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      用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒的制作方法

      文檔序號(hào):5870260閱讀:179來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒,特別是涉及一種在疾病或失調(diào)發(fā)生后的不同時(shí)間間隔內(nèi)用于檢測(cè)存在于生物樣本中的生物化學(xué)標(biāo)記物的組合物和方法。
      背景技術(shù)
      疾病診斷的延遲經(jīng)常導(dǎo)致對(duì)組織永久性損害更大的風(fēng)險(xiǎn)或者甚至增加死亡的風(fēng)險(xiǎn)。在很多疾病中,有標(biāo)記物物分子其表達(dá)隨著疾病的進(jìn)展而增高。標(biāo)記物分子為與疾病相關(guān)或由疾病產(chǎn)生的抗原,并且可以發(fā)生同步的濃度變化,隨著疾病的進(jìn)展而增高。因此,標(biāo)記物分子的增高可能與病原性的增高相關(guān)聯(lián),然后發(fā)生疾病狀況的惡化,舉例來(lái)說(shuō),病毒抗原如HIV,或者細(xì)菌抗原如沙門氏菌?;疾〉纳镞€可以對(duì)致病原和致病的條件反應(yīng),通過(guò)產(chǎn)生標(biāo)記物或增加標(biāo)記物的產(chǎn)量,該標(biāo)記物不是正常存在或僅在生物體內(nèi)以低水平存在,舉例來(lái)說(shuō),心臟病人表現(xiàn)出CK-MB,肌鈣蛋白-T或I的水平增高。
      有大量可用的生物化學(xué)標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)或排除由突發(fā)事件如急性心肌梗塞(AMI)或伴隨著ST-T變化的不穩(wěn)定性心絞痛導(dǎo)致的對(duì)心臟肌肉細(xì)胞造成的缺血性損失。然而,大多數(shù)這些標(biāo)記物既不是心臟特異性的而且在AMI后也不足以能夠被早期檢測(cè)到,因此不能用于早期檢測(cè)。
      檢測(cè)血清中的肌氨酸激酶MB的同功酶(EC2.7.3.2)是當(dāng)前體外檢測(cè)中最廣泛使用的,以確定心肌梗塞(心臟病發(fā)作)的診斷。然而,盡管這種檢測(cè)通常能夠提供令人滿意的結(jié)果,一些缺點(diǎn)會(huì)限制著它的應(yīng)用。其中的一個(gè)缺點(diǎn)就是在梗塞后僅有相對(duì)很短的一段時(shí)間使測(cè)試保持陽(yáng)性(24-48小時(shí))。在胸痛發(fā)作后超過(guò)48小時(shí)進(jìn)入醫(yī)院的病人,CK-MB對(duì)于確診心臟病發(fā)作通常沒(méi)有作用。除此之外,骨骼肌組織通常包含少量的CK-MB同工酶,因此患有骨骼肌組織損失(如汽車事故)的病人有時(shí)會(huì)產(chǎn)生假的陽(yáng)性結(jié)果使得心肌梗塞的診斷更為困難。
      為了開始正確的治療方案以使死亡率和發(fā)病率降至最低,對(duì)于診斷醫(yī)師來(lái)說(shuō)能夠盡可能快的鑒定標(biāo)記物是非常有利的。對(duì)于大多數(shù)檢測(cè)試驗(yàn),標(biāo)記物達(dá)到可檢測(cè)的濃度有一個(gè)遲滯時(shí)間。在心臟病發(fā)作的情況下,從胸疼發(fā)作到有可檢測(cè)水平的CK-MB,肌鈣蛋白-T或I有4-6小時(shí)的延遲。肌紅蛋白能夠更早的被檢測(cè)到,但通常的檢測(cè)具有很低的特異性。相應(yīng)的,需要一種試驗(yàn)?zāi)軌蚩焖俚臋z測(cè)到樣本中的微量水平的生物化學(xué)標(biāo)記物。同時(shí)還需要一種試驗(yàn)?zāi)軌虮O(jiān)測(cè)心臟病發(fā)作的進(jìn)展以及隨后的梗塞的發(fā)生。
      由此可見(jiàn),上述現(xiàn)有的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒在結(jié)構(gòu)、方法與使用上,顯然仍存在有不便與缺陷,而亟待加以進(jìn)一步改進(jìn)。為了解決用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒存在的問(wèn)題,相關(guān)廠商莫不費(fèi)盡心思來(lái)謀求解決之道,但長(zhǎng)久以來(lái)一直未見(jiàn)適用的設(shè)計(jì)被發(fā)展完成,而一般產(chǎn)品又沒(méi)有適切的結(jié)構(gòu)能夠解決上述問(wèn)題,此顯然是相關(guān)業(yè)者急欲解決的問(wèn)題。
      有鑒于上述現(xiàn)有的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒存在的缺陷,本發(fā)明人基于從事此類產(chǎn)品設(shè)計(jì)制造多年豐富的實(shí)務(wù)經(jīng)驗(yàn)及專業(yè)知識(shí),并配合學(xué)理的運(yùn)用,積極加以研究創(chuàng)新,以期創(chuàng)設(shè)一種新型結(jié)構(gòu)的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒,能夠改進(jìn)一般現(xiàn)有的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒,使其更具有實(shí)用性。經(jīng)過(guò)不斷的研究、設(shè)計(jì),并經(jīng)反復(fù)試作樣品及改進(jìn)后,終于創(chuàng)設(shè)出確具實(shí)用價(jià)值的本發(fā)明。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的主要目的在于,克服現(xiàn)有的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒存在的缺陷,而提供一種新的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒,所要解決的技術(shù)問(wèn)題是使本發(fā)明的免疫化學(xué)測(cè)定法被特別設(shè)計(jì)以檢測(cè)病人樣本中在不同的時(shí)間間隔所釋放的生物化學(xué)標(biāo)記物。
      本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其包括將人或動(dòng)物的樣本與包含至少兩種捕捉試劑的載體分子相接觸,每種具有對(duì)于不同抗原的結(jié)合特異性以形成反應(yīng)混合物。將至少一種檢測(cè)試劑加入到反應(yīng)混合物中;并且檢測(cè)樣本中的至少兩種抗原的濃度。
      本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的兩個(gè)抗原分別為心臟特異性早期發(fā)作和晚期發(fā)作抗原。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的早期發(fā)作抗原為糖原磷酸化酶BB(GPBB)和晚期發(fā)作抗原為心肌鈣蛋白-I。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的檢測(cè)試劑和捕捉試劑包括抗體或抗體片段。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的抗體包括單克隆,多克隆,人源化,人的,嵌合,重組,雙特異性,多特異性抗體或其組合。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的抗體片段包括Fab,F(xiàn)ab(2)’Fc,F(xiàn)v,單鏈抗體或其組合。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的樣本來(lái)自于人。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的樣本包括組織,血液,唾液,血漿樣本,淋巴液,腦脊髓液或血清。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的檢測(cè)是在體外進(jìn)行。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的方法進(jìn)一步包括檢測(cè)探針。
      前述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其中的檢測(cè)探針包括可檢測(cè)的酶,輔基,順磁性基團(tuán),熒光物質(zhì),發(fā)光物質(zhì),生物發(fā)光物質(zhì),放射活性物質(zhì),分散型染料,金顆?;蚱浣M合。
      本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還采用以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其包含一種包括至少兩種捕捉試劑的載體分子和進(jìn)一步包含至少一種檢測(cè)試劑,每種捕捉試劑特異性的結(jié)合到抗原的結(jié)合部位,檢測(cè)試劑通過(guò)與捕捉試劑使用的所不同的結(jié)合部位與抗原結(jié)合。
      本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。
      前述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其中的樣本包括病人的組織,血液,唾液,血漿,血清,淋巴液,或腦脊髓液。
      前述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其中的患者為人。
      前述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其中的生物化學(xué)標(biāo)記物為GPBB和肌鈣蛋白-I。
      前述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其中的檢測(cè)試劑進(jìn)一步包含檢測(cè)探針。
      前述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其中的檢測(cè)探針被偶聯(lián)到檢測(cè)試劑上。
      前述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其中的檢測(cè)探針不偶聯(lián)到檢測(cè)試劑上。
      本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還采用以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種用于檢測(cè)病人中的心肌梗塞的方法,包括a)將病人的樣本與載體分子相接觸,載體分子包括抗-GPBB的單克隆抗體,一種抗-心肌鈣蛋白-I的單克隆抗體,以及至少一種檢測(cè)試劑。b)檢測(cè)樣本中的GPBB和肌鈣蛋白-I的濃度,其中的檢測(cè)試劑既結(jié)合GPBB和肌鈣蛋白-I,其結(jié)合部位與捕捉試劑所使用的不同;以及c)在一個(gè)預(yù)定的時(shí)間用一個(gè)新的樣本重復(fù)a)和b)。
      本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。
      前述的用于檢測(cè)病人中的心肌梗塞的方法,其中的檢測(cè)試劑包含一種或多種檢測(cè)探針。
      本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。由以上技術(shù)方案可知,為了達(dá)到前述發(fā)明目的,本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容如下本發(fā)明提出一種用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒,本發(fā)明包含一種免疫化學(xué)試驗(yàn)用于在損失后的不同時(shí)間檢測(cè)標(biāo)記物和標(biāo)記物的水平。本發(fā)明進(jìn)一步包含一種免疫化學(xué)試驗(yàn)用于同步測(cè)定樣本中的至少兩種抗原,包括將樣本與包含至少兩種能夠特異性結(jié)合到至少一個(gè)抗原的結(jié)合部位的捕捉試劑相接觸。免疫化學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步包含檢測(cè)試劑其能夠結(jié)合到已結(jié)合有捕捉試劑的抗原上。檢測(cè)試劑還可以被偶聯(lián)到檢測(cè)探針上或者檢測(cè)試劑可以被分別加入到樣本中。作為選擇,載體分子還包含一種偶聯(lián)有檢測(cè)探針的檢測(cè)試劑以及檢測(cè)試劑能夠特異性的結(jié)合到抗原上。本發(fā)明的試驗(yàn)?zāi)軌虮挥脕?lái)檢測(cè)心臟特異性標(biāo)記物糖原磷酸化酶BB(GPBB)以及心臟肌鈣蛋白I。
      試驗(yàn)中的檢測(cè)試劑和捕捉試劑可以包括抗體或抗體片段,包括單克隆,多克隆,人源化,人的,嵌合的,重組的,雙特異性的,多特異性的抗體或其組合??贵w片段可以包括Fab,F(xiàn)ab(2)’Fc,F(xiàn)v,單鏈抗體或其組合。
      檢測(cè)探針可以為可檢測(cè)的酶,輔基,順磁性基團(tuán),熒光物質(zhì),發(fā)光物質(zhì),生物發(fā)光物質(zhì),放射活性物質(zhì),分散質(zhì)染料,金顆粒或其組合。
      本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例提供一種組合物其包含如上所述的載體分子,并且還包含一種載體或稀釋劑用于內(nèi)部消耗。本發(fā)明的組合物能夠被用于診斷或者治療。
      本發(fā)明的其它實(shí)施例提供用于檢測(cè)樣本中至少兩種目的生物化學(xué)標(biāo)記物。試劑盒包含一個(gè)載體分子,其包含至少兩種捕捉試劑,并進(jìn)一步包含至少一種,優(yōu)選的為至少兩種檢測(cè)試劑。每種捕捉抗原特異性的結(jié)合到抗體的結(jié)合部位,并且檢測(cè)試劑通過(guò)不同的結(jié)合部位結(jié)合到同一抗體上。檢測(cè)試劑進(jìn)一步包含檢測(cè)探針,其或者與檢測(cè)試劑相偶聯(lián),或者分別被提供到樣本中。
      綜上所述,本發(fā)明特殊結(jié)構(gòu)的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒,其具有上述諸多的優(yōu)點(diǎn)及實(shí)用價(jià)值,并在同類產(chǎn)品及方法中未見(jiàn)有類似的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及方法公開發(fā)表或使用而確屬創(chuàng)新,其不論在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、方法或功能上皆有較大的改進(jìn),在技術(shù)上有較大的進(jìn)步,并產(chǎn)生了好用及實(shí)用的效果,且較現(xiàn)有的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒具有增進(jìn)的多項(xiàng)功效,從而更加適于實(shí)用,而具有產(chǎn)業(yè)的廣泛利用價(jià)值,誠(chéng)為一新穎、進(jìn)步、實(shí)用的新設(shè)計(jì)。
      上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段,并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施,以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明如后。
      具體實(shí)施例方式
      為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下結(jié)合附圖
      及較佳實(shí)施例,對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的用于病人的樣本中生物化學(xué)標(biāo)記物的早期和同步檢測(cè)的免疫測(cè)定法和試劑盒其具體實(shí)施方式
      、結(jié)構(gòu)、步驟、特征及其功效,詳細(xì)說(shuō)明如后。
      本發(fā)明包含根據(jù)測(cè)試早期發(fā)作和晚期發(fā)作的生物化學(xué)標(biāo)記物,來(lái)檢測(cè)急性心肌梗塞(AMI)或?qū)π募〉钠渌鼡p傷發(fā)生的組合物和方法。本發(fā)明進(jìn)一步包含用于在AMI發(fā)生后的不同時(shí)間對(duì)樣本中的蛋白進(jìn)行檢測(cè)的免疫化學(xué)方法,為了能夠跟蹤AMI的進(jìn)展并測(cè)定是否還有繼發(fā)的梗塞。在AMI發(fā)作后不同時(shí)間檢測(cè)存在的標(biāo)記物使得能夠早期檢測(cè)缺血性心肌損傷從而可以進(jìn)行早期治療;通過(guò)利用只有心臟釋放而其它類型的肌肉不釋放的標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)診斷的特異性;監(jiān)測(cè)繼發(fā)的AMI;結(jié)果的直接評(píng)價(jià)和損傷嚴(yán)重程度的測(cè)量。
      本發(fā)明包含一種免疫化學(xué)試驗(yàn)用于測(cè)定樣本中的至少兩種抗原,包括將樣本與包含至少兩種捕捉試劑和至少一種檢測(cè)試劑的載體分子相接觸。每種捕捉試劑特異性的結(jié)合到抗原的結(jié)合部位。檢測(cè)試劑特異性的結(jié)合到同一抗原的不同于捕捉試劑所使用結(jié)合部位的其它結(jié)合部位。檢測(cè)試劑進(jìn)一步包含檢測(cè)探針,其或者與檢測(cè)試劑相偶聯(lián),或者分別被提供到樣本中。本發(fā)明的免疫化學(xué)試驗(yàn)?zāi)軌蛲綑z測(cè)病人樣本中不同時(shí)間釋放的兩種或更多不同的抗原的存在和數(shù)量。
      定義此處所述的“捕捉試劑”這一術(shù)語(yǔ)包括任何分子,舉例來(lái)說(shuō)抗體或抗體片段,多肽或多肽片段,酶,蛋白,多肽復(fù)合物,多肽和碳水化合物復(fù)合物,核酸分子,或其它化學(xué)實(shí)體,只要其具有能夠與至少一種的目的抗原相結(jié)合或相互作用的結(jié)合特異性。
      此處所述的“檢測(cè)試劑”這一術(shù)語(yǔ)包括任何分子,舉例來(lái)說(shuō)抗體或抗體片段,多肽或多肽片段,酶,蛋白,多肽復(fù)合物,多肽和碳水化合物復(fù)合物,核酸分子,或其它化學(xué)實(shí)體,只要其具有能夠與(a)至少一種的目的抗原和(b)至少一種檢測(cè)探針的結(jié)合部位相結(jié)合或相互作用的超過(guò)兩種的不同的結(jié)合特異性。相應(yīng)的,檢測(cè)試劑包括但不限于異種抗體,雙特異性,三特異性,四特異性和其它多特異性分子,其結(jié)合一種目的抗原和一種檢測(cè)探針。檢測(cè)探針還可以結(jié)合到載體分子上。
      此處所述的“檢測(cè)試劑”這一術(shù)語(yǔ)是指或與檢測(cè)試劑相偶聯(lián)或與包含檢測(cè)試劑的樣本相偶聯(lián)以便復(fù)合分子的鑒定的試劑。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試劑”包括能夠與檢測(cè)試劑相互作用的并形成檢測(cè)試劑和探針復(fù)合物的探針。在一個(gè)實(shí)施例中,檢測(cè)探針被標(biāo)記上1個(gè)或更多,2個(gè)或更多,3-6,6-12,12-20,或者超過(guò)20個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記物。可檢測(cè)的標(biāo)記物的例子包括,但不限于,不同的酶,非朊基基團(tuán),熒光物質(zhì),發(fā)光物質(zhì),生物發(fā)光物質(zhì)和放射活性物質(zhì)。
      此處所述的“特異性結(jié)合”這一術(shù)語(yǔ)包括抗體能夠以比對(duì)其它釋放的抗原更高的親合力與一種抗原相結(jié)合。典型的,抗體以至少約1×107M的親合力結(jié)合,其與預(yù)定的抗原結(jié)合是以超過(guò)至少兩倍的與不同于預(yù)定抗原的非特異性抗原(如BSA,酪蛋白)或相關(guān)抗原結(jié)合的親合力。例如,一個(gè)具有對(duì)肌鈣蛋白I的特異性結(jié)合親合力的抗體可以比與肌鈣蛋白T更高的親合力與肌鈣蛋白I結(jié)合。
      “識(shí)別一種抗原的一種抗體”這一短語(yǔ)與“對(duì)一種抗原特異的一種抗體”在次可以與“一種特異性結(jié)合抗原的抗體”這一術(shù)語(yǔ)可互換的使用。
      此處所述的“載體分子”這一術(shù)語(yǔ)包括一個(gè)固相表面。固相表面不限于任何特殊形式。固相表面能夠選自一系列本領(lǐng)域已知的,包括塑料管,小珠,微滴度板,乳膠顆粒,磁性顆粒,纖維素珠,瓊脂糖珠,紙,量油計(jì)以及類似物。更為優(yōu)選的,本發(fā)明的載體分子包括量油計(jì)。
      此處所使用的“抗原”這一術(shù)語(yǔ)包括任何分子或者生物化學(xué)標(biāo)記物,其用于本發(fā)明的免疫試驗(yàn)中能夠被檢測(cè)到。抗原包括,例如作為疾病或紊亂的結(jié)果的在體內(nèi)的任何新表達(dá)或表現(xiàn)出增加或降低表達(dá)的任何分子。此名詞包括,如存在于體液中的小分子例如藥物,毒素,自身抗體,自身抗原,蛋白,碳水化合物,核酸或者這些的組合。
      此處所使用的“樣本”這一術(shù)語(yǔ)包括包含抗原的混合物。優(yōu)選的,樣本得自于活的來(lái)源,如動(dòng)物,舉例來(lái)說(shuō)為哺乳動(dòng)物以及更為優(yōu)選的為人。樣本優(yōu)選的為體液,即血液,血漿,唾液,尿液等,并且也包括組織樣本。
      此處所使用的“抗體或抗體片段”這一術(shù)語(yǔ)指能夠特異結(jié)合到抗原上的抗體或片段。能夠特異性的結(jié)合到一個(gè)分子上的抗體或片段能夠被證實(shí),通過(guò)免疫試驗(yàn)或其它對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)。
      “重組抗體”這一術(shù)語(yǔ)包括能夠通過(guò)重組方法被準(zhǔn)備,表達(dá),創(chuàng)造或分離的所有抗體,如噬菌體展示抗體,從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)中分離的抗體,用轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體,從重組組合抗體文庫(kù)中分離的抗體,或通過(guò)其它方法被準(zhǔn)備,表達(dá),創(chuàng)造或分離的抗體,涉及到將免疫球蛋白的基因序列與其它DNA序列相拼接。
      “單克隆抗體”這一術(shù)語(yǔ)包括表現(xiàn)為對(duì)特定抗原表位具有單一結(jié)合特異性和親合力的抗體。優(yōu)選的,這些抗體為哺乳動(dòng)物抗體,包括鼠,人和人源化抗體。
      “人單克隆抗體”這一術(shù)語(yǔ)指展示出單一結(jié)合特異性的抗體,其具有來(lái)源于人系的免疫球蛋白序列的可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中,人單克隆抗體產(chǎn)自于雜交瘤,包括得自于轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的B細(xì)胞,如轉(zhuǎn)基因小鼠,其具有的基因組包括一個(gè)人的重鏈轉(zhuǎn)基因和一個(gè)輕鏈轉(zhuǎn)基因融合到永生細(xì)胞中。
      “人源化抗體”這一術(shù)語(yǔ)指來(lái)自于非人種的抗體分子具有一個(gè)或更多個(gè)來(lái)自于人的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和來(lái)自于人免疫球蛋白分子的框架區(qū)(參見(jiàn)U.S.Patent No.5,585,089,以整個(gè)該專利作為參考文獻(xiàn)包含于此文中)。這些嵌合抗體和人源化單克隆抗體能夠被本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生,例如用U.S.Patent Nos.4,816,567和5,225,539中所描述的方法,這些都以其整個(gè)專利作為參考文獻(xiàn)包含于此文中。
      “嵌合抗體”,根據(jù)本發(fā)明,用重組或化學(xué)的方法制造。例如,重組嵌合抗體通過(guò)將具有正確的抗原特異性的單克隆抗體的基因和正確的生物活性的第二人抗體基因相拼接而成。更為特殊的,嵌合抗體可以通過(guò)將編碼抗體可變區(qū)的基因和第二抗體分子的穩(wěn)定區(qū)基因相拼接而成。這種方法被用來(lái)產(chǎn)生人源化單克隆抗體,其互補(bǔ)決定區(qū)為小鼠的,而框架區(qū)為人的(參照,U.S.Patent Nos.4,816,567;4,816,397;5,693,762;5,585,089;5,565,332和5,821,337,每個(gè)都以其整個(gè)專利作為參考文獻(xiàn)包含于此文中)。
      此處所使用的“肌鈣蛋白”這一術(shù)語(yǔ)指異構(gòu)型肌鈣蛋白復(fù)合體或獨(dú)特的肌鈣蛋白異構(gòu)型。有九種肌鈣蛋白型包括1)心臟三重復(fù)合體;2)心臟肌鈣蛋白I(氧化)/T的二重復(fù)合體;3)心臟肌鈣蛋白I(還原)/T的二重復(fù)合體;4)心臟肌鈣蛋白I(氧化)/C的二重復(fù)合體;5)心臟肌鈣蛋白I(還原)/C的二重復(fù)合體;6)心臟肌鈣蛋白T/C的二重復(fù)合體;7)未結(jié)合的心臟肌鈣蛋白I(氧化);8)未結(jié)合的心臟肌鈣蛋白I(還原);以及9)未結(jié)合的心臟肌鈣蛋白T。如此處所使用的,未結(jié)合的肌鈣蛋白為沒(méi)有存在于復(fù)合體中的肌鈣蛋白。肌鈣蛋白復(fù)合體可以為雙重的或者三重的。
      大量的生物化學(xué)標(biāo)記物可以用于檢測(cè)或排除心肌梗塞(AMI)或伴隨著ST-T變化的不穩(wěn)定性心絞痛導(dǎo)致的對(duì)心臟肌肉細(xì)胞造成的缺血性損失。然而,大多數(shù)這些標(biāo)記物既不是心臟特異性的而且在AMI后也不足以能夠被早期檢測(cè)到,因此不能用于早期檢測(cè)。能夠被用于本發(fā)明的試驗(yàn)中的標(biāo)記物的例子包括,但不限于,肌鈣蛋白,包括異構(gòu)型肌鈣蛋白復(fù)合體或獨(dú)特的肌鈣蛋白異構(gòu)型(即,肌鈣蛋白-I,肌鈣蛋白-C,肌鈣蛋白-T),原肌球蛋白,肌動(dòng)蛋白,GPBB,藥物(即,巴比妥酸鹽,三環(huán)抗抑郁藥以及毛地黃),腫瘤抗原(即,與乳腺癌,前列腺癌,腦癌,肝癌,腎癌,結(jié)腸癌,胰腺癌,胃癌或肺癌相關(guān)聯(lián)的抗原),病毒抗原(即,與HIV,流感病毒或其它病毒相關(guān)聯(lián)或由其產(chǎn)生的抗原),細(xì)菌抗原,激素(即,甲狀腺刺激激素(TSH),人生長(zhǎng)激素,黃體激素,睪丸激素,人絨毛膜促性腺激素(hCG)),血漿蛋白(即纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP),C-反應(yīng)蛋白(CRP),癌胚抗原蛋白,甲胎蛋白(AFP),癌胚抗原(CEA)),噬菌斑抗原,半抗原(即,血管緊縮素I,后葉加壓素,生長(zhǎng)激素抑制素,心房心鈉激素,內(nèi)皮絲氨酸,促黃體激素釋放激素(LH-RH),肛褶蛙肽或其它多肽),類固醇(即氫化可的松),以及細(xì)胞因子如白介素-1(IL-1),干擾素-alpha,干擾素-beta,干擾素-gamma,白介素-2(IL-2),白介素-4(IL-4),白介素-6(IL-6),白介素-7(IL-7),白介素-12(IL-12),白介素-15(IL-15),B7,CD28,或其它Ig超家族的成員。
      本發(fā)明還進(jìn)一步包含使用糖原磷酸化酶的BB異構(gòu)酶作為心臟肌肉損傷的早期啟動(dòng)抗原。不希望被任何特定的理論所限制,糖原磷酸化酶異構(gòu)酶BB(GPBB)被報(bào)道為缺血性心臟紊亂的早期檢測(cè)的關(guān)鍵性酶(Mair J.,ClinChim Acta 6;27279-86(1998))。相當(dāng)多量的GPBB僅在人心臟和腦中發(fā)現(xiàn)。在胸疼后2小時(shí)內(nèi)可在血中檢測(cè)到GPBB。在具有不穩(wěn)定的絞痛和可逆的ST-T變化的病人被抑郁接受后在靜止心電圖中GPBB水平也可早期升高,這可以用于風(fēng)險(xiǎn)分層。GPBB為心臟特異性的,其在出現(xiàn)心肌的缺血性損傷后16-24小時(shí)后在血中消失。該酶短暫的壽命時(shí)間使其能夠用作梗塞重建的指示,例如在經(jīng)過(guò)手術(shù)后,可簡(jiǎn)單的通過(guò)檢測(cè)GPBB升高的水平。
      本發(fā)明還包括免疫化學(xué)試驗(yàn)和診斷的方法,包括將GPBB作為早期啟動(dòng)標(biāo)記物以及一種晚期啟動(dòng)標(biāo)記物,對(duì)于在心肌中的缺血性誘導(dǎo)的損傷具有特異性。這種晚期啟動(dòng)標(biāo)記物可優(yōu)選的為心臟肌鈣蛋白-I。血清中的心臟肌鈣蛋白為心臟肌肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白,因此,其釋放是作為心臟肌肉開始?jí)乃赖臉?biāo)志。晚期標(biāo)記物,心臟肌鈣蛋白-I在胸疼開始4小時(shí)后出現(xiàn)在循環(huán)中;其在循環(huán)中的壽命時(shí)間顯著的長(zhǎng)于GPBB。因此心臟肌鈣蛋白-I的測(cè)量允許在缺血性損傷發(fā)生多小時(shí)或多天后能夠進(jìn)行診斷。
      本發(fā)明包含具有增強(qiáng)的特異性的檢測(cè)試驗(yàn)的組合物和方法。這通過(guò)使用能夠結(jié)合到至少兩種抗原的載體分子來(lái)實(shí)現(xiàn),該抗原在疾病發(fā)作后不同時(shí)間間隔中存在于病人樣本中。
      特別的,載體分子包含至少兩種捕捉試劑,而且還包含至少一種檢測(cè)試劑。每種捕捉試劑結(jié)合到一種不同的抗原或者標(biāo)記物上。檢測(cè)試劑可以為載體的部分或者被分別加入。檢測(cè)試劑以不同的結(jié)合部位與已和捕捉試劑相結(jié)合的抗原進(jìn)行結(jié)合。檢測(cè)試劑進(jìn)一步包含檢測(cè)探針,其或者偶聯(lián)到檢測(cè)試劑上或者被分別加入到樣本中。
      本發(fā)明進(jìn)一步包含用于檢測(cè)樣本中存在的至少兩種抗原的方法,包括將得自于人或動(dòng)物的樣本與包含至少兩種捕捉試劑的載體分子相結(jié)合,每種載體分子具有對(duì)不同抗原的結(jié)合特異性以形成反應(yīng)混合物。檢測(cè)試劑然后被加入到反應(yīng)混合物中。然后測(cè)定樣本中至少兩種抗原的濃度。
      本發(fā)明的免疫化學(xué)試驗(yàn)優(yōu)選的被用于檢測(cè)心肌梗塞的發(fā)作。根據(jù)此點(diǎn),本發(fā)明的特色為一種用于檢測(cè)心肌梗塞的方法,包含將人樣本與包含兩種捕捉試劑的載體分子相結(jié)合形成反應(yīng)混合物的步驟。一種捕捉試劑結(jié)合到GPBB的結(jié)合部位,另一種捕捉試劑結(jié)合到肌鈣蛋白-I的結(jié)合部位。檢測(cè)試劑被加入到反應(yīng)混合物中,其中檢測(cè)試劑包含一種反應(yīng)物,優(yōu)選的為特異于GPBB和肌鈣蛋白-I的單克隆抗體,其結(jié)合部位與固定到固相上的捕捉抗體的結(jié)合部位不同。檢測(cè)試劑還結(jié)合到檢測(cè)探針上。本發(fā)明的免疫試驗(yàn)?zāi)軌蛲綑z測(cè)肌鈣蛋白-I和GPBB。一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例包括具有載體試劑和檢測(cè)試劑的載體分子。
      根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例,在不同時(shí)間從病人中取得樣本,例如在懷疑有心肌梗塞后,以在試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)以跟蹤疾病的進(jìn)展或檢測(cè)隨后的心肌梗塞。
      本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例包括一種用于檢測(cè)病人的心肌梗塞的方法,包括將得自于病人的樣本與載體分子相接觸,載體分子包含抗-GPBB的單克隆抗體,抗心臟肌鈣蛋白-I的單克隆抗體,和至少一種檢測(cè)試劑,以及檢測(cè)樣本中的GPBB和肌鈣蛋白-I的濃度,其中檢測(cè)試劑能夠與GPBB和肌鈣蛋白-I在未被捕捉試劑所使用的結(jié)合部位進(jìn)行結(jié)合。試驗(yàn)?zāi)軌蛴眯碌臉颖驹诔^(guò)延長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行重復(fù)以監(jiān)測(cè)損傷的進(jìn)展和監(jiān)測(cè)任何隨后的梗塞。
      根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例,捕捉試劑,檢測(cè)試劑,或兩者為抗體或抗體片段。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,抗體為單一特異性,雙特異性,或多特異性的抗體。用于制備雙-和多特異性分子的方法被描述,如,U.S.Patent Nos.5,260,203;5,455,030;4,881,175;5,132,405;5,091,513;5,476,786以及5,013,653,每個(gè)都以其整個(gè)專利作為參考文獻(xiàn)包含于此文中。
      在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,雙特異性或多特異性的抗體具有一個(gè)第一可變區(qū),其具有對(duì)一個(gè)能夠被檢測(cè)的分子的特異性,以及一個(gè)第二可變區(qū),其具有對(duì)第二個(gè)分子的特異性??贵w被連接到一個(gè)聚合體上,其中聚合體被連接到至少1,或更多,優(yōu)選的為2或更多檢測(cè)分子上。
      特別的,檢測(cè)抗體包含兩個(gè)特異于兩種目的抗原的結(jié)合區(qū)以便檢測(cè),另一個(gè)結(jié)合區(qū)特異于一個(gè)被單獨(dú)加入的探針。
      根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例,抗體部位被聯(lián)結(jié)形成抗體結(jié)合物。抗體結(jié)合物包括異種抗體,其指兩種或更多種抗體或抗體片段相聯(lián)結(jié),其中的抗體結(jié)合物具有至少兩種不同特異性的結(jié)合區(qū)。這些不同的特異性可以是有利的,包括例如對(duì)于檢測(cè)探針的結(jié)合部位的結(jié)合特異性,以及對(duì)于兩種目的抗原即GPBB和心臟肌鈣蛋白抗原的結(jié)合特異性。
      根據(jù)發(fā)明的其它實(shí)施例,抗體或抗體片段可以重組方式制得。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,抗體或抗體片段為單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中,抗體或抗體片段通過(guò)個(gè)體單克隆抗體的分離產(chǎn)生,將每個(gè)特異性抗體的兩硫鍵連接斷裂,隨后在體外將抗體重鏈和輕鏈多肽重組(參見(jiàn),例如Arathoon et al.,WO98/50431)。在另一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明在免疫化學(xué)試驗(yàn)中使用一個(gè)或更多個(gè)嵌合抗體。
      本發(fā)明的抗體,包括免疫球蛋白分子的免疫活性片段,即F(ab)和F(ab’)2片段,其能夠通過(guò)用酶如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理抗體來(lái)產(chǎn)生。產(chǎn)生和表達(dá)抗體的免疫活性片段的方法的例子能夠在U.S.Patent No.5,648,237中發(fā)現(xiàn),其以其整個(gè)專利作為參考文獻(xiàn)包含于此文中。
      免疫球蛋白分子由基因編碼,其包括kappa,lambda,alpha,gamma,delta,epsilon和mu穩(wěn)定區(qū),以及任何數(shù)字的免疫球蛋白的可變區(qū)。輕鏈被證實(shí)為或者為kappa或?yàn)閘ambda。輕鏈包括可變輕鏈(VL)和穩(wěn)定輕鏈(CL)區(qū)。重鏈被證實(shí)為gamma,mu,alpha,delta或?yàn)閑psilon,其被分別定義為免疫球蛋白亞類IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。重鏈包括可變重鏈(VH),穩(wěn)定重鏈1(CH1),絞鏈,穩(wěn)定重鏈2(CH2),以及穩(wěn)定重鏈3(CH3)區(qū)。人IgG重鏈被進(jìn)一步根據(jù)序列變化分為亞類,亞類被命名為IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。
      抗體能夠被進(jìn)一步分解成兩對(duì)輕鏈和重鏈區(qū)。配對(duì)的VL和VH區(qū)每個(gè)都包含一系列七個(gè)亞區(qū)結(jié)構(gòu)區(qū)1(FR1),互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1),結(jié)構(gòu)區(qū)2(FR2),互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2),結(jié)構(gòu)區(qū)3(FR3),互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3),結(jié)構(gòu)區(qū)4(FR4),其組成抗體-抗原識(shí)別區(qū)。
      在另一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明用單鏈抗體(scFv),其通常包含一個(gè)融合多肽,其由一個(gè)輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)通過(guò)一個(gè)多肽連接物融合而成。
      能夠通過(guò)將抗體與可檢測(cè)的標(biāo)記物相偶聯(lián)來(lái)促進(jìn)檢測(cè)??蓹z測(cè)的標(biāo)記物的例子包括但不限于,不同的酶,輔基,熒光物質(zhì),發(fā)光物質(zhì),生物發(fā)光物質(zhì),放射活性物質(zhì),分散質(zhì)染料,金顆粒。適當(dāng)?shù)目蓹z測(cè)標(biāo)記物的例子,如上所述,包括適當(dāng)?shù)拿?,即辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酶,beta-半乳糖酶或乙酰膽堿酯酶;適當(dāng)?shù)妮o基的例子包括,但不限于鏈霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白和抗生物素蛋白/生物素蛋白;適當(dāng)?shù)臒晒馕镔|(zhì)的例子包括但不限于傘形酮,熒光素,熒光素異硫氰酸酯,若丹明,二氯三嗪銨熒光素,丹磺酰氯或藻紅蛋白;發(fā)光物質(zhì)的例子包括,但不限于發(fā)光氨,生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括但不限于熒光素酶,熒光素和水母發(fā)光蛋白;以及適合的放射活性物質(zhì)包括但不限于125I,35S,14C,3H,Tc99M或Mg52??贵w能夠被偶聯(lián)到同一或不同的檢測(cè)標(biāo)記物上。
      商業(yè)上可得到的抗體能夠被買到并用來(lái)產(chǎn)生檢測(cè)試劑,例如從ATCC.RTM。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例中,抗體由商業(yè)上可得到的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中,雜交瘤分泌人抗體。
      所有已經(jīng)存在的用于檢測(cè)血清酶的ELISA,放射免疫試驗(yàn)和量油計(jì)試驗(yàn),以及任何用抗體的試驗(yàn)?zāi)軌蚋鶕?jù)本發(fā)明提供的增強(qiáng)敏感度的方法進(jìn)行修改。此外,通過(guò)使用本發(fā)明的方法在體外增強(qiáng)靶信號(hào)的應(yīng)用也是可行的。
      本發(fā)明的捕捉試劑能夠被直接固定到固相表面,或被通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在免疫試驗(yàn)孵育中(原位)被固定。捕捉試劑可優(yōu)選的被固定在載體分子的表面。用于在載體分子表面固定捕捉試劑的方法為但不限于任何特定方法并包括例如,被動(dòng)吸收,共價(jià)連接,物理捕獲等。例如,固相表面能夠包被和/或檢測(cè)試劑能夠用抗生物素蛋白或鏈霉菌抗生物素蛋白來(lái)標(biāo)記。
      可替換的,捕捉試劑或檢測(cè)試劑能夠在液相中被加入到包含目的抗原的生物液中,盡管如上所示,捕捉試劑和檢測(cè)試劑可以優(yōu)選的被固定到載體分子上。
      根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,抗體具有對(duì)于一個(gè)或多個(gè)此處所列舉的蛋白的特異性結(jié)合親合力。例如,抗體只對(duì)于肌鈣蛋白-I而不是肌鈣蛋白-T具有特異性結(jié)合親合力。一種抗體具有兩種或更多個(gè)蛋白的特異性結(jié)合親合力,因?yàn)?,例?a)抗體與兩個(gè)蛋白上保守的分立的抗原表位結(jié)合,或(b)抗體結(jié)合到兩個(gè)蛋白的分開和連接的表位。在例子(a)中,抗體可以分別的結(jié)合到蛋白上,然而在例子(b)中,抗體能夠結(jié)合到蛋白上,當(dāng)該蛋白與另一蛋白組成復(fù)合體時(shí)。
      由心臟釋放的肌鈣蛋白的形式,無(wú)論是游離的或者為雙重或三重復(fù)合體,可以表明心臟的特定狀況。此處所描述的試驗(yàn)提供對(duì)標(biāo)記物釋放模式的分析,其允許醫(yī)師診斷病人的病情,例如,不穩(wěn)定的絞痛與心肌梗塞相比,或者缺點(diǎn)梗塞發(fā)生的時(shí)間。
      根據(jù)發(fā)明的其它實(shí)施例,載體分子包含特異于肌鈣蛋白-I或肌鈣蛋白-T的抗體,以及特異于GPBB并進(jìn)一步結(jié)合到一種或更多種檢測(cè)探針的第二抗體。肌鈣蛋白-I為位于肌肉收縮器官的細(xì)纖維絲肌鈣蛋白復(fù)合體的三個(gè)亞單位之一。這種肌鈣蛋白復(fù)合體在控制肌肉收縮的過(guò)程中扮演中樞性作用,因此這三種亞單位被稱為調(diào)控蛋白。其它兩種亞單位(命名為T和C)也和肌鈣蛋白-I一起被固定在心臟和肌肉組織的肌原纖維細(xì)絲上。肌鈣蛋白-I被心臟中,慢骨骼肌和快骨骼肌組織中的不同基因所編碼。人的這三種形式的肌鈣蛋白之間約有60%的氨基酸序列是同源的。心臟形式的不同區(qū)域使其能夠產(chǎn)生與另外兩種骨骼肌形式不交叉反應(yīng)的抗體,因此使心臟特異性檢測(cè)成為可能。
      Cummins等在American Heart Journal 1131333-1344(1987)中描述了用于檢測(cè)人血清中心肌鈣蛋白-I的放射免疫試驗(yàn)的發(fā)展。這種試驗(yàn)利用了多克隆抗體的與肌鈣蛋白-I的骨骼肌形式顯著交叉反應(yīng)活性,其限制了它在確診心肌梗塞中的價(jià)值。此外,檢測(cè)不足夠敏感以檢測(cè)血清中低水平的肌鈣蛋白-I。
      Bodar等在Clinical Chemistry 382203-2214(1992)中描述了用于檢測(cè)血清中的肌鈣蛋白-I的兩個(gè)單克隆抗體的“三明治”試驗(yàn)。這種試驗(yàn)表明由于鼠單克隆抗體的使用增進(jìn)了心臟特異性。試驗(yàn)的不嚴(yán)密性對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是不可接受的高(11-21%的變異系數(shù))。
      根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了用于檢測(cè)至少樣本中至少兩種目標(biāo)生物化學(xué)標(biāo)記物。試劑盒包含一種包括了至少兩種捕捉試劑的載體分子,以及至少一種檢測(cè)試劑,每種捕捉試劑特異的結(jié)合到抗原的結(jié)合部位,檢測(cè)試劑通過(guò)不同結(jié)合部位結(jié)合到同一抗原上。檢測(cè)試劑進(jìn)一步包括一種檢測(cè)探針,其或與檢測(cè)試劑相偶聯(lián)或被單獨(dú)提供到樣本中。
      根據(jù)本發(fā)明的其它方面,一種診斷或治療的組合物被公開,其能夠在體內(nèi)或體外結(jié)合至少兩種生物化學(xué)標(biāo)記物。特別的,組合物包含一種載體分子,其具有至少對(duì)至少兩個(gè)抗原有結(jié)合特異性的兩種捕捉試劑,進(jìn)一步包含一種檢測(cè)試劑,其具有對(duì)同一抗原的結(jié)合特異性,并進(jìn)一步包含一種檢測(cè)探針。在一個(gè)實(shí)施例中,檢測(cè)試劑為針對(duì)肌鈣蛋白-I和GPBB所產(chǎn)生的雙特異性抗體。在其它實(shí)施例中,檢測(cè)試劑包含兩種分別針對(duì)肌鈣蛋白和GPBB所產(chǎn)生的兩個(gè)單克隆抗體。
      此處以及附錄的權(quán)利要求所使用的,單數(shù)形式“a”,“an”以及“the”包括其復(fù)數(shù)所指除非上下文清楚的表明并非如此。因此,例如,提到一種“復(fù)合物”是指一個(gè)或多個(gè)此種復(fù)合物并包括對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的等價(jià)物等。
      除非另作定義,此處所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。盡管和此處所描述的相似或等同的任何方法,儀器和物質(zhì)都能夠用于本發(fā)明的應(yīng)用或檢測(cè),此處所描述的為優(yōu)選的方法,儀器和物質(zhì)。
      此專利所提及的所有出版物和專利都作為參考文獻(xiàn)包含于此用來(lái)描述和公開,例如,專利中所描述的構(gòu)建物和方法,其能夠被用來(lái)與本專利所描述的相聯(lián)系。以上所討論的出版物和全部文本完全被提供因其公開早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日。此處沒(méi)有構(gòu)建發(fā)明人依靠前面發(fā)明來(lái)使本專利申請(qǐng)被提前授權(quán)的內(nèi)容作為申請(qǐng)。
      本發(fā)明不受此處所描述的特定劑型,過(guò)程步驟和物質(zhì)所限制很容易被理解,因?yàn)檫@些劑型,過(guò)程步驟和物質(zhì)都可以發(fā)生某種程度的變化。也能夠被理解即此處所使用的術(shù)語(yǔ)只是用來(lái)描述特定的實(shí)施例并不意味著限制,因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求和其等價(jià)物所限制。本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn),專利和發(fā)表的專利申請(qǐng)作為參考文獻(xiàn)被清楚的包含于此。
      實(shí)施例實(shí)施例1.用于缺血性心臟診斷的免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)是基于使用固相載體分子,包含兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的實(shí)驗(yàn),其使用兩種不同的單克隆抗體(mAb),一個(gè)針對(duì)早期發(fā)作標(biāo)記物GPBB,另一個(gè)針對(duì)晚期發(fā)作標(biāo)記物肌鈣蛋白-I。這兩種單克隆抗體在固相的不同位點(diǎn)被吸收。吸收的抗體作為“捕捉抗體”,其特異的結(jié)合到存在于病人血液中的標(biāo)記物上。一個(gè)抗早期發(fā)作和晚期發(fā)作標(biāo)記物上的不同抗原表位的抗體被用酶或熒光染料或分散染料或金顆粒染色。這種抗體被作為對(duì)結(jié)合到固相的位點(diǎn)1和2的抗原的“檢測(cè)抗體”。針對(duì)早期發(fā)作以及晚期發(fā)作標(biāo)記物的捕捉抗體結(jié)合到標(biāo)記物的不同抗原表位上因此產(chǎn)生了2位點(diǎn)結(jié)合檢測(cè)。數(shù)據(jù)表明急性心肌梗塞(AMI)的早期階段,即胸疼/胸骨后發(fā)作2-4小時(shí)后在固相的位點(diǎn)1上為可測(cè)量的。AMI的峰(胸疼后4-16)在1位點(diǎn)和2位點(diǎn)可以被測(cè)量,AMI的晚期階段僅在2位點(diǎn)可以被測(cè)量。
      實(shí)施例2.肌鈣蛋白-I的純化為生成鼠抗-肌鈣蛋白-I抗體,心臟肌鈣蛋白-I首先按照Syska等,F(xiàn)EBS Letters 40253-257(1974)如下的方法進(jìn)行分離。約有500mg的肌鈣蛋白-I被偶聯(lián)到ACTIGEL-ALD膠上(Sterogene Corporation,Arcadia,Calif.),通過(guò)用10mM磷酸鉀,1M氯化鉀,pH6.5的緩沖液(偶聯(lián)緩沖液)來(lái)清洗50毫升的凝膠。肌鈣蛋白-C然后被加入到凝膠中,硼氫化氰鈉被加入最終濃度為0.1M。產(chǎn)生的懸浮液在室溫下被攪拌4小時(shí),并被到入小柱中以收集凝膠。凝膠然后用225ml的偶聯(lián)緩沖液洗。凝膠從小柱中移出并加入到150毫升10mM磷酸鉀,1M氯化鉀,pH6.5,包含0.1M氨基乙醇的溶液中。懸浮液在4℃攪拌過(guò)夜以封閉任何未反應(yīng)的偶聯(lián)基團(tuán)。然后凝膠被放入到小柱中并用150毫升的偶聯(lián)緩沖液清洗,最終形成100毫升的磷酸鈉,pH7.2,包含0.15M氯化鈉和0.05%疊氮化鈉的溶液。
      人的心臟被整理并在4℃被切成1厘米的條。所產(chǎn)生的組織在室溫下在750毫升的75mM,pH8.0的包含8M尿素,15mM巰基乙醇和1mM的氯化鈣Tris緩沖液均質(zhì)化。
      產(chǎn)生的組織勻漿在7000×g離心30分鐘,所產(chǎn)生的上清液通過(guò)粗棉布過(guò)濾并除去顆粒。上述制備的肌鈣蛋白-C偶聯(lián)凝膠被放入小柱中并用250ml的抽提緩沖液在室溫清洗。產(chǎn)生的上清液在室溫?cái)嚢?0分鐘然后在7000×g離心20分鐘。上清液被丟棄,沉淀凝膠被用抽提緩沖液轉(zhuǎn)入到小柱中。小柱在室溫下用700毫升的抽提緩沖液清洗,純化的肌鈣蛋白-I然后被用75mM Tris緩沖液,pH8.0,包含8M尿素,15mM巰基乙醇和10mM乙二胺四乙酸(洗脫緩沖液)從小柱中洗脫。含有顯著數(shù)量肌鈣蛋白-I的片段被收集并被加入75mM Tris緩沖液,pH8.0,包含15mM巰基乙醇和10mM乙二胺四乙酸。產(chǎn)生的溶液在氮壓下被離心。
      實(shí)施例3.鼠抗肌鈣蛋白-I抗體的制備按照前面的實(shí)施例2的步驟所得到的純化肌鈣蛋白-I,與等體積的弗氏佐劑混合。產(chǎn)生的混合物被勻質(zhì)化以產(chǎn)生液體/油乳狀液,其構(gòu)成了起始的免疫原。鼠通過(guò)注射包含的250ug的心臟肌鈣蛋白-I免疫原進(jìn)行初始免疫。然后鼠被每月注射250ug-500ug的純化的心臟肌鈣蛋白-I作為免疫原,然后他們?cè)诿總€(gè)月注射后的約7-10天后被取血以提供鼠抗-肌鈣蛋白-I血清。
      實(shí)施例4.心臟特異性肌鈣蛋白-I抗體的分離和純化在實(shí)施例3中制備的抗血清被收集其中56ml被用56ml的包含0.15M氯化鈉的5mM pH7.2的咪唑緩沖液稀釋。苯甲基磺?;?PMSF),亮肽素,抑肽酶和抑胃肽A被加入最終濃度分別為15ug/ml,0.5ug/ml,和0.75ug/ml以抑制抗血清中的蛋白酶。在實(shí)施例2中合成的肽凝膠被加入到稀釋的抗血清中并在室溫下攪拌1小時(shí)。產(chǎn)生的混合物被轉(zhuǎn)入到小柱中并在室溫下用55ml的包含0.15M氯化鈉和0.05%的疊氮化鈉的5mM pH7.2的咪唑緩沖液清洗。純化的心臟特異性抗體被從55ml的第一洗脫液從凝膠中洗脫,隨后用55ml的第二緩沖液(包含3M硫氰酸鈉和0.05%的疊氮化鈉5mM pH7.0的咪唑緩沖液)。包含在這些洗脫物中的純化抗體被透析,最終稀釋濃度為109在包含0.15M氯化鈉和0.05%的疊氮化鈉的10mM pH7.2的磷酸鈉緩沖液。產(chǎn)生的透析物然后被在7000×g離心15分鐘以除去未溶解物質(zhì)。產(chǎn)生的包含純化的心臟特異性肌鈣蛋白-I抗體的上清液的蛋白濃度被用分光光度測(cè)定。
      實(shí)施例5.肌鈣蛋白-I-堿性磷酸酶復(fù)合物的制備通過(guò)實(shí)施例3方法制備的肌鈣蛋白-I被通過(guò)下述步驟化學(xué)連接到堿性磷酸酶上。肌鈣蛋白-I用25ul的SATA處理(N-琥珀酸-S-硫代乙酰乙酸)。在反應(yīng)溶液在室溫下攪拌30分鐘,溶液在2升的包含2mM EDTA的pH7.5的50mM磷酸鈉中于4℃透析過(guò)夜。SATA修飾的肌鈣蛋白-I被通過(guò)加入羥胺使其終濃度為50mM去乙?;⑷芤涸谑覝叵卤3?小時(shí)。修飾的肌鈣蛋白-I在2升的包含2mM EDTA的pH7.2的30mM三乙醇胺中透析過(guò)夜。從小牛的腸中得到6mg的堿性磷酸酶(AP)(Biozyme Corporation,San Diego,Calif)在1.55ml的體積中,被放置到玻璃檢測(cè)管。新鮮的硫代-SMCC(硫代琥珀酸4-N-malemidomethyl-環(huán)己胺-1-羧化酯)溶液被制備,在去離子水中濃度為5mg/ml。全部的87ul的SMCC溶液被加入到AP中并在室溫下攪拌1個(gè)小時(shí)。
      修飾的AP溶液然后被在2升的包含5mM氯化鎂和1mM氯化鋅的pH7.2的30mM三羥乙基胺中于4℃透析過(guò)夜。巰基乙胺和碘乙酰胺被加入到溶液中最終濃度為10mM并在室溫下攪拌20分鐘。產(chǎn)生的AP連接到肌鈣蛋白-I的復(fù)合物被通過(guò)SEPHACRYL S-300的柱(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,N.J.)中以從未反應(yīng)產(chǎn)物中純化AP肌鈣蛋白-I連接物。
      實(shí)施例6.肌鈣蛋白-I免疫實(shí)驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合根據(jù)實(shí)施例4制備的純化肌鈣蛋白-I抗體被稀釋到在100mM包含0.05%疊氮化鈉pH4.0的檸檬酸鈉溶液中為10ug/ml??贵w在室溫下在100ul聚苯乙烯微滴度板中包被過(guò)夜。微滴度板用10mM包含1M氯化鈉的pH7.2的Tris緩沖液清洗三次并用包含10mM pH7.2,10%葡萄糖酸,1%牛血清白蛋白和0.05%PROCLINTM300,5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-1(CAS 26172-55-4),2-甲基-4-異噻唑啉-3-1(CAS 2682-20-4),烷基羧酸酯,修飾的異二醇的溶液封閉。超量的液體被從微滴度板孔中吸出并且板在室溫下干燥??贵w包被的平板被儲(chǔ)藏于4℃直到使用。如實(shí)施例2中所制備的純化的心臟肌鈣蛋白-I在無(wú)肌鈣蛋白-I的正常人血清中稀釋到最終濃度為5,25和50ng/ml以提供免疫測(cè)定。肌鈣蛋白-I標(biāo)記的堿性磷酸酶在50mM pH7.4三羥乙基胺,1mM氯化鎂,0.1mM氯化鋅和0.05%疊氮化鈉的溶液中被稀釋到5ug/ml濃度。
      血清樣本或肌鈣蛋白-I標(biāo)準(zhǔn)被一式兩份的加入到前述由抗體包被的微滴度板孔中。然后肌鈣蛋白-I標(biāo)記的AP(80ul)被加入到板中并在室溫下孵育2小時(shí)。微滴度板用去離子水清洗五次并且0.83mg/ml旁磷酸硝基磷酸在包含5mM氯化鎂,0.1mM氯化鋅,0.02%TWEEN 20,和0.05%PROCLIN 300的25mM pH9.80二羥乙基胺的底物溶液(100ul)被加入到所有的孔中。底物溶液被在室溫下孵育30分鐘并且通過(guò)加入100ul的2N氫氧化鈉來(lái)中止反應(yīng)。在微滴度板中溶液的吸收用適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)儀在405nm讀數(shù)。
      實(shí)施例7.生物素化的肌鈣蛋白抗體和抗生物素蛋白-HS磁性膠乳的制備生物素-琥珀酸酯(6-((6-((生物素化)氨基)己酰)氨基))己酸,琥珀酸酯,在40mM二甲基甲酰胺被緩慢加入,通過(guò)將抗體溶液以2mg/ml混合到50mM硼酸鉀,150mM氯化鈉,pH8.2溶液(BBS)中以實(shí)現(xiàn)最終摩爾比率為20/1生物素/抗體。溶液在室溫下孵育2小時(shí),然后溶液在4℃中被透析至少12小時(shí)。
      1毫升的Estapor Paramagnetic乳膠顆粒在水中以至少10%的固體被加入到9ml的0.55mg/ml抗生物素蛋白-HS(Scripps Laboratories,SanDiego,Calif.)在50mM Tris氯化氫,150mM氯化鈉,pH7.5、乳膠溶液在45℃中孵育2小時(shí)。乳膠被清洗三次,每次用10ml的BBS,并重新懸浮于10ml的BBS中。
      實(shí)施例8.人心肌鈣蛋白-I和肌鈣蛋白-T的免疫測(cè)定法下列免疫測(cè)定法被用來(lái)檢測(cè)肌鈣蛋白-I和肌鈣蛋白-T,存在于人的血清,血漿,或者在包含純化蛋白的溶液。
      包含肌鈣蛋白-I或肌鈣蛋白-T的樣本被稀釋到1-10ng/ml肌鈣蛋白-I或肌鈣蛋白-T在包含10mM 3-(N-嗎啉)丙烷磺酸,650mM氯化鈉,1mM氯化鎂,0.1mM氯化鋅,1mg/ml聚乙烯乙醇(10,000mw),10mg/ml牛血清白蛋白,1mg/ml疊氮化鈉,pH7.0的檢測(cè)緩沖液中。微滴度板中25微升的稀釋樣本中被加入50微升的包含2.5微克/毫升的抗肌鈣蛋白-I或抗肌鈣蛋白-T復(fù)合物和2.5微克/毫升生物素化抗肌鈣蛋白-I或抗肌鈣蛋白-T多克隆抗體的檢測(cè)緩沖液以形成反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物在室溫下孵育30分鐘,25微升的抗生物素蛋白-HS包被的磁性乳膠(0.5%乳膠在檢測(cè)緩沖液中)被加入到微滴度板的孔中,隨后在室溫下孵育5分鐘。
      磁性乳膠被離心并在BBS-Tween(20mM硼酸,150mM氯化鈉,0.1mg/ml疊氮化鈉,0.02%聚氧乙烯-20-山梨聚糖單月桂酸(Tween-20),pH8.2)中清洗兩次以及在TBS(40mM Tris,150mM氯化鈉,pH7.5)中清洗一次。沉淀物被根據(jù)生產(chǎn)者的用法說(shuō)明被重新懸浮于ELISA擴(kuò)增試劑中(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)。在擴(kuò)增完成后,磁性乳膠被離心并且80微升的著色的上清液被轉(zhuǎn)入到新的微滴度板。用微滴度板計(jì)數(shù)儀測(cè)量在490nm的吸收。
      根據(jù)上述材料,本發(fā)明的許多修飾和改變都是可以的。因此,可以理解在發(fā)明的附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)都被保護(hù),除非另作特別的說(shuō)明。
      以上所述,僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制,雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上,然而并非用以限定本發(fā)明,任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi),當(dāng)可利用上述揭示的方法及技術(shù)內(nèi)容作出些許的更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例,但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容,依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾,均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
      權(quán)利要求
      1.一種測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其包括a)將人或動(dòng)物的樣本與包含至少兩種捕捉試劑的載體分子相接觸,每種具有對(duì)于不同抗原的結(jié)合特異性以形成反應(yīng)混合物。b)將至少一種檢測(cè)試劑加入到反應(yīng)混合物中;并且檢測(cè)樣本中的至少兩種抗原的濃度。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的兩個(gè)抗原分別為心臟特異性早期發(fā)作和晚期發(fā)作抗原。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的早期發(fā)作抗原為糖原磷酸化酶BB(GPBB)和晚期發(fā)作抗原為心肌鈣蛋白-I。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的檢測(cè)試劑和捕捉試劑包括抗體或抗體片段。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的抗體包括單克隆,多克隆,人源化人的,嵌合,重組,雙特異性,多特異性抗體或其組合。
      6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的抗體片段包括Fab,F(xiàn)ab(2)’Fc,F(xiàn)v,單鏈抗體或其組合。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的樣本來(lái)自于人。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的樣本包括組織,血液,唾液,血漿樣本,淋巴液,腦脊髓液或血清。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的檢測(cè)是在體外進(jìn)行。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的方法進(jìn)一步包括檢測(cè)探針。
      11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的測(cè)定樣本中至少兩種抗原存在的方法,其特征在于其中的檢測(cè)探針包括可檢測(cè)的酶,輔基,順磁性基團(tuán),熒光物質(zhì),發(fā)光物質(zhì),生物發(fā)光物質(zhì),放射活性物質(zhì),分散型染料,金顆?;蚱浣M合。
      12.一種用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其包含一種包括至少兩種捕捉試劑的載體分子和進(jìn)一步包含至少一種檢測(cè)試劑,每種捕捉試劑特異性的結(jié)合到抗原的結(jié)合部位,檢測(cè)試劑通過(guò)與捕捉試劑使用的所不同的結(jié)合部位與抗原結(jié)合。
      13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其中的樣本包括病人的組織,血液,唾液,血漿,血清,淋巴液,或腦脊髓液。
      14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其中的患者為人。
      15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其中的生物化學(xué)標(biāo)記物為GPBB和肌鈣蛋白-I。
      16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其中的檢測(cè)試劑進(jìn)一步包含檢測(cè)探針。
      17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其中的檢測(cè)探針被偶聯(lián)到檢測(cè)試劑上。
      18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用于病人中急性心肌梗塞早期檢測(cè)的診斷測(cè)試試劑盒,其特征在于其中的檢測(cè)探針不偶聯(lián)到檢測(cè)試劑上。
      19.一種用于檢測(cè)病人中的心肌梗塞的方法,包括a)將病人的樣本與載體分子相接觸,載體分子包括抗-GPBB的單克隆抗體,一種抗-心肌鈣蛋白-I的單克隆抗體,以及至少一種檢測(cè)試劑。b)檢測(cè)樣本中的GPBB和肌鈣蛋白-I的濃度,其中的檢測(cè)試劑既結(jié)合GPBB和肌鈣蛋白-I,其結(jié)合部位與捕捉試劑所使用的不同;以及c)在一個(gè)預(yù)定的時(shí)間用一個(gè)新的樣本重復(fù)a)和b)。
      20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于檢測(cè)病人中的心肌梗塞的方法,其特征在于其中的檢測(cè)試劑包含一種或多種檢測(cè)探針。
      全文摘要
      本發(fā)明包含一種免疫化學(xué)測(cè)定法用于測(cè)定一個(gè)樣本中至少兩種抗原。免疫化學(xué)測(cè)定法包括使源于病人的樣本與一個(gè)載體分子相接觸,該載體分子包含至少兩種捕捉抗體,每種抗體能夠特異的結(jié)合到樣品中抗原的結(jié)合部位上。該測(cè)定法進(jìn)一步包含一種檢測(cè)抗體,該抗體能夠特異的結(jié)合到同一抗原上另一結(jié)合部位,該結(jié)合部位不同于捕捉抗體所結(jié)合的部位。檢測(cè)試劑進(jìn)一步結(jié)合到一個(gè)或更多個(gè)檢測(cè)探針上以便樣本中抗原的檢測(cè)。本發(fā)明的免疫化學(xué)測(cè)定法被特別設(shè)計(jì)以檢測(cè)病人樣本中在不同的時(shí)間間隔所釋放的生物化學(xué)標(biāo)記物。
      文檔編號(hào)G01N33/573GK1618017SQ02827567
      公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月27日
      發(fā)明者諾爾 弗朗茨 申請(qǐng)人:迪爾基因國(guó)際有限公司
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