿，和能用上述FCS或PV-糖包覆的玻璃培養(yǎng)皿等。
一般，離心后，可能會出現(xiàn)血液樣品被許多能結(jié)合二次分離中使用的外源凝集素的血小板污染的情況，這會不利地影響成紅細(xì)胞分析的精確度。然而，淘選處理能通過粘附有效除去在血液樣品制備期間產(chǎn)生污染的血小板。因此，淘選是有效地預(yù)先除去過量粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板的過程，并提供高度精確紅細(xì)胞分離。
由于這些淘選處理，即使是有非常小的比重和顆粒尺寸，但有極高粘附性的血小板也能自動從通過上述離心裝置得到的初級分離樣品中除去，以減少至檢測限以下，從而使樣品富含胎兒有核細(xì)胞，僅含少量非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞如殘存的淋巴細(xì)胞，而且這能制成本發(fā)明分離體系的初級分離樣品。
形成本發(fā)明血細(xì)胞分離體系的初級分離裝置的第二個實施方式是過濾分離裝置。該過濾分離裝置有預(yù)定孔直徑，通常用于血液成分分離的多孔濾器，血液樣品通過這種濾器，可變形的非成核紅細(xì)胞成分通常能通過并除去，然而作為胎兒有核細(xì)胞的，包括白細(xì)胞成分和成紅細(xì)胞的成分仍留在過濾材料內(nèi)部或上面。通過用洗滌劑流體等來回收濾器中殘留的成分，能得到含有胎兒有核細(xì)胞和白細(xì)胞的初級分離樣品。
這里所用的濾器沒有特殊的限制，只要能夠允許非成核紅細(xì)胞成分通過(平均尺寸7-8.5μm)，但用物理或化學(xué)捕獲以阻礙白細(xì)胞(平均尺寸7-30μm)和胎兒有核細(xì)胞(平均顆粒尺寸8-19μm)通過，因此，可以使用任何物質(zhì)，如通過形成凝集或形成濾器的纖維尺寸來捕獲的非織造織物，通過延伸聚合物來控制孔徑的多孔膜，珠或海綿材料，只要它們具有的孔徑尺寸在能捕獲最可能屬于被回收物質(zhì)的有核成紅細(xì)胞的，最小尺寸約8μm的正色有核成紅細(xì)胞的范圍內(nèi)，仍允許非成核紅細(xì)胞經(jīng)變形通過。濾器材料沒有特殊限制，可以是合成或天然的聚合物，如含氟聚合物、聚砜、聚酯、聚乙烯醇縮醛、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酰亞胺、聚氨酯、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚酮、聚硅氧烷、聚乳酸、纖維素、殼聚糖、纖維素、絲或大麻，或無機(jī)材料，包括羥磷灰石、玻璃、氧化鋁、氧化鈦或金屬如不銹鋼或鈦鋁，考慮到白細(xì)胞的保持能力，它們能保持某種水平的粘附力，以收集白細(xì)胞。從成本和生產(chǎn)考慮，優(yōu)選聚酰胺如尼龍、聚酯、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸、聚苯乙烯、聚碳酸酯、纖維素和羥磷灰石。濾器的孔徑應(yīng)為1.0-40μm，優(yōu)選2.0-20μm和更優(yōu)選3.0-10μm，而且如果濾器由纖維組成，纖維的直徑應(yīng)為1.0-30μm，優(yōu)選1.0-20μm，和更優(yōu)選1.5-10μm。
另外，上面提到的形成濾器的材料可以進(jìn)行表面改性，優(yōu)選使用不會阻止非成核紅細(xì)胞通過和改進(jìn)白細(xì)胞滯留的類型。在濾器中殘存的胎兒有核細(xì)胞和白細(xì)胞能通過清洗濾器回收。例如，因為未成熟有核成紅細(xì)胞比白細(xì)胞成分有很大的分離傾向，洗滌劑流體以與過濾血液樣品的相反方向經(jīng)過濾器，以選擇性回收目標(biāo)胎兒有核細(xì)胞。這里使用的洗滌劑流體，可以是任何生物學(xué)上的緩沖液或生物學(xué)上的鹽水溶液如輸液或培養(yǎng)基溶液，只要它能分離胎兒有核細(xì)胞。
因而，本發(fā)明分離體系中的過濾分離裝置，除了上述濾器和洗滌劑流體，還可包括流體輸送設(shè)備如注射器或泵，用于給濾器提供洗滌劑流體或提供為收集從濾器上沖洗下來的非成核紅細(xì)胞成分的流體儲庫。將用這種方法得到的含胎兒非成核細(xì)胞的樣品制成按照本發(fā)明的初級分離樣品。
然后，對通過濾器分離的初級分離樣品采取上述淘選過程，以進(jìn)一步減少白細(xì)胞的數(shù)量，而且這也可以用作初級分離樣品。
在本發(fā)明的血細(xì)胞分離體系中，二次分離裝置用于從以上述方式得到的初級分離材料中除去殘留的非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞，從而得到含濃縮胎兒有核細(xì)胞的二次分離樣品。在該二次分離裝置中，初級分離樣品在有表面固定了含復(fù)合糖聚合物的培養(yǎng)基中，和預(yù)定濃度的外源凝集素，在使細(xì)胞失活的條件下培養(yǎng)，從而進(jìn)行一種方法，該方法用于通過外源凝集素-碳水化合物相互作用與外源凝集素的選擇性結(jié)合，將初級分離樣品中所含的胎兒有核細(xì)胞濃縮和粘附于培養(yǎng)基上(此后參考碳水化合物-外源凝集素方法)。
WO00/58443中描述了碳水化合物-外源凝集素方法的細(xì)節(jié)。這里作為復(fù)合糖聚合物，使用那些在疏水聚合物主鏈上與碳水化合物鏈結(jié)合的聚合物如聚苯乙烯。特別優(yōu)選如WO00/58443中描述的PVLA、PVMA、PVMan、PVMeA、PVLAC00H、PVG、PVGlcNac和PVLam。其中，優(yōu)選那些有能被所用的外源凝集素識別的碳水化合物鏈結(jié)構(gòu)的聚合物。
在被復(fù)合糖聚合物進(jìn)行表面改性的基質(zhì)上，初級分離樣品和外源凝集素在使細(xì)胞失活的條件下培養(yǎng)，以形成胎兒有核細(xì)胞-外源凝集素混合物，它們通過碳水化合物-外源凝集素相互作用被濃縮和吸附于基質(zhì)上。
所用的外源凝集素優(yōu)選那些能識別由胎兒有核細(xì)胞表達(dá)的碳水化合物鏈，如包括識別半乳糖的外源凝集素如SBA、PNA、ECL、AlloA和VAA，識別葡萄糖的外源凝集素如Con A、LcH和PSA，和識別甘露糖的外源凝集素如LCA、GNA和CPA，但不限于此。這里，通過調(diào)節(jié)外源凝集素的加入量，胎兒有核細(xì)胞可以高比例粘附，以致于允許選擇性精確分離，其中來自母親的混入白細(xì)胞不粘附。尤其是，當(dāng)使用塑料基質(zhì)時，考慮到初級分離樣品中含有約2×106細(xì)胞，所加入的外源凝集素的量優(yōu)選8-35μg，優(yōu)選8-32μg，和更優(yōu)選10-30μg。另外，當(dāng)使用玻璃基質(zhì)時，考慮到初級分離樣品中含有約2×106細(xì)胞，所加入的外源凝集素的量優(yōu)選10-200μg，優(yōu)選20-100μg，和更優(yōu)選30-75μg。因而，當(dāng)所用的外源凝集素濃度的最佳范圍按照基質(zhì)材料和所用外源凝集素的類型有一些改變時，本領(lǐng)域技術(shù)人員不作過度實驗就可以選擇最佳濃度。
在使用300μg/ml的外源凝集素的情況下，當(dāng)取自母體血液樣品的血細(xì)胞固定于用復(fù)合糖聚合物(PV-LA)包覆的基質(zhì)上時，許多白細(xì)胞等(強染色細(xì)胞)被污染，如圖2的顯微照片所示，同時在使用8μg/ml的外源凝集素的情況下，如現(xiàn)存的白細(xì)胞和紅細(xì)胞的少數(shù)不必要的細(xì)胞選擇性粘附，如圖3和4的顯微鏡照片所示。
外源凝集素和細(xì)胞的培養(yǎng)是在細(xì)胞被滅活的條件下進(jìn)行的，這些條件如上述選擇?！凹?xì)胞被滅活的條件”指細(xì)胞膜的流動度和自我粘附度低的條件，典型的是溫度調(diào)節(jié)到至少0℃至37℃，優(yōu)選0-36℃，更優(yōu)選4-30℃和最優(yōu)選4-22℃。然而，這些條件并不限于上面描述的低溫調(diào)節(jié)，和如通過在37℃下添加延緩細(xì)胞呼吸的試劑如疊氮化鈉來達(dá)到。
另外，對培養(yǎng)時間沒有特別限定，只要足夠細(xì)胞和外源凝集素形成細(xì)胞-外源凝集素復(fù)合物，但通常為0-120分鐘，優(yōu)選0-90分鐘，更優(yōu)選0-60分鐘。這里“0分鐘”指混合初級分離樣品和外源凝集素之后，立即開始隨后的步驟。
在二次分離中，培養(yǎng)(胎兒有核細(xì)胞可能包括一些非成核紅細(xì)胞)后粘附于基質(zhì)上的細(xì)胞通過除去以細(xì)胞懸浮液形式存在的未粘附細(xì)胞(白細(xì)胞等)來分離。
因而，按照本發(fā)明的二次分離裝置包括一個經(jīng)復(fù)合糖聚合物進(jìn)行表面改性的基質(zhì)、外源凝集素，和用于滅活細(xì)胞的工具，如冷卻裝置或含疊氮化鈉的試劑，產(chǎn)生高密度的基質(zhì)上粘附著胎兒有核細(xì)胞，并有效除去不希望有的成分如白細(xì)胞的二次分離樣品。
在按照本發(fā)明的血液細(xì)胞分離體系中，二次分離樣品，用解釋過的制備裝置制備后，最后準(zhǔn)備用于使用FISH方法等進(jìn)行基因/染色體檢驗。而且，通過使用二次分離裝置中的基質(zhì)作為FISH方法等的載玻片，單一基質(zhì)可用于從二次分離至檢驗的全過程，這是很實用的。因而，如果這里使用的載玻片用于顯微鏡檢查，可以使用有足夠透明度的燒瓶、培養(yǎng)皿、試管或薄膜，從而不會阻礙顯微鏡視野，但當(dāng)考慮到與顯微鏡的普遍兼容性，特別優(yōu)選使用載玻片室，其上蓋在二次分離過程中被外源凝集素粘附，二次分離后除去上蓋，干燥和固定被粘附的胎兒有核細(xì)胞，隨后容易地直接用于FISH方法中。
載玻片室的載玻片部分可以由任何能用上述碳水化合物-外源凝集素方法中使用復(fù)合糖聚合物包覆的，可以通過顯微鏡觀察的材料制成，包括有機(jī)材料如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯和乙烯基共聚物等，以及無機(jī)材料如含二氧化硅的玻璃。此外，當(dāng)用于FISH方法時，必須使用高溫下有機(jī)溶劑處理，使粘附于載玻片的細(xì)胞裸核，因此優(yōu)選使用不易于變形的玻璃材料。
圖5顯示在本發(fā)明血細(xì)胞分離體系的二次分離和隨后的過程中使用的基質(zhì)的例子。圖5描述的基質(zhì)包括構(gòu)成室底部的載玻片部分(1)和垂直于載玻片部分(1)的側(cè)壁(2)。復(fù)合糖聚合物層(10)在室底部的上表面上形成。用帽(3)封閉室開口。
本發(fā)明的血細(xì)胞分離體系包括用于在預(yù)定的條件下離心二次分離樣品以得到制劑的制備裝置。
通常，當(dāng)制備用于染色體檢查等的在玻璃載玻片上的細(xì)胞制劑時，吸取細(xì)胞懸浮液流體，滴加到載玻片上并風(fēng)干，或?qū)⒑?xì)胞的樣品鋪展在載玻片上，然后干燥形成涂片(如，見JP-A H7-27682)。然而，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)為了將取自二次分離樣品的細(xì)胞以適于檢查的形式粘附于載玻片上，必須使用特定的離心條件。
因而，本發(fā)明的制備裝置包括用于離心二次分離樣品的離心設(shè)備，它能在預(yù)定的條件下離心仍保留在培養(yǎng)基中的二次分離樣品。條件不同于所用的基質(zhì)(載玻片)。
如果基質(zhì)是塑料載玻片室，除去細(xì)胞懸浮液后除去上蓋，但為了防止載玻片表面干燥，優(yōu)選用生物學(xué)上的緩沖液或含富含于接近生物學(xué)濃度的蛋白質(zhì)的白蛋白的FCS清洗后離心。此外，用蒸餾水稀釋優(yōu)選1/2，更優(yōu)選3/5的FCS用于在培養(yǎng)皿面上廣泛涂布粘附細(xì)胞，因而使其易于通過顯微鏡觀察，而且特別優(yōu)選使用。稀釋范圍可以任意，只要不使細(xì)胞分解。
至于離心力，為將細(xì)胞粘附于培養(yǎng)皿時，優(yōu)選100-1500G，為有效縮短離心時間，更優(yōu)選400-700G。當(dāng)離心時間按照離心力改變時，離心時間通常為約1-15分鐘。如果直接風(fēng)干不離心，細(xì)胞經(jīng)常萎縮，以致于排除了獲得良好細(xì)胞形態(tài)的可能性。
另一方面，如果使用玻璃載玻片室，在上述離心過程中優(yōu)選使用低離心力一次離心和高離心力二次離心的兩步步驟。此外，優(yōu)選用優(yōu)選1/2，或更優(yōu)選3/5稀釋度的FCS代替含未粘附細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，并在除去上蓋之前進(jìn)行第一次離心。第一次離心優(yōu)選10-300G，優(yōu)選10-150G，和更優(yōu)選10-50G的輕離心，其中可能進(jìn)一步抑制粘附細(xì)胞分離或當(dāng)受到壓力時變形。接著，除去上蓋并進(jìn)行二次離心，因而得到適合檢驗的被固定細(xì)胞形態(tài)。二次離心的離心力應(yīng)為25-300G，優(yōu)選30-200G，更優(yōu)選35-130G，其中未變形的固定細(xì)胞形態(tài)的再生能力進(jìn)一步增加。
如上所述，通過按照不同于載玻片基質(zhì)材料的特定條件進(jìn)行的離心過程，可能得到由載玻片基質(zhì)組成的檢驗制劑，胎兒有核細(xì)胞以有利的狀態(tài)固定在載玻片基質(zhì)之上。
本發(fā)明的血細(xì)胞分離體系進(jìn)一步包括使用檢驗制劑的檢測裝置，其中胎兒有核細(xì)胞被濃縮和固定于如上描述的基質(zhì)(載玻片)上，以進(jìn)行粘附胎兒有核細(xì)胞的染色體和/或基因檢驗。
檢測裝置可以是，如用FISH方法對核內(nèi)的染色體進(jìn)行直接熒光標(biāo)記，和顯微鏡觀察的裝置，按照選擇的探針的類型，這能夠檢測染色體異常，如非整倍性、等臂染色體、易位、缺失和染色體片斷互易?；蛘?，該裝置可以使用PCR方法，其中用顯微操縱術(shù)或在顯微鏡下激光解剖，剝離回收粘附細(xì)胞，并擴(kuò)增基因。擴(kuò)增的基因可以進(jìn)一步在基因芯片上篩選，本發(fā)明的體系適合各種類型的染色體/基因診斷。
如上所述，通過使用本發(fā)明的血細(xì)胞分離體系，在母體血液中的稀少胎兒有核細(xì)胞，很難用比重或用抗體進(jìn)行表面標(biāo)記識別來分離和濃縮，但可以通過在特定條件下密度離心或過濾分離進(jìn)行的初級分離，和特定條件下用外源凝集素進(jìn)行的碳水化合物鏈識別的二次分離的結(jié)合，以高度精確和高密度分離和濃縮。特別是，按照本發(fā)明，這些稀少胎兒有核細(xì)胞直接在基質(zhì)上被粘附，分離和濃縮，隨后用粘附于基質(zhì)，保持細(xì)胞正常形態(tài)，適于進(jìn)行基因/染色體檢查的細(xì)胞，來檢驗細(xì)胞核染色體和基因。因而，本發(fā)明提供一種通過使用上述體系，在各種染色體和/或基因診斷中，能夠直接用于檢驗胎兒有核細(xì)胞檢驗制劑的生產(chǎn)方法，和由上述方法制成的檢驗制劑。
利用本發(fā)明體系的方法的特征在于包括從含稀少細(xì)胞的樣品中除去大量不希望有的細(xì)胞成分的初級分離步驟，和目的在于從初級分離樣品中進(jìn)一步除去不希望有的細(xì)胞成分的分離和濃縮稀少細(xì)胞的二次分離步驟，和例如，即使通過上述碳水化合物-外源凝集素方法進(jìn)行的二次分離被使用特異于稀少細(xì)胞的抗體進(jìn)行的分離方法所替代，這種分離方法和體系也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。而且，除了能夠通過分離和濃縮后的檢驗來診斷染色體和基因狀態(tài)和異常，混入母體血液的胎兒有核細(xì)胞(胎兒有核成紅細(xì)胞)，被定向的稀少細(xì)胞可以是疾病癥狀減弱后仍存在的白血病細(xì)胞，或臍帶血中的未成熟細(xì)胞，并且當(dāng)在本發(fā)明提供的粗細(xì)胞分離體系或精確分離體系中使用時，可以是能夠在載玻片基質(zhì)上通過外源凝集素或抗體選擇作用而被濃縮的任何類型的細(xì)胞。本發(fā)明中使用的術(shù)語“胎兒有核細(xì)胞”應(yīng)解釋為包含所有的用這種方式靶擊的稀少細(xì)胞。
實施例下面，將詳細(xì)描述本發(fā)明的血細(xì)胞分離體系，重點在于使用碳水化合物-外源凝集素方法的初級分離、二次分離條件的設(shè)定，和保持細(xì)胞良好形態(tài)的制備方法。
實施例1用密度離心法進(jìn)行初級分離得到Histopaque(Sigma)，用作密度離心試劑，其中加入泛影酸鈉(sodium diatrizoate)并且制備比重調(diào)節(jié)至1.077-1.105的6種密度梯度流體類型。7cc靜脈血取自懷孕10-20周的孕婦，然后在每種密度梯度流體中離心30分鐘(20℃，1500rpm)。收集到的環(huán)繞于密度梯度流體和血漿成分(上層)分界線的細(xì)胞被回收，然后用生物學(xué)上的緩沖液離心漂洗，得到除去大多數(shù)非成核紅細(xì)胞和血小板的粗分離樣品。
在各種密度條件下初步提純的樣品用碳水化合物-外源凝集素方法進(jìn)行二次分離。作為基質(zhì)，使用塑料載玻片室(2孔，Nalgenunc產(chǎn)品)。包覆于基質(zhì)上的復(fù)合糖聚合物為PVMeA，約2×106個細(xì)胞中加入12μg外源凝集素(SBA)，然后在18℃下培養(yǎng)30分鐘。當(dāng)粘附于載玻片室的細(xì)胞被干燥并用帕彭海姆氏染料染色時，潷去懸浮液形式的未粘附的細(xì)胞。被染色的細(xì)胞用顯微鏡觀察，對分離和粘附于載玻片上的正色的有核成紅細(xì)胞(胎兒有核細(xì)胞)進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果顯示于表1。
表1

如表1所示，增加密度梯度流體(Histopaque)的密度顯著增加碳水化合物-外源凝集素精確分離后檢測到的有核成紅細(xì)胞的數(shù)量。這清楚表明通過使用比重為1.077的密度梯度流體進(jìn)行密度分離的常規(guī)血細(xì)胞分離破壞比重高的紅細(xì)胞。另一方面，當(dāng)比重超過1.095，正色成紅細(xì)胞的數(shù)目增加時，也觀察到混入白細(xì)胞數(shù)量大量增加，這是成紅細(xì)胞的顯微檢測被碳水化合物-外源凝集素方法導(dǎo)致的精確分離效率降低所抑制的結(jié)果。
實施例2通過淘選的附加分離塑料載玻片室(4孔，Nalgenunc產(chǎn)品)用FCS或0.01wt％復(fù)合糖聚合物(PV-糖)(Netech產(chǎn)品)的水溶液處理。作為復(fù)合糖聚合物，使用含葡萄糖、麥芽糖、葡萄糖酸、N-乙酰基葡萄糖胺、甘露糖、乳糖或蜜二糖結(jié)構(gòu)的那些。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用Histopaque(d，1.095)對回收的出生后的臍帶血進(jìn)行密度梯度離心，收集凝集在Histopaque和血漿分界線附近的細(xì)胞。樣品再次懸浮于加入10wt％FCS的RPMI1640中，接種于表面被FCS或復(fù)合糖聚合物包覆的上面所述孔上。37℃培養(yǎng)30分鐘之后，回收細(xì)胞懸浮液流體形式的未粘附細(xì)胞，粘附于孔上的細(xì)胞用帕彭海姆氏染劑染料以鑒定其類型。結(jié)果顯示于表2。表2顯示粘附于以各種類型的包覆材料所包覆的孔表面的紅細(xì)胞部分(包括成紅細(xì)胞)與白細(xì)胞部分之間的比例，和所有接種細(xì)胞的粘附率。
表2

如表2所示，清楚表明當(dāng)用血清蛋白(FCS)或復(fù)合糖聚合物包覆的塑料表面的孔進(jìn)行淘選時，幾乎所有被粘附的血液微粒中的細(xì)胞為白細(xì)胞。在用麥芽糖、葡萄糖酸、FCS和甘露糖處理過的孔中，紅細(xì)胞部分的粘附被抑制，而葡萄糖酸、葡萄糖胺和甘露糖優(yōu)于總體粘附率，這顯示了白細(xì)胞的可移動性。在這種情況下，成紅細(xì)胞不包括在粘附的白細(xì)胞部分中，除了在部分葡萄糖類材料上能觀察到1或2個粘附成紅細(xì)胞。
接著，選擇FCS作為用于除去適量的白細(xì)胞部分并對紅細(xì)胞沒有很大損傷的處理劑，而且研究了母體血液的處理效果。使用比重為1.095的密度梯度流體經(jīng)密度離心得到的初級分離樣品被分成兩部分，其一在上述條件下淘選，另一個未處理，然后在與實施例相同的條件下進(jìn)行碳水化合物-外源凝集素二次分離。
表3

表3中單個視野載玻片上紅細(xì)胞/白細(xì)胞的比例顯示二次分離中白細(xì)胞去除率，載玻片上檢測到的紅細(xì)胞數(shù)量顯示成紅細(xì)胞的回收效率。特別是，顯微鏡下粘附細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果顯示了無淘選的情況和進(jìn)行淘選的情況的比值(倍)。從表3的結(jié)果中，清楚顯示淘選改善了碳水化合物-外源凝集素方法中成紅細(xì)胞的選擇性分離和濃縮效率。這被認(rèn)為是由協(xié)同效應(yīng)所致，由于淘選除去多余的白細(xì)胞，因而能夠用外源凝集素通過與外源凝集素的有效相互作用來粘附細(xì)胞，以減少粘附失誤，成紅細(xì)胞計算錯誤的減少歸因于在顯微觀察期間不同于成紅細(xì)胞的有核細(xì)胞的數(shù)量的減少。
表3的結(jié)果顯示即使當(dāng)與表1中比重為1.095的情況相比，阻礙顯微觀察的白細(xì)胞的混入可以通過淘選被抑制，這可能比在比重為1.105(未淘選)的情況下檢測出更多的成紅細(xì)胞。另外在母體血液中，由于淘選，幾乎沒有成紅細(xì)胞損失。
實施例3經(jīng)過濾分離的初級分離代替實施例1中的密度離心方法，用包括平均孔徑8μm非織造聚酯織物的濾器進(jìn)行初級分離。母體血液樣品用含1wt％BSA的生物學(xué)上的緩沖液稀釋，然后采用自然滴加通過濾器。接著，只將緩沖液通過濾器以洗去濾器上殘存的紅細(xì)胞。隨后，用注射器泵使緩沖液反向通過，并回收沒有通過濾器的未粘附的細(xì)胞。沒有通過濾器但沒有強烈粘附于濾器上的細(xì)胞部分被提取作為初級分離樣品，將其用碳水化合物-外源凝集素方法進(jìn)行二次分離。表4顯示從上述濾器中得到的初級分離樣品的結(jié)果，與將FCS淘選回收的細(xì)胞部分用碳水化合物-外源凝集素方法進(jìn)行二次分離的結(jié)果的比值(倍)。
表4

按照表4，載玻片上單個視野紅細(xì)胞/白細(xì)胞比值(二次分離中白細(xì)胞的去除率)和載玻片上檢測到的成紅細(xì)胞的數(shù)量(二次分離中成紅細(xì)胞的回收率)有所提高，這清楚表明用碳水化合物-外源凝集素方法進(jìn)行的成紅細(xì)胞的選擇分離和濃縮效率能夠經(jīng)過濾步驟來改善。據(jù)認(rèn)為用濾器進(jìn)行的初級分離是由于有變形能力的非成核紅細(xì)胞能通過濾器和既不能通過濾器也不能用濾器捕獲的細(xì)胞能經(jīng)沖洗濾器來回收。因而證明了成紅細(xì)胞的損失進(jìn)一步通過使用初級分離方法而不是作為過濾方法的密度離心方法所抑制。紅細(xì)胞/白細(xì)胞選擇性有輕微改善，這是由于殘存在濾器中的非成核紅細(xì)胞經(jīng)沖洗而回收。
實施例4制備步驟中的離心適于FISH方法的玻璃載玻片室(Nalgenunc產(chǎn)品)用于進(jìn)行用碳水化合物-外源凝集素方法的二次分離。至于初級分離條件，使用如下條件實施(同實施例2)。
密度離心d，1.095FCS淘選對用碳水化合物-外源凝集素方法的二次分離，隨后棄去包含未粘附細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，用FCS代替載玻片室，除去上蓋和載玻片離心的情況進(jìn)行比較(實驗條件1和2)，和棄去含未粘附細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，用FCS代替載玻片室，立即進(jìn)行第一次離心，和除去上蓋后在載玻片上進(jìn)行的二次離心的情況(實驗條件3-11)進(jìn)行比較。
作為FCS，原液(1/1)在使用前用蒸餾水稀釋1/2，并在第二次離心后，載玻片在標(biāo)準(zhǔn)溫度下風(fēng)干。載玻片上細(xì)胞用帕彭海姆氏染料染色，比較它們各自的染色外觀。結(jié)果如表5所示。
表5


與常規(guī)涂片樣品不同，經(jīng)碳水化合物-外源凝集素方法進(jìn)行二次分離的載玻片上細(xì)胞需要有通過離心壓力粘附的細(xì)胞，但當(dāng)使用玻璃載玻片作為基質(zhì)時，第一次離心必須是在FCS溶液中低速離心。即使在除去上蓋后的二次離心中，相對低速條件會保持良好的染色外觀。另外，當(dāng)有高蛋白濃度的，添加了FCS或BSA的緩沖液作為有效替代流體時，在生物學(xué)條件下的稀釋FCS誘導(dǎo)粘附細(xì)胞溶脹，并保持較好的染色外觀。例如，在條件8、10和11中，細(xì)胞顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的適宜形態(tài)學(xué)和清楚結(jié)構(gòu)。尤其是，在條件11下，使用稀釋3/5的FCS，觀察到如貯藏期間的樣品或個體樣品幾乎沒有變異作用。當(dāng)使用塑料載玻片時，在上面給出的條件1中獲得非常好的染色外觀。
發(fā)明效果按照本發(fā)明的血液分離體系，作為包含于母體血液中的極其少量的胎兒有核細(xì)胞的成紅細(xì)胞被選擇性地分離、濃縮和粘附于基質(zhì)上。此外，通過適當(dāng)?shù)剡x擇所用的基質(zhì)，在單一基質(zhì)上進(jìn)行從二次分離步驟至制備步驟的過程，以得到適于染色體/基因診斷的檢驗制劑，和這種檢驗制劑能直接應(yīng)用于檢驗方法如FISH方法中。因而，對產(chǎn)前診斷有很高臨床價值的胎兒有核細(xì)胞檢驗樣品可以便利地，并且不侵入母體地低成本生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種血細(xì)胞分離體系，包括初級分離裝置，用于從取自孕婦的血液樣品中主要除去的非成核紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，以得到初級分離樣品；二次分離裝置，用于從用所述一次分離裝置得到的初級分離樣品中除去殘存的非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞，得到含濃縮的胎兒有核細(xì)胞的二次分離樣品，二次分離裝置涉及在滅活細(xì)胞，和預(yù)定外源凝集素濃度的條件下，在表面固定著復(fù)合糖聚合物的基質(zhì)上，培養(yǎng)所述初級分離樣品，選擇性地將初級分離樣品中含有的胎兒有核細(xì)胞與所述外源凝集素結(jié)合，借助于外源凝集素-碳水化合物的相互作用將它們濃縮和粘附于所述基質(zhì)上，形成二次分離樣品；和制備裝置，用于制備用所述二次分離裝置得到的二次分離樣品，制備裝置涉及在預(yù)定條件下，離心所述基質(zhì)，所述胎兒有核細(xì)胞被濃縮和粘附于所述基質(zhì)上，從而得到一種檢驗制劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述初級分離裝置是使用密度至少超過1.077mg/cm3的密度梯度流體的密度離心裝置。
3.按照權(quán)利要求2所述的血細(xì)胞分離體系，進(jìn)一步包括用于除去用所述密度離心裝置得到的含胎兒有核細(xì)胞的樣品中混入的白細(xì)胞的淘選裝置。
4.按照權(quán)利要求1所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述初級分離裝置是使用濾器分離非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞的裝置。
5.按照權(quán)利要求1所述的血細(xì)胞分離體系，其中在所述二次分離裝置中滅活細(xì)胞的條件是至少0℃和低于37℃的低溫條件，或中止細(xì)胞呼吸的條件。
6.按照權(quán)利要求1所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述制備裝置的離心條件是當(dāng)使用塑料基質(zhì)時，以100-1500G，離心1-15分鐘，和當(dāng)使用玻璃基質(zhì)時，第一次離心是以10-300G，離心1-10分鐘，接著第二次離心是以25-300G，離心5-15分鐘。
7.按照權(quán)利要求1所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述制備裝置中使用的基質(zhì)是用稀釋至1/2，優(yōu)選3/5的FCS代替包含于二次分離樣品中的懸浮液得到的。
8.按照權(quán)利要求1所述的血細(xì)胞分離體系，進(jìn)一步包括用于檢驗用所述制備裝置得到的檢驗制劑中所含胎兒有核細(xì)胞中的染色體和/或基因的檢查裝置。
9.按照權(quán)利要求8所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述檢查裝置包括用于對制劑中所含胎兒有核細(xì)胞的細(xì)胞核中的染色體進(jìn)行染色的染色工具。
10.按照權(quán)利要求9所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述染色工具中的細(xì)胞核染色是由于使用了FISH方法。
11.按照權(quán)利要求8所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述檢查裝置包括用光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡進(jìn)行染色體檢驗的裝置。
12.按照權(quán)利要求8所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述檢查裝置包括用于擴(kuò)增從制劑中所含胎兒有核細(xì)胞的染色體中提取出的基因的工具。
13.按照權(quán)利要求12所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述擴(kuò)增工具包括用于實施PCR方法的材料。
14.按照權(quán)利要求12所述的血細(xì)胞分離體系，其中所述檢測裝置包括用于篩選擴(kuò)增的基因的裝置。
15.生產(chǎn)用于產(chǎn)前胎兒染色體和/或基因診斷的檢驗制劑的方法，包括從取自孕婦的血液樣品中主要除去非成核紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，得到初級分離樣品的初級分離步驟；在滅活細(xì)胞，和預(yù)定外源凝集素的濃度的條件下，在表面固定著復(fù)合糖聚合物的基質(zhì)上，培養(yǎng)所述粗分離的樣品，選擇性地將初級分離樣品中所含的胎兒有核細(xì)胞和所述外源凝集素結(jié)合，以通過外源凝集素-碳水化合物相互作用將它們濃縮和粘附于所述基質(zhì)，以選擇性地除去所述初級分離樣品中殘存的白細(xì)胞，得到含所需濃縮形式的胎兒有核細(xì)胞的二次分離樣品的二次分離步驟；和在預(yù)定條件下對含有濃縮和粘附的所述胎兒有核細(xì)胞的二次分離樣品進(jìn)行離心的制備步驟。
16.按照權(quán)利要求15所述的方法，其中所述初級分離步驟是通過使用密度至少超過1.077mg/cm3的密度梯度流體的密度離心進(jìn)行的。
17.按照權(quán)利要求16所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述密度離心方法得到的含胎兒有核細(xì)胞的樣品的淘選步驟，以除去混入的白細(xì)胞。
18.按照權(quán)利要求15所述的方法，其中所述初級分離步驟是通過使用濾器分離非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行的。
19.按照權(quán)利要求15所述的方法，其中在所述精確分離步驟中滅活細(xì)胞的條件是至少0℃和低于37℃的低溫條件，或中止細(xì)胞呼吸的條件。
20.按照權(quán)利要求15所述的方法，其中所述制備步驟中的離心條件是使用塑料基質(zhì)時，以100-1500G，離心1-15分鐘，和使用玻璃基質(zhì)時，第一次離心是以10-300G，離心1-10分鐘，接著第二次離心是以25-300G，離心5-15分鐘。
21.按照權(quán)利要求15所述的方法，其中用于所述制備步驟中的是用稀釋至1/2，優(yōu)選3/5的FCS代替二次分離樣品中所含的懸浮液的基質(zhì)。
22.用按照權(quán)利要求15-21之一所述的方法生產(chǎn)的，用于產(chǎn)前胎兒染色體和/或基因診斷的檢驗制劑。
23.用于按照權(quán)利要求1-14之一所述的血細(xì)胞分離體系的基質(zhì)，含固定于其表面的復(fù)合糖聚合物。
24.血細(xì)胞分離方法，包括除去含稀少細(xì)胞的樣品中所包含的大部分不需要的細(xì)胞成分的初級分離步驟；和通過從初級分離樣品中進(jìn)一步除去不需要的細(xì)胞成分來分離和濃縮靶擊的稀少細(xì)胞的二次分離步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種血細(xì)胞分離體系，其用于對孕婦血液中混入的稀少胎兒有核細(xì)胞的精確分離和濃縮，便于得到能夠用于產(chǎn)前染色體/基因診斷的檢驗制劑。血細(xì)胞分離體系的特征在于包括(1)初級分離裝置，用于從取自孕婦的血液樣品中主要除去的非成核紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，得到的初級分離樣品，(2)二次分離裝置，用于利用碳水化合物－外源凝集素方法，從用初級分離裝置得到的初級分離樣品中除去殘存的非成核紅細(xì)胞和白細(xì)胞，以得到含濃縮的胎兒有核細(xì)胞的二次分離樣品，和(3)制備裝置，用于制備用二次分離裝置得到的二次分離樣品。
文檔編號G01N33/569GK1615437SQ0282743
公開日2005年5月11日 申請日期2002年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月11日
發(fā)明者由良洋文, 齋藤芳夫, 北川道弘 申請人:株式會社奈特克