專利名稱：分泌抗乙肝人單克隆抗體的異種雜交瘤細(xì)胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異種雜交瘤工程細(xì)胞系的構(gòu)建方法，尤其是涉及一種分泌抗乙肝人單克隆抗體的異種雜交瘤細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
用雜交瘤技術(shù)研制鼠單克隆抗體成功以來，人們已研制出種類繁多的鼠單克隆抗體，得到了廣泛的應(yīng)用，形成了巨大的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。鼠單克隆抗體用作人體內(nèi)的治療制劑，由于是異種蛋白，可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，所以受到很大限制。因此，自上世紀(jì)80年代以來，人單克隆抗體的研究受到醫(yī)學(xué)生物界的高度重視，認(rèn)為人單克隆抗體能夠加強(qiáng)和改善對傳染病的治療，而人血清免疫球蛋白作為一種治療模式，歷史上的迫切性強(qiáng)烈贊成發(fā)揮人單克隆抗體的潛力。
由于人單克隆抗體的研究難度大，發(fā)展相對緩慢，但人單克隆抗體可用于人體內(nèi)對癌癥的診斷、治療和預(yù)防，特別是各種傳染因子所致的各種傳染病。所以，自上世紀(jì)80年代以來，人單克隆抗體的研究日趨高漲，至上世紀(jì)90年代初在世界范圍內(nèi)已獲得一大批不同種類的人單克隆抗體，特別是在惡性腫瘤的診治和傳染病的治療和預(yù)防方面最為突出。1991年，歐洲經(jīng)濟(jì)共同體頒布了關(guān)于“人單克隆抗體的生產(chǎn)與質(zhì)量管理指南”的文件，為生產(chǎn)人單克隆抗體及質(zhì)量控制提供了依據(jù)，文件強(qiáng)調(diào)人體內(nèi)使用人單克隆抗體診斷，治療和預(yù)防疾病有重大價值。國內(nèi)自上世紀(jì)80年代中期以來，陸續(xù)有幾家研制人單克隆抗體成功，如中國醫(yī)科院顧方舟的脊髓灰質(zhì)炎病毒的人單克隆抗體，第四軍醫(yī)大學(xué)崔運昌的抗流行性出血熱病毒的人單克隆抗體，北京病毒研究所陳伯權(quán)的抗乙型腦炎病毒的人單克隆抗體等。
當(dāng)前國際上研制人單克隆抗體在技術(shù)上的發(fā)展主要表現(xiàn)在DNA重組技術(shù)研制“人源性抗體”，國內(nèi)也開展了這方面的研究，但基因工程法研制“人源性”的單克隆抗體(McAb)，在技術(shù)上尚不完善，研制出來的抗體活性和親和性上還存在一定的問題，同時，無論是工程菌還是工程細(xì)胞對抗體的表達(dá)上都不太理想。
抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體(抗HBV hMcAb)的研究之所以重要是因為它在乙型肝炎的防、治和診斷方面具有巨大的應(yīng)用潛力。眾所周知，乙型肝炎(HB)是世界上，特別是東亞、東南亞、南亞及中東一帶廣泛傳播流行的疾病，僅中國而言，帶病毒者約1.3億，HB患者約3000萬。HB發(fā)病時間長，有慢性化傾向，有相當(dāng)大的部分患者轉(zhuǎn)為慢性肝炎、肝硬化，甚至轉(zhuǎn)為肝癌，對人類的健康危害極大，有的患者不僅喪失大部分勞動能力，還要花巨資治療，加上不良的預(yù)后，其精神壓力也是不可忽視的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體的異種雜交瘤工程細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的該方法包括以下步驟(1)、抗-HBs(抗乙肝表面抗原抗體)陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)的制備脾供者術(shù)前血化驗抗-HBs陽性，術(shù)前一周肌注乙肝疫苗，經(jīng)外科手術(shù)摘除脾，取部分皮質(zhì)組織，將脾組織勻漿分離出脾細(xì)胞，用RG(無血清培基)離心洗滌2次，再用RG懸浮SL，以臺盼蘭排斥法計數(shù)活細(xì)胞，取所需數(shù)量備用。
(2)、鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/Ag8-653的制備將生長旺盛的鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/Ag8-653細(xì)胞接種在RGS(完全培基)培養(yǎng)基中，濃度4×104/ml的情況下，培養(yǎng)4天，在細(xì)胞濃度達(dá)1×106/ml以上，活力達(dá)98％，按需要量制備瘤細(xì)胞。
(3)、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備將BALB/C小鼠拉頸處死，用70％酒精浸泡3分鐘，在腹中部剪一橫向切口，將皮膚向兩側(cè)拉開，盡量露出腹壁，用注射器向腹腔內(nèi)注入5mlRG，按摩腹部1分鐘，再將原液抽回，抽出液每ml約含腹腔細(xì)胞100萬以上，按需制備小鼠腹腔細(xì)胞，用臺盼蘭排斥法計數(shù)。
(4)、異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程將抗HBs陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)與鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/AG8-653的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，從96孔板雜交瘤生長陽性孔，檢出抗-HBs陽性孔，經(jīng)對抗體陽性孔雜交瘤細(xì)胞克隆。
(5)、抗體陽性孔異種雜交瘤細(xì)胞的克隆融合后將融合細(xì)胞加入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞不斷增殖，到融合后12-14天，用ELISA檢出抗-HBs陽性孔，將細(xì)胞生長好，抗體滴度高孔中的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，每孔1個細(xì)胞的克隆可反復(fù)進(jìn)行3-4次，達(dá)到培養(yǎng)板100％的抗體陽性孔，此時已單克隆華，并已穩(wěn)定，可獲得穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤工程細(xì)胞系。
(6)、對異種雜交瘤細(xì)胞的抗-HBs、親和性、交叉反應(yīng)、生長與分泌抗體動力學(xué)、核型分析、細(xì)胞生長穩(wěn)定性、抗體分泌穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、凍存與復(fù)蘇的系統(tǒng)鑒定分析a、經(jīng)ELISA檢定，異種雜交瘤細(xì)胞均分泌IgM類hMcAb(人單克隆抗體)，與人μ鏈相匹配的是人“λ”輕鏈，即μ(λ)；b、異種雜交瘤細(xì)胞分泌的hMcAb對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有特異性，親和性；c、與其他乙肝標(biāo)志及其他一些病毒無交叉反應(yīng)；d、核型分析異種雜交瘤細(xì)胞含有鼠染色體和人染色體，含有人的14號、22號和X染色體；e、異種雜交瘤細(xì)胞生長穩(wěn)定，產(chǎn)抗體穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定3個月以上；f、凍存與復(fù)蘇良好。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明將抗乙肝表面抗原抗體陽性人脾淋巴細(xì)胞與鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/Ag8-653細(xì)胞融合，采用有限稀釋法克隆抗體陽性孔雜交瘤細(xì)胞，可得到穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體的異種雜交瘤細(xì)胞系。利用抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤工程細(xì)胞系分泌的抗乙型肝炎病毒單克隆抗體，經(jīng)分離純化后與干擾素交聯(lián)，可制成治療乙型肝炎的“抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體交聯(lián)干擾素靶向制劑”和具有免疫作用的“乙肝被動免疫制劑”、“乙肝檢測試劑”。


圖1是本發(fā)明異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程圖。
圖2是本發(fā)明異種雜交瘤工程細(xì)胞系生長與抗體分泌的動力學(xué)圖。
圖3是本發(fā)明細(xì)胞株產(chǎn)抗體穩(wěn)定性觀察結(jié)果圖。
具體實施例方式
實施例一、各種細(xì)胞的制備1、抗-HBs陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)的制備脾供者男45歲，有慢HB史，因脾腫大住院，行脾摘除術(shù)。經(jīng)血化驗抗-HBs陽性，摘脾術(shù)前一周肌注乙肝疫苗，手術(shù)取出脾時，立即無菌取脾皮質(zhì)組織，將脾組織勻漿分離出脾細(xì)胞，用RG(無血清培基)離心洗滌2次，再用RG懸浮SL，以臺盼蘭排斥法計數(shù)活細(xì)胞，取所需數(shù)量備用。
2、鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/AG8-653的制備取生長旺盛的653細(xì)胞，接種在RGS(完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，在濃度4×104/ml的情況下，培養(yǎng)4天。在細(xì)胞濃度達(dá)1×106/ml以上，活力達(dá)98％，按需要量準(zhǔn)備瘤細(xì)胞。
3、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備將BALB/C小鼠拉頸處死，用70％酒精浸泡3分鐘，放在超凈臺中的平皿蓋上，在腹中部剪一橫向切口，將皮膚向兩側(cè)拉開，盡量露出腹壁。用注射器向腹腔內(nèi)注入5mlRG，按摩腹部1分鐘，再將原液抽回，抽出液每ml約含腹腔細(xì)胞100萬以上，按需制備小鼠腹腔細(xì)胞，用臺盼蘭排斥法計數(shù)。
二、異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程1、細(xì)胞融合設(shè)置的有關(guān)參數(shù)SL653＝1×108∶5×107；融合劑PEGMW＝4000，PEG配置濃度C＝50％，一次融合用量＝0.7ml；培養(yǎng)板6塊96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml培基，每孔融合后的細(xì)胞數(shù)以SL為準(zhǔn)，1.66×105/孔；飼養(yǎng)細(xì)胞BALB/C小鼠腹腔細(xì)胞，4×104/孔，融合后當(dāng)日就用含20％胎牛血清的HAT(選擇培基)培基培養(yǎng)。
2、異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程按圖1“異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程”所示工藝流程進(jìn)行細(xì)胞融合。將抗HBs陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)與鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/AG8-653的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，從96孔板雜交瘤生長陽性孔，檢出抗-HBs陽性孔。經(jīng)對抗體陽性孔雜交瘤細(xì)胞克隆，獲得穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的異種雜交瘤細(xì)胞系。
三、抗-HBs陽性孔雜交瘤細(xì)胞的克隆融合后將融合細(xì)胞加入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，如果融合成功，有部分或全部培養(yǎng)孔就會有細(xì)胞克隆生長，長有雜交瘤的孔稱為生長陽性孔，雜交瘤細(xì)胞不斷增殖，到融合后12-14天，生長陽性孔細(xì)胞可達(dá)1-2×104/孔，此時可用ELISA檢測該孔上清中有無抗-HBs，如檢出抗體陽性孔，就將細(xì)胞生長好，抗體滴度高的孔中的細(xì)胞進(jìn)行克隆。
采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆時，第一次克隆平均每孔10個細(xì)胞，2次克隆每孔5個細(xì)胞，3次克隆每孔2個細(xì)胞，4次克隆每孔1個細(xì)胞，每孔1個細(xì)胞的克隆可反復(fù)進(jìn)行3-4次。達(dá)到培養(yǎng)板100％的抗體陽性孔，此時已單克隆化，并已穩(wěn)定。如果培養(yǎng)一段時間不夠穩(wěn)定，可再反復(fù)克隆幾次，就可獲得穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤細(xì)胞系。
四、抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤工程細(xì)胞系的系統(tǒng)鑒定1、對抗-HBs鑒定a、經(jīng)ELISA檢定，異種雜交瘤細(xì)胞系均分泌IgM類hMcAb，與人μ鏈相匹配的是人“λ”輕鏈，即μ(λ)；b、異種雜交瘤細(xì)胞分泌的hMcAb對HBsAg(乙型肝炎表面抗原)有特異性和親和性。
2、與其他乙肝標(biāo)志及其他一些病毒無交叉反應(yīng)。(見表1)
ELISA測定異種雜交瘤細(xì)胞hMcAb與各種抗原的反應(yīng)結(jié)果 表1

3、抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤工程細(xì)胞系生長和抗體分泌的動力學(xué)鑒定異種雜交瘤工程細(xì)胞系生長與抗體分泌有十分明確的正相關(guān)性(見圖2)。
4、異種雜交瘤工程細(xì)胞系的核型分析異種雜交瘤工程細(xì)胞系細(xì)胞含有兩物種的染色體，即有鼠染色體(多數(shù)，端著絲點)，也有人染色體(少數(shù)，中間著絲點)。說明異種細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜交細(xì)胞是異核型細(xì)胞。它產(chǎn)生的是結(jié)構(gòu)完整的人IgM單體分子，所以它的染色體必定含有人的14，22和X染色體。
5、雜交瘤細(xì)胞系生長的穩(wěn)定性鑒定雜交瘤細(xì)胞系的生長力強(qiáng)，且傳代穩(wěn)定，在傳代接種濃度4×104/ml，連續(xù)培養(yǎng)4天，細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1×106/ml以上。
6、異種雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)抗體穩(wěn)定性鑒定連續(xù)傳代培養(yǎng)，間斷性地測定其培養(yǎng)上清抗體ELISA OD值，連續(xù)觀察3～5月以上，雜交瘤產(chǎn)抗體應(yīng)是穩(wěn)定的(見圖3)。
7、異種雜交瘤細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性鑒定對異種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆時，抗體陽性克隆保持100％，克隆時間應(yīng)保持在三個月以上。
8、培養(yǎng)上清抗HBV hMcAb的ELISA效價在1.5×212以上。
9、工程細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇良好，按需配置凍存液(凍存液比例二甲亞砜∶胎牛血清∶無血清培基＝1∶3∶6)按4×106/ml懸浮細(xì)胞，按1ml的量分裝玻璃安瓶，封口后懸于液N2面上2小時，再沉入液N2中凍存。凍存5年復(fù)蘇良好，活細(xì)胞70％以上，經(jīng)傳代培養(yǎng)，生長力和抗體分泌功能無變化。
權(quán)利要求
1.一種分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體的異種雜交瘤工程細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)、抗-HBs(抗乙肝表面抗原抗體)陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)的制備；(2)、鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/Ag8-653的制備；(3)、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備；(4)、異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程；(5)、抗體陽性孔異種雜交瘤細(xì)胞的克?。?6)、對異種雜交瘤細(xì)胞的抗-HBs、親和性、交叉反應(yīng)、生長與分泌抗體動力學(xué)、核型分析、細(xì)胞生長穩(wěn)定性、抗體分泌穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、凍存與復(fù)蘇的系統(tǒng)鑒定分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)抗-HBs陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)的制備是指脾供者術(shù)前血化驗抗-HBs陽性，術(shù)前一周肌注乙肝疫苗，經(jīng)外科手術(shù)摘除脾，取部分皮質(zhì)組織，將脾組織勻漿分離出脾細(xì)胞，用RG(無血清培基)離心洗滌2次，再用RG懸浮SL，以臺盼蘭排斥法計數(shù)活細(xì)胞，取所需數(shù)量備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/Ag8-653的制備是指將生長旺盛的鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/Ag8-653細(xì)胞接種在RGS(完全培基)培養(yǎng)基中，濃度4×104/ml的情況下，培養(yǎng)4天，在細(xì)胞濃度達(dá)1×106/ml以上，活力達(dá)98％，按需要量制備瘤細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備是指將BALB/C小鼠拉頸處死，用70％酒精浸泡3分鐘，在腹中部剪一橫向切口，將皮膚向兩側(cè)拉開，盡量露出腹壁，用注射器向腹腔內(nèi)注入5mlRG，按摩腹部1分鐘，再將原液抽回，抽出液每ml約含腹腔細(xì)胞100萬以上，按需制備小鼠腹腔細(xì)胞，用臺盼蘭排斥法計數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)異種雜交瘤細(xì)胞融合工藝流程是指將抗HBs陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)與鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P3-X63/AG8-653的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，從96孔板雜交瘤生長陽性孔，檢出抗-HBs陽性孔，經(jīng)對抗體陽性孔雜交瘤細(xì)胞克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于所述步驟(5)抗體陽性孔異種雜交瘤細(xì)胞的克隆是指融合后將融合細(xì)胞加入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞不斷增殖，到融合后12-14天，用ELISA檢出抗-HBs陽性孔，將細(xì)胞生長好，抗體滴度高孔中的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，每孔1個細(xì)胞的克隆可反復(fù)進(jìn)行3-4次，達(dá)到培養(yǎng)板100％的抗體陽性孔，此時已單克隆華，并已穩(wěn)定，可獲得穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤工程細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于所述步驟(6)對異種雜交瘤細(xì)胞的抗-HBs、親和性、交叉反應(yīng)、生長與分泌抗體動力學(xué)、核型分析、細(xì)胞生長穩(wěn)定性、抗體分泌穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性，凍存與復(fù)蘇的系統(tǒng)鑒定分析是指a、經(jīng)ELISA檢定，異種雜交瘤細(xì)胞均分泌IgM類hMcAb(人單克隆抗體)，與人μ鏈相匹配的是人“λ”輕鏈，即μ(λ)；b、異種雜交瘤細(xì)胞分泌的hMcAb對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有特異性，親和性；c、與其他乙肝標(biāo)志及其他一些病毒無交叉反應(yīng)；d、核型分析異種雜交瘤細(xì)胞含有鼠染色體和人染色體，含有人的14號、22號和X染色體；e、異種雜交瘤細(xì)胞生長穩(wěn)定，產(chǎn)抗體穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定3個月以上；f、凍存與復(fù)蘇良好。
全文摘要
本發(fā)明建立了一種分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體的異種雜交瘤工程細(xì)胞系的構(gòu)建方法。采用本發(fā)明的異種雜交瘤細(xì)胞融合的工藝流程將抗－HBs陽性人脾淋巴細(xì)胞(SL)與鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系P
文檔編號G01N33/576GK1600856SQ03134618
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者張永忠 申請人:陜西九州科技股份有限公司