專利名稱：一種檢測目標微生物和靶分子的檢測設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種利用免疫電化學(xué)方法檢測目標微生物和靶分子的檢測設(shè)備。
本實用新型各部件按照如

圖1所示相互連接，其中Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15均為三通(參見圖4)，I5為二通閥(參見圖4)。符號0為四通。圖1中直線部分為內(nèi)徑為1mm的管路，其中1和2為二個微型泵(見附圖2、3)，各與二個二通閥(在泵的兩側(cè)，未標出)相接后，可實現(xiàn)流路內(nèi)液體流動的正反方向變換。本實用新型所采用的泵和二通閥及三通閥均購買于美國的The lee Company。3為生物敏感元件(見圖8和圖9)，內(nèi)部有固定化抗體的膜或玻璃珠，在這里稱作反應(yīng)池。4為樣品池(見圖12)，內(nèi)部裝有底物α-萘酚磷酸鹽。5為電化學(xué)檢測器(見圖11)，由工作電極(W)、參比電極(R)和對電極(C)組成，形成一個流動電解質(zhì)的電解池。6對應(yīng)由三氯乙酸配制的洗液。7，17，13，19，20表示與底物緩沖液(pH為9.8的二乙醇胺溶液)相接。8，10，11，15，18(其中10可通過三通Y11與11相通)表示與廢液相連。9為PBS溶液。12為待檢測樣品。14為酶結(jié)合物。16為底物溶液。
二通可進行開、關(guān)操作。由于每個三通都有一個公共端，與另兩端相通，而另兩端卻不互通，所以三通在流路中的連接對控制內(nèi)部溶液的走向非常重要。圖5是各三通閥的標識圖，各閥的端口方向均與圖1中各閥的相應(yīng)位置對應(yīng)，是一種平移關(guān)系。在進行流路安裝時，一定要注意所有各閥的A端均為公共端。
圖1中泵1與泵2均為可變流量體積的微型泵。每個泵的重量只有300克，流速在0-7500微升/分鐘之間可調(diào)。這種微型泵完全可以替代蠕動泵。微型泵、閥技術(shù)的成熟與商品化，也是我們能夠進行自動化、便攜式微生物檢測器設(shè)計的前提之一。
本實用新型檢測設(shè)備所使用的電化學(xué)檢測器(圖1中的5)，其結(jié)構(gòu)如圖10和圖11所示，它主要由三部分組成，即工作電極66(W)、參比電極68(R)和輔助電極69(C)。這三個電極的形狀一樣(見圖11中右下側(cè)的電極元件71、72、73)，中間孔徑為1mm，柱高12mm，柱外徑10mm，其制作方法是在有機玻璃柱的全部表面涂上一層導(dǎo)電材料，工作電極和輔助電極涂上導(dǎo)電碳漿，參比電極涂上一層Ag-AgCl漿，這三個電極組裝到一個設(shè)計好的有機玻璃腔體內(nèi)，形成左側(cè)的電化學(xué)電極檢測器，在中間形成一個流路通道，構(gòu)成一個流動反應(yīng)液的電解池。
圖中66、68、69為三個電極的引線孔，在實際應(yīng)用中采用了導(dǎo)電的銅螺絲，擰入三個孔后，分別與71、72、73導(dǎo)電的表面相連接，銅螺絲的外部再分別與恒電位儀相接。各部件的關(guān)系是71裝入部件65的上部內(nèi)腔中，然后擰上64，然后72裝入67的上部內(nèi)腔中，65再擰到67上部，接下來73裝入67的下面內(nèi)腔中，70再擰到67的下端上，從而形成了一個電化學(xué)檢測器。
本實用新型檢測設(shè)備當中使用的底物樣品池(圖1當中的4)，其結(jié)構(gòu)如圖12所示。該樣品池的設(shè)計有兩方面的目的，一是為了便于流路中樣品的充分有效混合，二是為了便于儲存底物。圖12中74為閥門，在接入流路后打開，在儲存時關(guān)上，避免底物溢出，也可避免水份等進入。75、76為有機玻璃材料，這兩部分可通過螺絲擰合在一起，77對應(yīng)所指為兩部分的螺紋。內(nèi)腔中間孔柱部分的直徑為8mm，上下高8mm，內(nèi)腔上下總高為20mm。
本實用新型檢測設(shè)備當中的生物敏感元件反應(yīng)池和探頭的設(shè)計方案如下如圖8、9所示，圖中的檢測元件都由有機玻璃材料制成。圖8膜元件由55、56、57、58四部分組成，各部分的關(guān)系是抗體膜57可放在內(nèi)壁有一圈平臺的底座58內(nèi)，56為一有錐形孔的有機玻璃柱，可以壓在膜的周邊上，55為一帶有螺紋的有機玻璃罩，可以擰在58(也有螺紋)上，在擰55時，可產(chǎn)生一個向下的壓力，使56壓緊中間的膜，從而在檢測時不致于被水流沖下來。
圖9與圖8類似，幾部分之間也是壓接在一起的。在部件62和59內(nèi)都有一個內(nèi)壁平臺，當下面的圓形不銹鋼網(wǎng)60放在62的平臺上后，放入圓形孔柱61，其下沿壓在底下的鋼網(wǎng)周邊部分，然后在61的空腔內(nèi)裝入玻璃珠，上面蓋上第二個鋼網(wǎng)60，接下來蓋上部件59，59的螺紋擰到62的螺紋上，59的平臺可產(chǎn)生一個向下的壓力，使各部件間相互壓緊在一起。
兩種元件的設(shè)計外形尺寸一致，可以在流路的多探頭設(shè)計中互換。設(shè)計元件內(nèi)膜和玻璃珠與溶液有效接觸面的直徑為6-8mm。元件內(nèi)腔高(上下出入口間距)為16mm。玻璃珠層厚為5mm左右，玻璃珠的直徑為0.6mm-1mm，固定于兩層薄不銹鋼絲網(wǎng)之間。
對于上述這兩種元件的結(jié)構(gòu)和雙錐形幾何形狀進行如此設(shè)計，目的是為了增大膜或玻璃珠與溶液的作用面積，提高酶催化反應(yīng)的效率和產(chǎn)量，提高靈敏度。另外也有利于徹底的漂洗和反應(yīng)，使其不存在死角。
對于上述元件，在選用玻璃珠的尺寸上，發(fā)明人考慮到相同重量的玻璃珠，珠的直徑越小，其表面積與體積比越大，因此，流過小玻璃珠元件的樣品溶液中的檢測物與玻璃珠表面上抗體結(jié)合的概率更大。在兼顧便于抗體固定化操作和元件通透性好的前題下，本實用新型選用了直徑0.6mm-1mm的玻璃珠。
本實用新型上述兩種元件當中使用的尼龍膜和玻璃珠固相載體表面，需要進行修飾，對于修飾方法的選擇，我們考慮了如下因素本實用新型采用孔徑為3μm和5μm的尼龍膜(購于美國的Pall Corporation)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)報道，可供選用的尼龍膜有兩種，一種表面帶有羧基(C膜)，另一種帶有胺基(B膜)，帶有羧基的需用碳二亞胺活化，與抗體形成-CONH-酰胺鍵的共價連接。而帶有胺基的尼龍膜可用戊二醛法與抗體生成亞胺結(jié)構(gòu)-CH＝N-的共價鏈接，此不飽和鍵可用NaBH4或NaCNBH3還原，生成-CH2-NH-，這種飽和鍵要穩(wěn)定的多。發(fā)明人在實驗中對兩種膜的兩種抗體固定化方法進行了研究，結(jié)果表明，在控制好實驗條件的情況下，二者均能有效用于檢測體系。由于本實用新型使用堿性磷酸酶體系，檢測工作的pH值為9.8，且在檢測過程中需用pH為3-3.5的三氯乙酸洗液漂洗膜片，在這樣的酸、堿性條件變化下，通過酰胺鍵而形成的抗體鏈接在操作方法不當時可能會水解或部分水解。比如，實用新型人在實驗中發(fā)現(xiàn)，在用三氯乙酸洗液漂洗膜后，如果接下來在流路內(nèi)直接泵入pH為9.8的底物緩沖液，就會出現(xiàn)酰胺鍵的水解，而當在這兩個步驟之間加一個pH為7.2的PB緩沖液的泵入操作后，就可避免酰胺鍵的水解。
對于玻璃珠，本實用新型先進行了胺基化，使玻璃珠表面帶有可利用的胺基，后面可用戊二醛法鏈接抗體，不過需用一個較長的連接臂(linker)，如2HN-PEG-NH2分子量為3400，這樣可減少抗體與抗原結(jié)合的空間位阻，也可增加抗體的活性。另外一個不用戊二醛的方法是用半氧化狀態(tài)的葡聚糖(分子量約為4000)法，在這個分子上有豐富的醛基，可直接與抗體和玻璃珠的胺基結(jié)合，然后再用還原劑(NaCNBH3)還原，從而使抗體和玻璃珠共價偶聯(lián)。關(guān)于這方面的方法技術(shù)參見Biotechnol.Bioengineering，24，1069-1080；J.Biochem.Biophys.Methods 45(2000)211-219；Applied and Environmental Microbiology.Mar.2001.p.1300-1307.除此之外，還可利用Pall Cooperation的另一種載體膜ImmunodyneABC Membrane，這種膜可直接在其表面在中性pH值下以共價方式固定化抗體，非常方便?？傊ず筒Ａе楸砻娴男揎椉翱贵w的固定化方法已相當成熟，可方便地運用于生物傳感器元件的制作中。
上述元件當中的兩種免疫載體表面，在檢測過程當中會出現(xiàn)非特異吸附現(xiàn)象。因此，需要對免疫載體表面的非特異吸附進行處理。本實用新型采用漂洗的方法進行處理，目的是去除免疫載體表面的非特異性吸附。
同ELISA方法一樣，酶結(jié)合物的非特異吸附會有嚴重的干擾作用，主要表現(xiàn)在引起假陽性結(jié)果。因此在免疫學(xué)檢測中，一般采用封閉的方法來防止非特異吸附。同樣，采用尼龍膜和玻璃珠為載體的免疫學(xué)檢測也存在這個問題。采用傳統(tǒng)的BSA封閉的方法，在PBS漂洗液中加各種表面活性劑Tween、Triton以及脫脂奶粉封閉等，都沒能有效去除非特異吸附。經(jīng)分析，如果采用常規(guī)封閉膜方法，在用于流動液路中時，其封閉效果會受到很大影響。一方面流動相的反復(fù)運動對膜的作用不均衡，可能使吸附在膜和玻璃珠表面的封閉劑脫落下來。另一方面，用于檢測中的各種溶液的pH值也會變化，這都可能導(dǎo)致封閉劑的脫落。在這種情況下，尋找一種有效的非特異去除方法是必須的。
本實用新型在抗體的固定化中使用了共價結(jié)合的方法，所以單純的物理方法不會洗掉抗體。同時，抗原抗體之間的結(jié)合也是非常牢固的，一般的漂洗方法也不能使它們拆分，在這個前提下，本實用新型從漂洗而非封閉的角度來去除非特異吸附。
下面是本實用新型的一種漂洗方法，其出發(fā)點是找到一種材料和一個相應(yīng)的pH值范圍，在這個pH值范圍之內(nèi)，抗原抗體的結(jié)合不被拆分，而非特異吸附引起的結(jié)合作用可以被破壞掉，從而去除非特異吸附。經(jīng)一系列試驗表明，三氯乙酸在一定條件下能滿足這一條件。具體方法是配制PB溶液，濃度為30mM，pH為7.2，在其中加入三氯乙酸，使其濃度達到0.6-1M，然后調(diào)pH值至3-3.5(抗體固定化載體不同，pH值稍有變化)，即可用作兩種載體的漂洗液。三氯乙酸的作用是在一定pH值下改變非特異吸附蛋白的帶電性質(zhì)，從而使其沉淀下來。
本漂洗方法對兩種免疫載體都適用。實施例2是對此漂洗液是否有效去除了非特異吸附的驗證實驗。
如前所述，現(xiàn)有技術(shù)中采用尼龍膜在對實際樣品進行檢測時發(fā)生了堵塞現(xiàn)象(見B.C.Weimer，M.K.Walsh，C.Beer，et.a1.，Solid-phase Capture of Proteins，Sporesand Bacteria，Applied and Environmental Microbiology，Mar.2001，vol.67，No.3，1300-1307)。由于膜用于免疫元件中有其優(yōu)點，如元件易于小型化、表面積與體積比高等，本實用新型在繼續(xù)采用膜為固定化抗體的前提下，為解決堵塞這個問題，本實用新型通過控制流過免疫膜的反應(yīng)液和漂洗液的方向變換與流速，可避免濾膜的堵塞問題。具體過程為當免疫濾膜與正向流過的反應(yīng)液反應(yīng)時，如果有較大粒子雜質(zhì)存在，則會吸附在膜的正面上。這樣，本實用新型可以控制漂洗液的方向由膜的背面向正向流，并且加大流速，如反應(yīng)階段流速通常為幾百微升/分鐘，漂洗速度可為幾毫升/分鐘，則吸附堵塞在膜正面的雜質(zhì)粒子就會被沖洗掉。同時，本實用新型采用大孔徑的膜(5微米)也有利于避免膜的堵塞。
下面以單探頭直接檢測炭疽芽孢為例，就本實用新型檢測設(shè)備的工作原理說明如下在檢測開始之前，反應(yīng)池(敏感元件)3中有一針對炭疽芽孢的抗體膜(或玻璃珠元件)，當待檢樣品12由泵1輸送通過反應(yīng)池3時，如果樣品中有炭疽芽孢存在，則與固定化抗體生成抗體-芽孢結(jié)合物，并就地結(jié)合在膜(或玻璃珠)的表面。經(jīng)漂洗后，再由泵1將酶結(jié)合物14輸送通過反應(yīng)池3，與膜上的抗體-芽孢結(jié)合物反應(yīng)，生成抗體-芽孢-抗體-AP結(jié)合物。然后，用漂洗液6去除可能存在的非特異吸附，尤其是樣品中不含有芽孢時，酶結(jié)合物抗體-AP的非特異吸附會引起檢測結(jié)果的假陽性。下一步是泵1將底物α-萘酚磷酸鹽溶液輸送(圖1中方向向下)通過反應(yīng)池3，如果有芽孢存在，則形成的抗體-芽孢-抗體-AP結(jié)合物上的AP催化α-萘酚磷酸鹽水解，產(chǎn)生α-萘酚，后者在通過電化學(xué)檢測器5時，在工作電位為+350mv下被氧化，并產(chǎn)生相應(yīng)的電流，作為檢測信號。如果樣品中沒有芽孢，則不會形成抗體-芽孢-抗體-AP結(jié)合物，也就不會檢測到電流信號。
檢測中泵2的作用是自動配制底物溶液和標定檢測的本底值，這是本實用新型檢測儀器實現(xiàn)全自動化操作設(shè)計的一部分。這種設(shè)計的考慮基于底物以溶液狀態(tài)長時間存在有可能會發(fā)生自然水解，從而影響檢測的準確性。因此，本實用新型將設(shè)備設(shè)計為在儀器沒有工作的情況下，其底物樣品池儲存于低溫下，在執(zhí)行檢測工作之前，隨時在檢測流路中接入底物樣品池(見圖12)。在檢測過程中由程序控制自動配制底物液。這種作用是通過泵2所在的循環(huán)體系來實現(xiàn)的。泵2在循環(huán)體系內(nèi)工作時，將樣品池中的底物沖洗到底物緩沖溶液中，達到自動配制溶液的目的。在堿磷酶催化體系中，底物為α-萘酚磷酸鹽，其緩沖液為DB(二乙醇胺)溶液，pH為9.8。在混合前，20處只為底物緩沖液，在經(jīng)過圖1中20-Y13-2-Y14-4-20的循環(huán)后，20處的底物緩沖液變成了底物溶液，即可達到混合底物液的目的。
另外，底物樣品準備系統(tǒng)也有預(yù)標定檢測本底的作用。即由泵2系統(tǒng)在檢測開始之前按泵1進行檢測工作時相同的流速標定一個底物溶液的本底電流值，標定時間為檢測前的一分鐘，標定流路為20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)。泵1停，泵2檢測馬上開始。在這個本底值之上的底物催化電流變化作為判定檢測結(jié)果的可靠依據(jù)。
本實用新型設(shè)備的全部流路管道內(nèi)徑為0.8-1mm，這樣可以節(jié)約樣品的試劑量。采用高效微型泵替代蠕動泵，減小儀器的體積并提高自動化。各二、三通閥均為微型結(jié)構(gòu)。
為了實現(xiàn)對多種微生物的同時檢測要求，可以設(shè)計多重組分的檢測方法，該方法可以通過將多種抗體固定于單一載體(如膜、玻璃珠)上來實現(xiàn)，也可以通過檢測設(shè)備的設(shè)計而實現(xiàn)，多重組分檢測的設(shè)計主要涉及以下幾種方案1、多種抗體固定于單一載體的方案如果檢測系統(tǒng)當中的載體是免疫膜元件，在其免疫膜上同時固定多種抗體(共價結(jié)合)，這樣當樣品中有一種或幾種抗原與膜上的抗體相對應(yīng)，就會產(chǎn)生檢測信號。可選擇的制備方法有將多種抗體等量均勻混合，在同一條件下同時以共價形式結(jié)合到膜上去。(采用美國Pall Cooperation生產(chǎn)的ImmunodyneABC Membrane可方便地實現(xiàn)這一目的，因為這種膜可直接在其表面共價結(jié)合抗體而不需任何雙功能基團如戊二醛)。
如果檢測系統(tǒng)當中的載體是玻璃珠元件，制備方法有其特殊性?？蓪⑼慌Ａе榉殖扇舾煞?，每一份固定化一種抗體，然后每一種抗體的玻璃珠取相同數(shù)量進行均勻混合，裝入元件內(nèi)即可。
在抗體的固定化過程中，固定化一種抗體和固定化幾種抗體的反應(yīng)條件是完全一樣的。下述的實施例1描述了單一抗體的固定化過程，用與實施例1完全相同的方法，可以在其它玻璃珠表面固定化對應(yīng)于其它待檢測抗原的抗體。制備好各種固定化抗體的玻璃珠后，均勻混合，即可制備含有多種抗體的玻璃珠元件。
關(guān)于尼龍膜的表面抗體固定化方法，參見文獻報道(Ihab Abdel-Hamid，DmitriIvnitski，Plamen Atanasov，Ebtisam wilkins，F(xiàn)low-through immunofiltration assaysystem for detection of E.Coli 0157H7，Biosensors & Bioelectronics14(1999)309-316.)。關(guān)于玻璃珠的抗體固化方法，參見本實用新型的實施例1。
2.單通道多探頭方案為了實現(xiàn)對多種微生物的同時檢測和適應(yīng)抗體活性滿足多次檢測的要求，本實用新型還涉及了可以設(shè)計多重組分的檢測方法，其方案之一是單通道多探頭方案。
如圖6所示，21、22、23、24為四個免疫檢測元件(以膜元件為例)，每一個三通閥有一個公共端。圖中，各三通閥的端口方向如下Y16與25相連的左端為公共端；Y18與Y16相連的一端為公共端；Y19與Y18相連的一端為公共端；Y21與Y19相連的一端為公共端；Y23與26相連的左端為公共端；Y17與29相連的一端為公共端；Y20與30相連的一端為公共端；Y22與31相連的一端為公共端；25、26為替換圖1中生物敏感元件3的兩個流路接口。29、30、31、32為四個小三通，內(nèi)徑為0.8mm。
通過控制各三通閥的開關(guān)和走向，可以控制和選擇檢測時流路的走向，因此能夠?qū)ζ渲腥我换蛉吭M行操作而不互相影響。流路控制舉例如下溶液通過全部元件時的流路順序是-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-；檢測21時的流路順序是-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；檢測22時的流路順序是-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-；檢測23時的流路順序是-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-；檢測24時的流路順序是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-Y22-31-24-Y23-26-；溶液不通過任何元件時的流路順序是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；雖然圖6中所示為四個探頭，根據(jù)需要可相應(yīng)增加為四個以上，如八個或更多。每個檢測探頭是可更換的。下面的說明也以四探頭膜元件為例。這種設(shè)計在檢測中的應(yīng)用說明如下(1)用于檢測一種明確的目標分析物(如炭疽芽孢)在這種使用情況下，21、22、23、24四個元件上都固定有同一種芽孢抗體，則四個元件至少可完成四次相同的檢測工作，同時這種設(shè)計解決了多次使用中單一元件的抗體活性容易降低的問題。各元件上的抗體是以干態(tài)形式存在于固相表面上的，所以它在常溫下保持活性的時間要長得多(非工作狀態(tài)下存放于冰箱內(nèi))。
(2)用于檢測一種或一種以上可疑的分析物(如某一種生物恐怖試劑，可能為炭疽、鼠疫、天花和土拉中的一種或幾種)這種用途可有兩種實現(xiàn)方式，一種是在多探頭設(shè)計中的每個元件上固定化一種抗體，如四探頭上固定四種抗體(如分別對應(yīng)于炭疽、鼠疫、天花和土拉)，在檢測時依次進行分別的檢測。
另一種方式是，在第一個元件上固定化多種抗體，比如21上面同時有三種微生物的相應(yīng)抗體，而22、23、24上分別有對應(yīng)于炭疽、鼠疫、天花的一種抗體。在進行檢測時，如果元件21給出陽性結(jié)果，則說明存在可疑微生物，則繼續(xù)檢測22、23、24三個元件，進一步確認是哪一種。同樣，這種檢測功能可以擴展，比如檢測八種分析物。
單通道多探頭設(shè)計比較適用于檢測情況下的應(yīng)用，而對于有監(jiān)測需要的場合，則需進一步設(shè)計雙通道多探頭的設(shè)備。
3、雙通道多探頭設(shè)計本實用新型多重組分檢測方法的另一種方案是雙通道多探頭方案。如圖7所示，在圖6的基礎(chǔ)上進行擴展設(shè)計，其左右兩側(cè)與圖6的結(jié)構(gòu)完全相同。圖中53、54為溶液的出入口，Y40和Y41為兩個三通，它們與53和54相連的一端為公共端，在檢測時，可隨時改變流路內(nèi)溶液的走向，即可在左右兩套檢測體系間進行轉(zhuǎn)換。其中33、34、35、36、43、44、45、46為八個檢測元件，Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30、31、Y32、Y33、Y34、Y35、Y36、Y37、Y38、Y39為三通閥。37、38、39、40、41、42、47、48、49、50、51、52為小硬三通。各三通閥的端口方向是右側(cè)四個與圖6中完全相同，左側(cè)各閥的端口方向與右側(cè)成鏡像對應(yīng)關(guān)系。
用于監(jiān)測時，右側(cè)的33、34、35、36四個元件都為多種抗體膜(或玻璃珠)，比如，它們上面都有四種對應(yīng)于不同抗原的抗體，且四個元件相同。左側(cè)的四個元件43、44、45、46為單一種類抗體膜，每一種元件對應(yīng)一種抗原。
這套系統(tǒng)用于監(jiān)測的工作原理是右側(cè)的四個元件依次連續(xù)工作，對外部采集送來的樣品進行連續(xù)檢測，當檢測到陽性信號后，馬上啟動左側(cè)檢測系統(tǒng)，進一步分析確認是哪一種或幾種抗原。因此，從功能上看，這套系統(tǒng)的右側(cè)起到報警的作用，左側(cè)為檢測的作用。
用于監(jiān)測時，檢測器連續(xù)自動工作的持續(xù)時間很重要，這種設(shè)計正滿足了這種要求。檢測順序為由33至36，如果以每個元件上的抗體活性只能滿足一次檢測為準，則無需更換元件就能完成四次檢測，監(jiān)測時間大大延長。
本實用新型上述多探頭設(shè)計的實際應(yīng)用過程，類似于下述實施例5的多探頭循環(huán)底物增強信號檢測模式操作過程，每一步都涉及各泵、閥的開關(guān)轉(zhuǎn)換，由程序自動控制進行。例如，如圖7所示，在執(zhí)行監(jiān)測任務(wù)時，一種含有未知細菌的樣品被采集送到此檢測器樣品池，此時34號元件執(zhí)行檢測任務(wù)，于是可進行以下檢測步驟泵1工作，將樣品泵入并通過34號元件，樣品中的未知細菌與元件上的對應(yīng)抗體結(jié)合，再與酶結(jié)合物作用后，形成Ab-Ag-Ab-AP夾心結(jié)構(gòu)，與底物作用后，產(chǎn)生的催化水解產(chǎn)物在電化學(xué)檢測器上氧化，產(chǎn)生電流信號，儀器報警，并啟動左側(cè)的檢測體系。左側(cè)的四個元件依次檢測樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有元件45(假設(shè)為炭疽抗體元件)有響應(yīng)信號，則可斷定樣品中有炭疽芽孢。其實，這種設(shè)計在應(yīng)用上是很靈活的，比如用于七種分析物的檢測在元件33上固定化有七種抗原的抗體，34、35、36、43、44、45、46上分別有對應(yīng)七種不同抗原的抗體，則這種設(shè)計可檢測七種不同的抗原。
當圖7中兩側(cè)通道上的元件個數(shù)分別增加到八個時，完成一次連續(xù)監(jiān)測的時間又增加一倍。以一個小時提供一個監(jiān)測結(jié)果為準，則此檢測器可完成八個小時的連續(xù)自動監(jiān)測任務(wù)。
本實用新型還對監(jiān)測器的檢測信號放大進行了設(shè)計，目的在于從流路設(shè)計和操作方式上提高檢測靈敏度。主要有三種途徑一是延長底物溶液與酶作用的時間，增加催化水解產(chǎn)物的濃度，從而提高電化學(xué)電極上氧化電流的強度。這種作用的實現(xiàn)是通過泵1所在的左側(cè)循環(huán)體系來實現(xiàn)的(見圖1泵1-Y5-3-0-Y7-Y6-Y1-泵1)。反應(yīng)池3敏感元件上的堿性磷酸酶AP(即Ab-Ag-Ab-AP結(jié)合物上的AP)不斷地催化底物分解，時間越長，循環(huán)次數(shù)越多，流路中固定體積溶液內(nèi)產(chǎn)生的催化水解產(chǎn)物濃度越高，從而起到放大檢測信號的作用。
第二種途徑是延長樣品溶液與抗體膜作用的時間。這種方式比較適用于樣品量少的情況，在這種情況下，提高樣品中待檢測抗原與固定化抗體的結(jié)合率是提高檢測靈敏度的關(guān)鍵。于是對固定體積的樣品溶液反復(fù)循環(huán)通過抗體元件，盡可能多地將有限體積溶液內(nèi)的抗原結(jié)合到抗體膜上。這個過程對應(yīng)于Ab-Ag-Ab-AP夾心結(jié)構(gòu)中Ag的量增加后，AP的量也相應(yīng)增加。由于酶量增加會提高底物水解速度和水解產(chǎn)物的量，其結(jié)果是水解產(chǎn)物的濃度增大，因此起到放大信號的作用。此過程對應(yīng)的循環(huán)是通過泵1所在的右側(cè)流路體系來實現(xiàn)的(見圖1)，為泵1-Y1-Y4-12(菌樣)-Y11-Y10-0-3-Y5-泵1。
第三種途徑是針對待檢測抗原濃度低而溶液量又較大的樣品(比如100ml，100cell/ml)，采用濾膜在流路內(nèi)過濾富集檢測物的方法。具體操作是在與樣品12和Y4之間加一個大孔徑(8μm)濾膜過濾器(圖1中沒有標出)，同時在Y11與12之間加一個小孔徑(如0.22μm)濾膜過濾器(圖1中沒有標出)，檢測樣品溶液從Y4進入流路，流經(jīng)路線(逆時針方向，見圖1)樣品12-大孔徑過濾器-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-10-Y11-小孔徑濾器-waste。在這個過濾操作中，樣品溶液沒有經(jīng)過反應(yīng)池3。這樣設(shè)計的出發(fā)點是在泵1高速運轉(zhuǎn)(7ml/min)下，流路內(nèi)溶液的快速流動不利于固定化抗體與抗原的結(jié)合，同時，如此大量的樣品溶液也容易在抗體膜上積累雜質(zhì)吸附物，從而影響抗體的活性。因此，采取過濾的方法將樣品溶液中的待檢測物首先快速富集在小孔徑濾膜過濾器上，然后再用少量PBS(如5ml)溶脫下來并緩速(如0.5ml/min)通過反應(yīng)池3，使樣品中的抗原與固定化抗體高效地結(jié)合。
這種操作方式的好處是，即使樣品溶液量很大，分析物濃度很低，也會得到快速而靈敏的檢測。
上述三種信號放大途徑可根據(jù)需要結(jié)合并用。
本實用新型檢測設(shè)備樣機能自動進樣、自動檢測及自動清洗流路。為了實現(xiàn)便攜，進行了直流(電池)和交流兩種電源設(shè)計。
設(shè)計檢測樣機的尺寸為43cm×40cm×35cm。該檢測器完成一次檢測任務(wù)的設(shè)計時間為30分鐘。
如圖13所示，其主要結(jié)構(gòu)和功能如下
1)試劑、樣品區(qū)此部分有7個試劑瓶，體積各為250ml，分別為樣品、PBS、洗液、酶結(jié)合物、去離子水、底物緩沖液(DB)以及用于配制底物液的底物緩沖液(DB)。它們通過流路管道與檢測系統(tǒng)相連。
2)流路檢測系統(tǒng)見圖1的設(shè)計結(jié)構(gòu)，所有的泵、閥以及檢測器等都布置在一個面板上面。對于多探頭的應(yīng)用，圖6和圖7的結(jié)構(gòu)分別設(shè)計在另兩個獨立面板上，在需要時替換圖1中的檢測器3。替換時，這二塊面板的支腳插于圖1面板上，并位于它上層。如圖14所示。
3)恒電位儀可以從市場上購買，如江蘇江分電分析儀器有限公司生產(chǎn)的小型CH-1型恒電位儀(2mA-1PA)。其作用是在檢測中設(shè)定工作電位，并用于測量電流-時間曲線。
4)可編程控制器可以從市場上購買，如采用松下電工生產(chǎn)的可編程控制器，型號為FP0，經(jīng)擴展后，可進行32路控制。在檢測中，可以對所有泵、閥等的開關(guān)、轉(zhuǎn)換進行自動控制。
5)電源可以從市場上購買，如朝陽電源廠生產(chǎn)的型號為4NIC-K48的產(chǎn)品?？商峁?2、24伏直流電，用于驅(qū)動所有的部件。
6)數(shù)據(jù)采集器主要完成數(shù)據(jù)的采集工作。同時外加通迅功能。
7)控制面板和顯示器可進行參數(shù)和指令的輸入操作。可進行聲光報警。
8)計算機接口可與電腦相連，用于測試中控制程序有關(guān)參數(shù)的修改和設(shè)定。
9)直流電源為滿足便攜和無交流電源的場合。
10)廢液瓶回收由8，10，11，15，18排出的廢液。體積為500ml。
本檢測器在使用上便于操作，操作者無需具備較深的專業(yè)知識，檢測過程中只需準備樣品和選擇檢測模式即可使用。
利用本實用新型監(jiān)測器進行檢測，設(shè)計了四種檢測模式，根據(jù)檢測目的的不同，可以選擇以下不同的檢測模式1.直接檢測模式這種檢測方式無信號放大過程，直接將底物通過敏感元件進行檢測。主要適用于含有較高濃度分析物的樣品。其實施過程見實施例3。
2.循環(huán)底物增強信號檢測模式這種檢測方式只是在直接檢測的基礎(chǔ)上增加了一個信號的放大操作，在圖1右側(cè)的“1-Y5-3-0-Y7-Y6-Y1-泵1”循環(huán)體系內(nèi)，延長底物液與敏感元件上AP作用的時間，提高催化水解產(chǎn)物的濃度，主要適用于含有待檢測物濃度低或量少的樣品。詳見實施例5。
3.樣本富集直接檢測模式這種檢測方式與直接檢測方式基本一樣，只是多了一個樣品的富集過程。這種方式適用于樣品量較大而待檢測物濃度又較低的樣品，將大量的樣品溶液通過敏感元件，其中的待檢測物就會較多地結(jié)合在敏感元件上。再一個是適用于樣品量較少的情況，通過反復(fù)循環(huán)，提高有限量樣品內(nèi)待檢測物的結(jié)合率。這兩種方式都可以實現(xiàn)放大檢測信號的作用。
4.樣本富集與循環(huán)底物增強信號檢測模式這種檢測方式是對前兩種放大檢測方式的結(jié)合運用，是一種雙重放大響應(yīng)信號的檢測過程。也就是在對樣品進行富集之后，再加上一個底物的循環(huán)過程。這種檢測方式適用于樣品內(nèi)待檢物的量極少的情況。
這四種檢測模式在使用時，可根據(jù)實際情況進行靈活選擇和綜合運用。
另外，每個檢測模式中應(yīng)有一個流路的檢測后清洗程序，每一個檢測循環(huán)進行一次。可分為兩種情況，一為連續(xù)檢測之間的流路清洗，避免上一次檢測中在流路管道內(nèi)的殘留物影響下一次的檢測。二為檢測任務(wù)結(jié)束后的徹底清洗，這些過程都由程序自動控制來實現(xiàn)。
本檢測系統(tǒng)的設(shè)計在應(yīng)用上具有靈活性，除了可以通過改變相關(guān)的操作來完成各種生物靶分子的檢測之外，還可以通過改變酶催化體系而用于其它分析物如含磷化學(xué)毒劑、含磷農(nóng)藥等的檢測，兼用作生物、化學(xué)分析物檢測的平臺。方法原理舉例將膽堿酯酶(acetylcholine esterase(AChE))固定于載體膜或玻璃珠上，用氯乙酰硫膽堿(acetylthiocholine chloride(ATCh))作為催化底物，在前者的催化下，后者水解生成硫膽堿(thiocholine)。待檢測的含磷化合物為膽堿酯酶的抑制劑，它濃度的大小和量的多少與膽堿酯酶催化活性的降低程度成正比，而膽堿酯酶活性的降低將導(dǎo)致水解產(chǎn)物硫膽堿的相應(yīng)減少，因此，含磷化合物與硫膽堿的生成量有直接的對應(yīng)關(guān)系。硫膽堿是一種電活性物質(zhì)，可直接用電化學(xué)方法檢測它在工作電極上的氧化電流變化[參考文獻見Sensors and Actuators，79(2001)48-57]，也可用間接的方法，即，電化學(xué)活性催化水解產(chǎn)物硫膽堿也可先經(jīng)K3[Fe(CN)6]氧化生成K4[Fe(CN)6]，然后再在電位+0.3V下檢測[Fe(CN)6]-4在工作電極上氧化生成[Fe(CN)6]-3的電流信號，，從而檢測含磷化合物的有無及多少[參考文獻Biosensors & Bioelectronics 15(2000)323-329]。檢測步驟與下述硫膽堿檢測方法基本相同，只是在其中的(1)和(3)中分別增加一個這樣的電化學(xué)活性底物的轉(zhuǎn)換過程。
用我們所設(shè)計的檢測系統(tǒng)進行有機磷毒劑和農(nóng)藥的檢測時，在操作上較微生物檢測更為簡便，所利用的檢測設(shè)備資源也可根據(jù)需要相應(yīng)地減少，或者說可以在檢測系統(tǒng)圖1的基礎(chǔ)上進行重新更為簡單的設(shè)計。由于是直接對底物進行催化，所以檢測步驟也大為減少，從而降低了成本，也加快了檢測的速度。
以直接電化學(xué)信號檢測過程為例，其檢測過程大致可分為三步1)標定一個本底催化檢測信號值，即在pH為7.5(此pH下膽堿酯酶活性最高)的pB(0.1M)液中加入一定濃度的底物，在經(jīng)過元件時，水解生成硫膽堿，后者在經(jīng)過電化學(xué)電極時在電位0.7V下被氧化，產(chǎn)生可以檢測的電流信號。2)用一定體積的含磷化合物樣品溶液通過此元件，此步將降低固定化酶的活性。3)重復(fù)步驟1)的過程，得到一個酶活性降低后的催化電流值，然后與步驟1)的電流值比較，根據(jù)電流變化的大小計算出磷化合物的濃度。
另外，通過液路和多探頭的合理分配，此檢測設(shè)備可同時具備用于微生物和化學(xué)毒劑檢測的功能。比如多探頭中的一部分接入固定化抗體元件，另一部分接入膽堿酯酶元件，液路中配齊兩檢測體系所需的各種溶液，就可完成雙重檢測任務(wù)。
另外，還可將DNA探針、PNA探針以及適配子(aptamer)共價結(jié)合在本實用新型的兩種固相載體其表面上，以用于相關(guān)目標微生物和靶分子的檢測。
本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下幾個方面的優(yōu)點1、本實用新型的檢測方法已經(jīng)實現(xiàn)儀器化和自動化。而現(xiàn)有技術(shù)只是搭建了一個簡單的半自動化的檢測裝置。
2、本實用新型在設(shè)計免疫電化學(xué)傳感器結(jié)構(gòu)時，將生物敏感元件與電化學(xué)檢測器分璃設(shè)計，如圖1所示，反應(yīng)池3(中間深色為生物敏感元件)與檢測器5(電化學(xué)電極)是彼此分離的。而現(xiàn)有技術(shù)中，二者是緊密結(jié)合在一起的。
分離式設(shè)計的好處是(1)可以對生物敏感元件單獨進行反應(yīng)、漂洗等操作，從而避免這些操作過程影響電極本身的穩(wěn)定性。反應(yīng)液中的某些成分有可能影響電極的性質(zhì)(如鈍化)，所以分離式設(shè)計可以避免這一點。
(2)要實現(xiàn)多探頭、多通道設(shè)計，如果繼續(xù)采用傳統(tǒng)生物傳感器中生物敏感元件與換能器(電極)緊密結(jié)合的設(shè)計方式，就必須有相同多的免疫電化學(xué)生物傳感器，比如八通道，就要有八個免疫電化學(xué)生物傳感器，八個檢測器上的八套電極引線(每套三根)也需要相應(yīng)匹配的恒電位儀，流路設(shè)計上也變得復(fù)雜，結(jié)果是成本升高，技術(shù)上難以實現(xiàn)。同時，生物敏感元件的更換變得困難。
而采用分離式設(shè)計，只需一個電化學(xué)檢測器，一個恒電位儀，就可滿足多通道檢測的要求。
本實用新型的這種設(shè)計帶來的好處是大大擴展和提高了檢測器的功能和性能，這種設(shè)計方法是對傳統(tǒng)生物傳感器概念的一個突破。
3.本實用新型優(yōu)化了用于檢測的酶催化體系?，F(xiàn)有技術(shù)采用的是辣根過氧化物酶(HRP)催化過氧化氫氧化碘化鈉生成碘分子的催化體系。由于在沒有HRP催化的情況下，過氧化氫也很快氧化碘化鈉生成碘分子，這套催化體系不穩(wěn)定。而本實用新型采用的AP催化體系中的α-萘酚磷酸鹽則相當穩(wěn)定。
4.本實用新型采用了放大信號的流路設(shè)計和操作方式，提高了檢測靈敏度，所以在檢測原始樣品方面更具優(yōu)勢。
5.本實用新型實現(xiàn)了底物樣品混合的自動化。
6.本實用新型實現(xiàn)了同時檢測多種分析物的設(shè)計。
7.本實用新型解決了檢測器中抗體活性問題(可更換的多探頭設(shè)計)。
8.本實用新型解決了現(xiàn)有技術(shù)中膜易于堵塞的問題。
9.本實用新型解決了流路中固相載體上非特異吸附的問題。
10.本實用新型檢測系統(tǒng)的設(shè)計在應(yīng)用上具有靈活性，除了可以通過改變相關(guān)的操作來完成各種生物靶分子的檢測之外，還可以通過改變酶催化體系而用于其它分析物如含磷化學(xué)毒劑、含磷農(nóng)藥等的檢測，兼用作生物、化學(xué)分析物檢測的平臺。
上述各種技術(shù)和方法的應(yīng)用，為微生物和其它目標分子檢測器的實用化奠定了基礎(chǔ)。
圖3是本實用新型檢測設(shè)備所采用的泵的實物圖；圖4是本實用新型檢測設(shè)備所采用的二通閥和三通閥的實物圖；圖5是各三通閥的安裝方位圖；圖6是本實用新型多探頭檢測設(shè)備的單通道四探頭設(shè)計圖；圖7是本實用新型多探頭檢測設(shè)備的雙通道多探頭設(shè)計圖；圖8是本實用新型檢測設(shè)備所用膜元件及其結(jié)構(gòu)分解圖；圖9是本實用新型檢測設(shè)備所用玻璃珠元件及其結(jié)構(gòu)分解圖；圖10是本實用新型檢測設(shè)備所用電化學(xué)電極檢測器的結(jié)構(gòu)示意圖；圖11是本實用新型檢測設(shè)備所用電化學(xué)電極檢測器的結(jié)構(gòu)分解圖；圖12是本實用新型檢測設(shè)備所用底物樣品池及其結(jié)構(gòu)分解圖；圖13是本實用新型檢測設(shè)備樣機效果簡圖；圖14是本實用新型檢測設(shè)備當中多探頭與單探頭的結(jié)構(gòu)位置關(guān)系圖。
具體實施方式
實施例1玻璃珠的炭疽芽孢抗體的固定化選取直徑為1mm的玻璃珠(中性)5g，裝入20mm的試管內(nèi)，加入分析純硝酸(68％)至正好沒過玻璃珠，在恒溫水浴中100℃下加熱1h，然后洗凈。此步的目的是為了洗凈玻璃珠的表面，同時也為了在玻璃珠表面生成大量的-OH基團。
將上述玻璃珠和10％的APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)溶液(pH調(diào)至4)加在-起，在70℃的水浴條件下，反應(yīng)3個小時。然后棄去溶液，將玻璃珠在110℃下干燥過夜。用去離子水洗凈后，再在80℃烘箱內(nèi)干燥過夜。此步在玻璃珠表面生成-O-Si-(CH2)3-NH2基團。
在玻璃珠表面生成-NH2后，采用戊二醛共價偶聯(lián)法偶聯(lián)抗體。戊二醛的濃度為2.5％(0.03MPBS溶液，pH7.0)，室溫下與玻璃珠反應(yīng)1h，在溶液中加入NaCNBH3(10mg/ml)還原西佛堿(Schiff base)-NH1＝CH1-(CH2)3-CHO， 生成飽和的-NH2-CH2-(CH2)3-CHO，而醛基不被還原。
配PEG-ab(兩端帶有3-氨基丙基的聚乙二醇，平均分子量3350)PBS溶液為30mg/10ml，加入漂洗后的上述玻璃珠，室溫下反應(yīng)1h，再用NaCNBH3還原。漂洗后，再與戊二醛反應(yīng)，條件同前。然后再用NaCNBH3還原。此步引入連接臂(Linker，即PEG-ab)，提高固定化抗體與樣品中待檢測抗原結(jié)合的靈活性和有效性。
上述玻璃珠漂洗后，加入到含有兔抗炭疽芽孢IgG的溶液中(0.5ml的PBS中加入15μl濃度為23mg/ml的兔抗炭疽芽孢IgG溶液而得)，室溫下反應(yīng)1h，同樣用NaCNBH3還原，漂洗后，放于4℃下保存。
上述所用的linker可以有很多種，如采用半氧化狀態(tài)的葡聚糖(分子量約為4000)，在這個分子上有豐富的醛基，可直接與抗體和玻璃珠的胺基結(jié)合，然后再用還原劑(NaBH4)還原，從而使抗體和玻璃珠共價偶聯(lián)。
在抗體的固定化過程中，IgG的純度和效價應(yīng)足夠高，這樣才能保證固定化抗體的活性。實施例2漂洗液去除非特異吸附的驗證實驗首先，取一張空白尼龍膜(孔徑5微米)，放入圖5的膜元件中，然后將此元件接在蠕動泵流路管的一端。用新買來的山羊抗兔IGg的堿性磷酸酶結(jié)合物配制樣品，取5微升加入2ml的PBS(0.1M，pH＝7.4，NaCl0.15M)中，然后在泵的作用下，將此溶液以流速為1ml/min的速度全部流過膜片，進完此樣品后，再用PB液(pH7.2，0.03M)以流速5ml/min的速度進行漂洗5分鐘，結(jié)果表明，溶液中的山羊抗兔IGg的堿性磷酸酶結(jié)合物幾乎全部吸附在膜的表面。證明方法是在蠕動泵流路的出液口端以每30秒一次的頻率進行采集樣品，然后與取出的膜片一起分別加入底物PNPP，進行顯色反應(yīng)，結(jié)果只有膜片很快顯示黃色，而其它幾個液體樣品均不顯色。說明存在嚴重的非特異吸附，同時用PB液無法漂洗掉非特異吸附的酶結(jié)合物。
然后，證明三氯乙酸漂洗液的有效性。重復(fù)上面的實驗過程，各條件都不變，只改變PB液為三氯乙酸漂洗液(0.6M，pH3.5)，用它洗3分鐘后，再用PB(pH7.2)液洗3分鐘(此步的目的是使膜片所處的環(huán)境回到中性的緩沖溶液狀態(tài)，以利于酶活性的恢復(fù)。在pH＝3.5下，酶活性受到擬制)。對取出的膜片進行顯色，結(jié)果表明非特異吸附去除得很徹底，在2個小時沒有觀察到的黃色出現(xiàn)。
進一步進行如下實驗，以說明三氯乙酸漂洗液沒有使酶活性喪失以及沒有使檢測中形成的固定化抗體-抗原-抗體夾心結(jié)構(gòu)破壞。先在膜的表面將抗體以共價方式結(jié)合上去，然后與含有芽孢的樣品在流路中反應(yīng)，再與酶結(jié)合物反應(yīng)，用三氯乙酸漂洗液漂洗后，經(jīng)PNPP顯色，在十分鐘時可觀察到明顯的黃色。
由于三氯乙酸漂洗液是在pH為3-3.5較低的情況下達到較好的漂洗效果的(pH值高于4時，漂洗效果不好)，本實用新型進一步進行了如下對比實驗，以說明pH值不是去除非特異吸附的主要原因，先用鹽酸直接將上述的PB液(pH7.2，0.03M)調(diào)至pH值為3.5，再用檸檬酸和檸檬酸鈉(濃度為0.6M)調(diào)配成一個pH值為3-3.5的緩沖液，然后用這兩個溶液分別替代上述第一步中的PB并重復(fù)漂洗實驗，結(jié)果顯示二者皆無法有效去除非特異吸附，取出的膜片在底物PNPP中都很快顯色。
因此，三氯乙酸漂洗液的良好漂洗效果應(yīng)該是在此pH值下三氯乙酸分子與非特異吸附酶結(jié)合物(為一種蛋白)發(fā)生了特定的作用所致，可能主要是改變了非特異吸附蛋白的帶電性質(zhì)所致。實施例3炭疽芽孢的單探頭直接檢測如圖1所示，反應(yīng)池(敏感元件)3中有一針對炭疽芽孢的抗體膜(或玻璃珠元件)，在檢測開始之前，先由泵2系統(tǒng)在檢測開始之前按泵1進行檢測工作時相同的流速標定底物溶液的本底電流值，標定時間為檢測前的一分鐘，標定流路為20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)，泵1停，泵2檢測馬上開始。將待檢樣品12由泵1輸送通過反應(yīng)池3，如果樣品中有炭疽芽孢存在，則與固定化抗體生成抗體-芽孢結(jié)合物，并就地結(jié)合在膜(或玻璃珠)的表面。經(jīng)漂洗后，再由泵1將酶結(jié)合物14(含有堿性磷酸酶AP標記的芽孢抗體反應(yīng)液)輸送通過反應(yīng)池3，與膜上的抗體-芽孢結(jié)合物反應(yīng)，生成抗體-芽孢-抗體-AP結(jié)合物。然后，用漂洗液6去除可能存在的非特異吸附。進一步由泵1將底物α-萘酚磷酸鹽溶液輸送通過反應(yīng)池3，如果有芽孢存在，則形成的抗體-芽孢-抗體AP結(jié)合物上的AP催化α-萘酚磷酸鹽水解，產(chǎn)生α-萘酚，進一步通過電化學(xué)檢測器5，電化學(xué)監(jiān)測器的工作電位為+350mv，α-萘酚在此電位下被氧化，并產(chǎn)生相應(yīng)的電流，生成檢測信號。記錄儀等開始記錄并處理數(shù)據(jù)。實施例4單探頭循環(huán)底物增強信號模式檢測本實施例中帶下劃線‘—’的部分為流路中導(dǎo)通的標志。以下所有步驟中，Waste表示廢液的出口方向，“底緩”代表底物緩沖液。泵正轉(zhuǎn)方向在圖1中對應(yīng)向上。反之亦然。如圖1所示，按照下述步驟順序進行檢測1)開機預(yù)熱1分鐘。此時流路內(nèi)有去離子水(上次使用后所注入)。
去離子水的作用是保持流路內(nèi)無干擾性電解質(zhì)，同時也是為了儀器在儲存過程中免于腐蝕。
2)泵1工作并反轉(zhuǎn)，PBS注入流路系統(tǒng)。
PBS流經(jīng)路線PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-0-I5-Y9-Y10-Y11-wastePBS的作用是使流路內(nèi)處于有利于抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境。
3)泵1工作并正轉(zhuǎn)，菌樣流經(jīng)路線waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-菌樣樣品內(nèi)待檢測物(如芽孢)與固定化抗體發(fā)生結(jié)合作用的過程。
4)PBS漂洗，泵1反轉(zhuǎn)。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste5)進抗體酶結(jié)合物(Conjugate)。泵1正轉(zhuǎn)，路線為waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-conjugate酶標記抗(Ab-AP)與固定化載體上Ab-Ag發(fā)生結(jié)合作用的過程。
6)用漂洗液漂洗，泵反轉(zhuǎn)泵1反轉(zhuǎn)，洗液流經(jīng)路線洗液-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步去除可能的非待異吸附。
7)PBS漂洗，泵1反轉(zhuǎn)。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步恢復(fù)有利于標記酶催化活性的溶液環(huán)境，因為在前面的漂洗液中酶的活性受到擬制。
8)進底緩排氣泡泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-waste9)進底緩泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-Y12-18waste10)進底緩泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-Y7-Y6-waste11)排可能存在的氣泡泵1正轉(zhuǎn)，底緩-Y9-I5-3-Y5-1-Y1-Y15-Y2-Y3-waste9)、10)11)、12)幾步的操作的安排是為了清除流路內(nèi)前幾步反應(yīng)時留下的干擾物，同時使其處于有利于酶催化底物水解的底物緩沖液(DB，pH9.8)環(huán)境。
12)泵反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-waste
此步操作是進底物溶液。同時將由進底物時帶來的氣泡從Y5處排出，以避免進入反應(yīng)池。
13)泵反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste目的是為了使Y7-o-3-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環(huán)內(nèi)充滿底物溶液。
14)泵正轉(zhuǎn)，Y7-o-3-Y5-1-Y1-Y6-Y7內(nèi)底物液循環(huán)。
15)檢測泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作(泵2體系在泵1體系進行工作時，也在進行底物樣品的混合工作，并且在檢測開始之前進行了本底的標定)底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-3-Y12-5-18waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數(shù)據(jù)，如有陽性檢測結(jié)果，則進行報警。
在上述各步中，流速和時間是根據(jù)需要進行設(shè)定和變化的。實施例5多探頭循環(huán)底物增強信號模式檢測如圖1和圖6所示，待檢樣品中可能有ABCD四種細菌中的一種或幾種，圖6中四個元件上分別固定化有相應(yīng)的四種抗體。每一個元件的檢測之前有一個泵2系統(tǒng)標定本底的過程，即由泵2系統(tǒng)在檢測開始之前按泵1進行檢測工作時相同的流速標定一個底物溶液的本底電流值，標定時間為檢測前的一分鐘，標定流路為20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)。然后按照下述步驟進行檢測，其中帶下劃線‘—’的部分為流路中導(dǎo)通的標志，以下所有步驟中，Waste表示廢液的出口方向，“底緩”代表底物緩沖液，泵正轉(zhuǎn)方向在圖1中對應(yīng)向上，反之亦然。在1)-11)步驟中，-(25-26)-代表溶液通過圖6中全部元件，即-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-。檢測步驟如下1)開機預(yù)熱1分鐘。此時流路內(nèi)有去離子水(上次使用后所注入)。
2)泵1工作并反轉(zhuǎn)，PBS注入流路系統(tǒng)。
PBS流經(jīng)路線PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste3)泵1工作并正轉(zhuǎn)，菌樣流經(jīng)路線waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-菌樣4)PBS漂洗，泵1反轉(zhuǎn)。
PRS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-T5-Y9-Y10-Y11-waste5)進Conjugate。泵1正轉(zhuǎn)，路線為waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-conjugate
6)用漂洗液漂洗，泵1反轉(zhuǎn)，洗液流經(jīng)路線洗液-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste7)PBS漂洗，泵1反轉(zhuǎn)。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste8)進底緩排氣泡泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-waste9)進底緩泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y12-waste10)進底緩泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste11)排氣泡泵1正轉(zhuǎn)，底緩-Y9-I5-(25-26)-Y5-1-Y1-Y15-Y2-Y3-waste上面的1)-11)步與實施例1所述的單探頭循環(huán)底物增強信號檢測模式檢測中的對應(yīng)步驟完全一致。不同是用多探頭替代了單探頭，而且圖6中的元件21、22、23、24在以上的1)-11)步驟中彼此相通(圖6中流路導(dǎo)通的各部分為25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-)，并進行了完全相同的反應(yīng)和處理。經(jīng)過上面的1)-11)步的過程，如果樣品中有ABCD中的一種或幾種細菌，則應(yīng)該在相對應(yīng)的抗體元件表面形成了Ab-Ag-Ab-AP結(jié)合物，以下則是對不同元件的分別檢測元件21檢測有反應(yīng)，則報警。下述12)一15)步驟當中的-(21)-代表21檢測時的流路，在圖6中，對應(yīng)通路為-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-件21的檢測步驟如下12)泵反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-waste此步是在反應(yīng)池之前排除可能存在的氣泡。
13)泵1反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步使流路管道內(nèi)充滿均勻的底物溶液。
14)泵正轉(zhuǎn)，Y7-o-(21)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環(huán)，提高催化水解產(chǎn)物的濃度。
15)檢測泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-Y12-5-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數(shù)據(jù)。
元件22檢測下述16)-20)的檢測步驟當中，-(21)-代表對上-次檢測流路的清洗，其對應(yīng)于圖6的流路是-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路順序在圖6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(22)-代表元件22的檢測通路，圖6中對應(yīng)于-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-，元件22的檢測步驟如下16)清洗上一次檢測的流路泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作。
底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-Y12-waste17)泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste此步是為了漂洗圖1中的0-Y7部分，以保證流路內(nèi)無殘留的干擾物，如上一次水解產(chǎn)物等。
18)泵1反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(22)-I5-Y9-Y10-Y11-waste19)泵正轉(zhuǎn)，Y7-o-(22)-Y5-Y1-Y6-Y7循環(huán)，20)檢測泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(22)-Y12-5-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數(shù)據(jù)。
元件23檢測下述21)-26)的檢測步驟當中，-(22)-代表對上一次檢測流路的清洗，其對應(yīng)于圖6的流路是-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路順序在圖6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；(23)代表元件23的檢測通路，圖6中對應(yīng)的流路連通部分為-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-。元件23的檢測步驟如下21)清洗流路泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(22)-Y12-5-waste23)泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste24)泵1反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(23)-I5-Y9-Y10-Y11-waste25)泵正轉(zhuǎn)，Y7-o-(23)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環(huán)。
26)檢測泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(23)-Y12-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數(shù)據(jù)。
元件24檢測下述27)-33)的檢測步驟當中，-(23)-代表對上一次檢測流路的清洗，其對應(yīng)于圖6的流路是-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路順序在圖6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(24)-代表元件24的檢測通路，圖6中對應(yīng)的流路連通部分為-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-Y22-31-24-Y23-26-。元件24的檢測步驟如下27)清洗流路泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(23)-Y12-waste28)泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste29)泵1反轉(zhuǎn)，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(24)-I5-Y9-Y10-Y11-waste30)泵正轉(zhuǎn)，Y7-o-(24)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環(huán)，31)檢測泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(24)-Y12-5-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數(shù)據(jù)。
32)清洗流路泵1反轉(zhuǎn)，泵2停止工作，底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(24)-Y12-5-waste33)泵1反轉(zhuǎn)，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(24)-Y7-Y6-waste檢測結(jié)束。
權(quán)利要求1.一種檢測目標微生物和靶分子的檢測設(shè)備，其特征在于該設(shè)備包括兩個微型泵(1、2)、一個生物敏感元件(3)、一個樣品池(4)、一個電化學(xué)檢測器(5)、多個三通閥(Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15)、一個二通閥(I5)和一個四通閥(0)，生物敏感元件(3)的一端通過一個三通閥(Y5)與泵(1)相連，泵(1)的另一端與三通閥(Y1)相連，此三通閥(Y1)的其中一端連續(xù)連接四個三通閥(Y15、Y2、Y3、Y4)，為不同液體提供出入口，生物敏感元件(3)的另一端與一個四通閥(0)相連，該四通閥(0)的一端通過兩個三通閥(Y6、Y7)與泵(1)另一端的三通閥(Y1)相連，形成一個回路，上述四通閥(0)的另外兩端分別連接一個二通閥(I5)和一個三通閥(Y12)，此三通閥(Y12)的一端與電化學(xué)檢測器(5)相連，另一端通過一個三通閥(Y14)與泵(2)相連，泵(2)的另一端與一個三通閥(Y13)相連，此三通閥(Y13)的另外兩個端各自與底物緩沖液(19、20)相連，上述泵(2)另一端的三通閥(Y14)與樣品池(4)相連，樣品池(4)的另一端與底物緩沖液(20)相連，形成一個循環(huán)流路，上述二通閥(I5)連續(xù)連接三個三通閥(Y9、Y10、Y11)，以提供多個液體出入口，其中出入口(10)與Y10和Y11之間的小三通相連，通過三通(Y11)與出入口(11)相通將廢液排出，同時通過與12相連形成一個不經(jīng)過反應(yīng)池的泵1所在的第二個回路，三通閥(0)相連的四通閥(Y7)的一端再連接一個三通閥(Y8)，以提供兩個液體出入口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其特征在于所說的電化學(xué)檢測器(5)由工作電極(W)、參比電極(R)和輔助電極(C)組成，形成一個流動電解質(zhì)的電解池。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其特征在于生物敏感元件(3)被四探頭或八探頭或多探頭檢測器所代替，多探頭數(shù)量的增加通過在四探頭或八探頭檢測器中加入一個或幾個免疫元件單元而實現(xiàn)，其中四探頭檢測器檢測器的一端(25)與三通閥(Y5)相連接，另一端(26)與四通閥(0)相連接，以替換生物敏感元件(3)，該四探頭檢測器由四個免疫檢測元件(21、22、23、24)和多個三通閥(Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23)組成，其中三通閥(Y16)與接口(25)相連的左端為公共端，另外兩端分別與免疫檢測元件(21)和三通閥(Y18)相連接，四個免疫檢測元件(21、22、23、24)之間各以小三通(29、30、31)相連接，其中免疫檢測元件(24)通過三通閥(Y23)與檢測器接口(26)相連接，此三通閥(Y23)的另一端與一個小三通(32)連接，而小三通(32)分別與另外兩個三通閥(Y21、Y22)連接，其中一個三通閥(Y22)與兩個免疫檢測元件(24、23)之間的小三通31連接，另一個三通閥(Y21)與三通(28)連接，三通(28)的另外兩個端口各自連接一個三通閥(Y19、Y20)，這兩個三通閥(Y19、Y20)相互連接，其中一個三通閥(Y20)與兩個免疫檢測元件(22、23)之間的小三通(30)連接，另一個三通閥(Y19)與三通閥(27)連接，三通(27)的另外兩個端口各自連接一個三通閥(Y18、Y17)，這兩個三通閥(Y18、Y17)相互連接，其中一個三通閥(Y17)與兩個免疫檢測元件(21、22)之間的小三通(29)連接，另一個三通閥(Y18)與三通閥(Y16)連接；八探頭檢測器的兩個接(53、54)分別與兩個三通閥(Y40、Y41)連接，而這兩個三通閥(Y40、Y41)的另外兩端各連接兩個前面所述的四探頭檢測器，上述的接口(53、54)分別與檢測設(shè)備的三通閥(Y5)和四通閥(0)相連接，以替換生物敏感元件(3)，上述四探頭檢測器的四個免疫檢測元件(21、22、23、24)或八探頭檢測器的各個免疫檢測元件是可更換的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其特征在于所說的生物敏感元件有兩種膜元件或玻璃珠元件，兩種元件的內(nèi)腔都呈雙錐形，以保持中間的膜和玻璃珠在流路內(nèi)與溶液有較大的接觸面積，膜元件由帶有螺紋的有機玻璃罩(55)、有錐形孔的有機玻璃柱(56)、抗體膜(57)和底座(58)組成，抗體膜(57)放在內(nèi)壁有一圈平臺的底座(58)內(nèi)，有機玻璃柱(56)壓在膜的周邊上，有機玻璃罩(55)擰在有螺紋的底座(58)上，使有機玻璃柱(56)壓緊中間的膜(57)；對于玻璃珠元件，其部件底座(62)和帶有螺紋的有機玻璃罩(59)內(nèi)都有一個內(nèi)壁平臺，當下面的圓形不銹鋼網(wǎng)(60)放在底座(62)的平臺上后，放入圓形孔柱(61)，其下沿壓在底下的鋼網(wǎng)周邊部分，然后在圓形孔柱(61)的空腔內(nèi)裝入玻璃珠(63)，上面蓋上第二個鋼網(wǎng)(60)，接下來蓋上有機玻璃罩(59)，有機玻璃罩(59)的螺紋擰到底座(62)的螺紋上，機玻璃罩(59)的平臺可產(chǎn)生一個向下的壓力，使各部件間相互壓緊在一起，兩種元件的設(shè)計外形尺寸一致，可以在流路的多探頭設(shè)計中互換。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測目標微生物和靶分子的檢測設(shè)備，檢測設(shè)備部件包括兩個微型泵、一個生物敏感元件、一個樣品池、一個電化學(xué)檢測器、多個三通閥、一個二通閥和一個四通閥，并通過一定的連接關(guān)系相連。本實用新型可以對檢測樣品直接進行檢測，無需培養(yǎng)富集，具有檢測快速、靈敏和自動化操作的特點。通過多通道、多探頭設(shè)計，它可同時對多種目標分析物進行檢測。
文檔編號G01N27/28GK2593195SQ0320091
公開日2003年12月17日 申請日期2003年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月14日
發(fā)明者紀軍, 楊瑞馥, 王津, 郭兆彪, 周蕾 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所