專利名稱：一種區(qū)別組織化生與癌變或癌前病變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種區(qū)別過度表達(dá)p16INK4a的組織化生與過度表達(dá)p16INK4a的癌變或癌前病變的方法，該方法是在細(xì)胞學(xué)檢測操作中，通過確定生物樣本中高危的人乳頭癌病毒(HPV)編碼的基因產(chǎn)物如HPVE2或E7分子的水平進(jìn)行。因而該方法能減少以p16INK4a為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)檢測操作中的肛門和生殖器病變探查的假陽性結(jié)果。
背景技術(shù)：
在生物樣本中過度表達(dá)的p16INK4a已在探查肛門和生殖器病變?nèi)缱訉m頸癌的過程中被證明是一個有用的標(biāo)記(見WO00/01845；Klaes et al.，Int.J.Cancer92，276-284(2001))。這種基于p16INK4a特異性免疫化學(xué)染色的方法可以在組織切片和細(xì)胞學(xué)樣本中靈敏地、特異性地識別異常細(xì)胞。
在對組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測中，用p16INK4a特異性抗體為介質(zhì)的染色操作能將腫瘤細(xì)胞染色。因此，以肛門和生殖器病變中細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子標(biāo)記特征為基礎(chǔ)的染色反應(yīng)能夠支持癌病變的組織學(xué)診斷。在這些操作中，診斷是否是腫瘤細(xì)胞，并不僅僅只依靠p16INK4a的特異性染色，還要依靠組織學(xué)信息。
這是因為在大約30％的樣本中，組織化生細(xì)胞顯示出一定程度的與p16INK4a特異性抗體的免疫反應(yīng)性，因此，在操作過程中組織化生細(xì)胞也會被染色。但是由組織化生細(xì)胞產(chǎn)生的染色圖案不同于癌病變細(xì)胞產(chǎn)生的圖案。組織化生細(xì)胞產(chǎn)生斑駁或集中的染色圖案，而癌病變細(xì)胞產(chǎn)生擴(kuò)散的染色圖案。此外，組織化生細(xì)胞的染色強(qiáng)度遠(yuǎn)弱于癌病變細(xì)胞的染色強(qiáng)度。
但癌變早期發(fā)現(xiàn)的篩查試驗，其普通方法不使用以組織學(xué)為基礎(chǔ)的檢測，而更依賴于細(xì)胞學(xué)檢測操作。特別在一些情況下，當(dāng)沒有關(guān)于組織結(jié)構(gòu)方面的組織學(xué)信息可利用時，諸如在細(xì)胞學(xué)檢測中，單獨(dú)檢測過度表達(dá)的p16INK4a可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。原因是組織化生細(xì)胞表達(dá)的p16INK4a可能處于一個可檢測的較高水平，組織學(xué)的染色圖案不能將其區(qū)別開來。
在出現(xiàn)發(fā)育異常的過程中顯示出過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞百分比逐漸增加。因此，在癌變或癌變前的階段，樣本中只存在有限數(shù)量的癌變或癌變前細(xì)胞，p16INK4a的免疫反應(yīng)性可能是很微弱的。這樣微弱的免疫反應(yīng)性可能和組織化生細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)性的水平大致一樣。在發(fā)育異常的稍后階段，p16INK4a的總免疫反應(yīng)性增強(qiáng)了，因此，即使在細(xì)胞學(xué)檢測程序中，也能很容易的將癌病變與組織化生區(qū)別開來。這可能導(dǎo)致這樣的情況，表達(dá)p16INK4a的組織化生細(xì)胞的存在可能會與癌變細(xì)胞的存在相混淆，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
特別在進(jìn)行有價值的癌變早期發(fā)現(xiàn)的篩查試驗中，這種情況令人相當(dāng)不愉快。這是特別真實(shí)的，當(dāng)這種基于p16INK4a的診斷被證明是有價值的組織學(xué)檢測時，將其運(yùn)用于以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)的篩查程序，能夠提高目前已有的檢測過程。
為了減少細(xì)胞學(xué)檢測操作中出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，從而更進(jìn)一步地提高以p16INK4a為介質(zhì)的肛門和生殖器病變診斷方法的精確度，一種能區(qū)別組織化生與癌及異常病變的方法是令人期待的。該領(lǐng)域的這個問題在癌變的早期階段特別明顯，當(dāng)顯示出過度表達(dá)p16INK4a現(xiàn)象的細(xì)胞的百分比保持在某一水平時，可能與組織化生細(xì)胞的擴(kuò)散增生所引起的正常的p16INK4a過度表達(dá)的水平相混淆。解決當(dāng)前問題的有效方法就是加入能夠表示肛門和生殖道早期癌變特征的參數(shù)。任何在腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)的，已證實(shí)作為高度發(fā)育異常的診斷試劑盒的發(fā)育異?；?和癌變的特征并不適合按照本發(fā)明得到的方法，這樣的特征應(yīng)僅限于腫瘤發(fā)生早期出現(xiàn)的特征。
根據(jù)本發(fā)明要求的具體實(shí)施方案提供了一種區(qū)別組織化生與癌變和癌前病變的方法。
為了幫助在基于p16INK4a過度表達(dá)的試驗操作中區(qū)別組織化生和癌病變，需要一個標(biāo)記分子，該分子在癌變和/或癌變前的組織和細(xì)胞中表達(dá)，而在組織化生細(xì)胞中不表達(dá)。
HPV的E2分子在低程度的子宮頸癌前病變(CIN)中是被特別表達(dá)的，并且其表達(dá)隨著CIN程度的增加而減少(Stevenson et al.，J.Gen.Virol.，81，1825-32(2000))。在大部分侵潤性腫瘤中檢測不到E2蛋白質(zhì)分子的表達(dá)。這可能是因為在HPV的DNA整合到寄主基因組過程中，部分E2基因會丟失。因此，對于持續(xù)的HPV感染，因HPV的DNA已經(jīng)被整合，就只能檢測到很少或檢測不到E2分子的表達(dá)。
由于這些事實(shí)，E2蛋白被證實(shí)是高危HPV感染引起早期病變的一個標(biāo)記。與之相反，p16INK4a是一個即使在肛門和生殖道病變的早期階段也會過度表達(dá)的標(biāo)記，且表達(dá)的程度隨著發(fā)育異常的病變程度而增加。事實(shí)上，E2分子在癌變早期的特殊表達(dá)使它特別適用于癌變的早期診斷方法。在受試細(xì)胞中的病毒大量拷貝前，E2蛋白質(zhì)分子在HPV感染早期的高表達(dá)就使它能識別發(fā)現(xiàn)已被感染的細(xì)胞。
基因產(chǎn)物L(fēng)1和L2也能用于依照本發(fā)明的方法，這是由于在病毒感染的早期，基因整合發(fā)生之前，它們也有突出的高表達(dá)水平。這些基因產(chǎn)物的表達(dá)也隨著HPV的持續(xù)感染而減少。
發(fā)明人現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表達(dá)高危險亞型HPV的基因產(chǎn)物如HPV的E2分子適合于區(qū)分通過p16INK4a特異性免疫化學(xué)染色探測到的早期癌變或發(fā)育異常病變與組織化生，即使這樣的組織化生也含有細(xì)胞學(xué)檢測操作中與p16INK4a發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
按照本發(fā)明，細(xì)胞表達(dá)的其它HPV編碼的mRNA或多肽基因產(chǎn)物，只要在癌變期或癌變前期的表達(dá)水平是可檢測到的，也可以用于區(qū)分癌變或/和癌前病變與組織化生在過度表達(dá)p16INK4a上的不同。這樣的HPV編碼的基因產(chǎn)物的例子包括HPV E6、E7、L1、L2的蛋白質(zhì)或mRNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種在對生物樣本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測操作時區(qū)別癌變、癌變前和/或發(fā)育異常病變與包含過度表達(dá)p16INK4a細(xì)胞的組織化生的方法，該方法的基礎(chǔ)是確定所述樣本中是否有表達(dá)高危險亞型HPV基因產(chǎn)物的細(xì)胞存在。用于這個方法的HPV基因產(chǎn)物在此是指這樣一些基因產(chǎn)物，它們特別是在癌變早期階段和癌前病變中能高表達(dá)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，HPV的E2蛋白質(zhì)或mRNA就可以作為區(qū)別樣本中的組織化生與早期癌變及癌前病變的標(biāo)記。此外，按照在此公開的本發(fā)明，HPV的E6、E7、L1或L2蛋白質(zhì)分子和/或mRNA分子也已證明適用于進(jìn)行這種區(qū)別。
用在本發(fā)明上下文中的區(qū)別方法包括樣本是否被一種或另外一種方法分類的評估。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，區(qū)別方法是屬于評價一個組織或成分是癌變或是組織化生。因此，用在此處的區(qū)別方法是對樣本中細(xì)胞生長特性的判斷。
按照本發(fā)明得到的區(qū)別方法，其基礎(chǔ)是確定在所述的樣本中是否有表達(dá)高危HPV基因產(chǎn)物的細(xì)胞存在和是否有過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞存在。表達(dá)高危HPV基因產(chǎn)物如E2的細(xì)胞不必與過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞相同，盡管這兩種標(biāo)記分子的表達(dá)可以發(fā)生在相同的細(xì)胞內(nèi)。
因此，按照本發(fā)明，樣本中是否同時存在表達(dá)E2基因產(chǎn)物的細(xì)胞和過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞(其它細(xì)胞或共同表達(dá)兩種標(biāo)記的相同細(xì)胞)就可以用來區(qū)別癌變或癌前病變與組織化生。
用在本發(fā)明文本中的HPV編碼的基因產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)是任何由HPV基因組的一個基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或任何這樣的mRNA翻譯的多肽。按照本發(fā)明的方法，適合的HPV編碼的基因產(chǎn)物是由E6、E7、L1和L2基因編碼的。本發(fā)明一個特別優(yōu)選的HPV基因產(chǎn)物是由HPV的E2基因編碼的。
在此，HPV是指人乳頭狀瘤病毒。用在此處的HPV應(yīng)包含任何高危險HPV亞型。本發(fā)明優(yōu)選的HPV亞型是與癌相關(guān)的HPV亞型，如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56和58。特別優(yōu)選的HPV高危險亞型是HPV16、18、39或HPV45。鑒別HPV亞型的方法包含任何適合于確定存在于生物樣本中的特定HPV亞型的方法。
根據(jù)本發(fā)明，檢測HPV編碼的基因產(chǎn)物的水平的方法包含任何適用于在生物樣本中檢測非常微量的特定生物分子的方法。按照本發(fā)明的檢測反應(yīng)可以用于檢測核酸或者多肽的水平。
HPV基因產(chǎn)物可以用特異性識別這些分子的試劑來檢測。檢測HPV基因產(chǎn)物的反應(yīng)可以包括一個或更多的與檢測試劑發(fā)生的反應(yīng)，這些檢測試劑或者識別初始的標(biāo)記分子或者識別用來識別其它分子的前體分子。
檢測反應(yīng)更進(jìn)一步地包括一個報告反應(yīng)，以指示HPV基因產(chǎn)物存在與否，和/或存在水平。報告反應(yīng)可以如一個產(chǎn)生一種有色的化合物的反應(yīng)，一個生物體發(fā)光反應(yīng)，熒光反應(yīng)，普通的輻射發(fā)射反應(yīng)等等。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，不同的標(biāo)記分子采用產(chǎn)生不同的報告信號的試劑來識別，因此能辨別出信號所指示的標(biāo)記分子。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在檢測p16INK4a的過度表達(dá)的同時也檢測出高危HPV基因產(chǎn)物表達(dá)。在這種情況下，報告反應(yīng)可以使用例如不同的熒光標(biāo)記來區(qū)分不同的待檢測分子。
按照本發(fā)明，適用的檢測反應(yīng)可以是印跡技術(shù)，如西方印跡，南方印跡，北方印跡。印跡技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，可以操作如電轉(zhuǎn)印跡，半干印跡，真空印跡或點(diǎn)印跡。擴(kuò)增反應(yīng)也可用在檢測如核酸分子這樣的檢測反應(yīng)中。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測HPV基因產(chǎn)物水平的方法是檢測樣本中各自基因產(chǎn)物的mRNA或它的片段的水平。檢測核酸分子的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。核酸分子的檢測過程就像進(jìn)行一個結(jié)合反應(yīng)，將待測分子結(jié)合到互補(bǔ)的核酸探針上，或能特異性結(jié)合到核酸上的蛋白質(zhì)或任何其它能特異性識別和結(jié)合到所說的核酸分子的整體。
在檢測染色反應(yīng)過程中這個方法能在體外進(jìn)行，也能直接在原位進(jìn)行。按照本發(fā)明的方法，在樣本中檢測HPV的mRNA的另一個方法是核酸的擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)以定量的方式如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，是實(shí)時反轉(zhuǎn)錄PCR，可以用來量化腫瘤樣本中的HPV基因產(chǎn)物的mRNA的水平。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測HPV基因產(chǎn)物水平是通過確定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來進(jìn)行的。以蛋白質(zhì)水平來確定HPV基因產(chǎn)物例如進(jìn)行這樣一個反應(yīng)，該反應(yīng)中包含了能特異性結(jié)合待檢測的特定HPV的多肽的試劑。
這些結(jié)合劑能用在許多不同的檢測技術(shù)中，如西方印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫沉淀法。常用的基于檢測的多肽結(jié)合劑能在例如免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)中的體外或直接在原位上進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。按照本發(fā)明，可以使用任何能在生物樣本中確定特定多肽數(shù)量的其它方法。
本發(fā)明上下文中所用的結(jié)合試劑無論是用于檢測HPV的多肽或是p16INK4a的多肽水平都可包括抗體、抗原結(jié)合片段、雙功能混和抗體、包含最小抗原結(jié)合抗原決定簇的肽聚模擬物等。
一個抗體或抗原結(jié)合劑如果在可測的水平上與在此所公開的蛋白質(zhì)反應(yīng)，而且與其它蛋白質(zhì)不發(fā)生明顯的反應(yīng)，這就是具有所述的反應(yīng)特異性。按照本發(fā)明，抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。當(dāng)用在此處時，術(shù)語抗體或單克隆抗體意味著包括完整的分子及抗體片段。此外，本發(fā)明的抗體包括嵌合、單鏈和人源性抗體。
按照本發(fā)明，結(jié)合劑可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。聯(lián)合使用結(jié)合劑有可能獲得更高的靈敏度。優(yōu)選的抗體是指由本質(zhì)上不同的抗原特異性的單克隆抗體混和組成，以及獨(dú)特的單克隆抗體制劑。
單克隆抗體由包含了本發(fā)明使用各種在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)產(chǎn)生的多肽片段的抗原制成；如見Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。在這樣的一種技術(shù)中，首先將一種含有抗原多肽或合成部分的免疫原注入各種哺乳動物中(如，小鼠、大鼠、兔子、綿羊或山羊)中。在這一步，本發(fā)明的多肽可以無需修飾就用作免疫原?；蛘?，特別對相當(dāng)短的多肽，如果多肽連接一個載體蛋白，如牛血清白蛋白或匙孔嘁血藍(lán)蛋白，可引起更好的免疫反應(yīng)。將免疫原注入動物宿主后，最好根據(jù)預(yù)定安排進(jìn)行一次或多次的強(qiáng)化免疫，然后對動物定期采血。從該抗血清中，利用耦合到適當(dāng)固體支持物上的多肽進(jìn)行親和層析，從而純化獲得對多肽特異性的多克隆抗體。
按照本發(fā)明，用于檢測p16INK4a的過度表達(dá)是否存在的方法與上文提到的檢測HPV基因產(chǎn)物的方法相同。
按照本發(fā)明，HPV基因產(chǎn)物的檢測可與p16INK4a是否存在過度表達(dá)的檢測同時進(jìn)行。按照本發(fā)明，文中的同時應(yīng)當(dāng)是指字面上的相同時刻或在相同的檢測操作中，由此單個的檢測步驟是臨時連續(xù)的。
按照本發(fā)明的方法，樣本包括任何含有肛門和生殖器來源的細(xì)胞的樣品。這些樣本可以包括如分泌物、切片、體液，和細(xì)胞樣本。
本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案是包括子宮頸細(xì)胞組成的。本發(fā)明的一個優(yōu)選樣本是由經(jīng)典子宮頸涂片制備的宮頸細(xì)胞樣本。本發(fā)明的更優(yōu)選樣本是制備為單層或薄層制品的細(xì)胞學(xué)樣本。樣本的制備可以包括如從一個病人獲得組織、體液或細(xì)胞樣本。按照本發(fā)明，樣本制備包括更進(jìn)一步地對樣本進(jìn)行制備的幾個步驟，如組織標(biāo)本的制備、將待測細(xì)胞涂或敷到顯微鏡載波片上，組織微陣列的制備，分離多肽或核酸，制備固相或玻珠固定的肽或核酸，以及待測分子共價耦合或非共價耦合的膜或載波片。
按照本發(fā)明的方法適用的癌病變包括任何肛門和生殖器病變，其特征是p16INK4a過度表達(dá)，更進(jìn)一步的是顯示有HPV基因產(chǎn)物的表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)選肛門和生殖器病變是子宮頸病變。
按照本發(fā)明的方法，本發(fā)明的另一方面是用于該方法的試驗試劑盒。試劑盒可以如診斷試劑盒或研究試劑盒。
按照本發(fā)明的試劑盒至少包括一種適合于檢測HPV基因產(chǎn)物的試劑和一種適合于檢測p16INK4a是否存在過度表達(dá)的試劑。
因此，按照本發(fā)明的試劑盒可以包括a)用于檢測HPV基因產(chǎn)物的試劑b)用于檢測p16INK4a是否過度表達(dá)的試劑c)通常用于進(jìn)行檢測反應(yīng)的試劑和緩沖液，如緩沖液、檢測標(biāo)記、載體物質(zhì)和其它d)一個用于進(jìn)行陽性對照反應(yīng)的p16INK4a樣本e)一個用于進(jìn)行陽性對照反應(yīng)的HPV基因產(chǎn)物樣本檢測HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a的試劑包括任何可以結(jié)合到HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a的分子。這樣的試劑包括蛋白質(zhì)、多肽、核酸、肽核酸、糖蛋白、蛋白多糖、多聚糖或脂類。
用于進(jìn)行陽性對照的HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a的樣本可以包括例如如溶液或鹽類等適用形式的核酸，適用形式的肽、組織切片樣本或陽性細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，按多肽水平對HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a進(jìn)行檢測。在該實(shí)施方案中，結(jié)合劑可以是如HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a的特異性抗體或含它的片段。
在另一個試驗試劑盒的實(shí)施方案中，按核酸水平對HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a進(jìn)行檢測。在該實(shí)施方案中，用于檢測的試劑可以所述的HPV基因產(chǎn)物和/或p16INK4a核酸的如核酸探針或反相互補(bǔ)引物。
由于癌變或癌變前肛門和生殖器病變是通過評估p16INK4a的過度表達(dá)來識別的，而同時組織化生細(xì)胞在細(xì)胞學(xué)檢測操作中也能檢測到p16INK4a的表達(dá)，因此本發(fā)明提供了一種區(qū)別癌變或癌變前肛門和生殖器病變與組織化生的方法。該方法是基于對高危HPV基因產(chǎn)物表達(dá)的檢測。已經(jīng)證實(shí)，高危HPV基因產(chǎn)物在癌變早期或癌變前有高水平的表達(dá)，正適合于該區(qū)別方法。這是由于這樣的事實(shí)，在生物樣本中癌變早期過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞的百分比表現(xiàn)了p16INK4a分子的水平，但是有這樣的可能性，這個水平是來源于組織化生細(xì)胞而不是癌變細(xì)胞。因此為了解決這個問題，當(dāng)基于p16INK4a過度表達(dá)的細(xì)胞學(xué)診斷方法需要更進(jìn)一步的信息來識別組織化生細(xì)胞時，尤其是在癌變早期，本發(fā)明提供了一種方法來區(qū)別癌變和組織化生細(xì)胞。
此外，本發(fā)明還提供了一套試劑盒以完成本發(fā)明的方法。


圖1組織化生細(xì)胞與p16INK4a特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例1；細(xì)胞明顯與p16INK4a的抗體發(fā)生了反應(yīng)圖2組織化生細(xì)胞與HPV的E2特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例1；顯示細(xì)胞沒有與直接針對HPV的E2蛋白的多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)圖3組織化生細(xì)胞與HPV的L1特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例1；顯示細(xì)胞沒有與直接針對HPV的L1蛋白的多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)圖4發(fā)育異常細(xì)胞與p16INK4a特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例1；細(xì)胞明顯與p16INK4a的抗體發(fā)生了反應(yīng)圖5發(fā)育異常細(xì)胞與HPV的E2特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例1；清楚地顯示了細(xì)胞與直接針對HPV的E2蛋白的多克隆抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)圖6發(fā)育異常細(xì)胞與HPV的L1特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例1；清楚地顯示了細(xì)胞與直接針對HPV的L1蛋白的多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)圖7組織化生細(xì)胞與p16INK4a特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例3；細(xì)胞明顯與p16INK4a的抗體發(fā)生了反應(yīng)圖8組織化生細(xì)胞與HPV的E7特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例3；顯示細(xì)胞沒有與直接針對HPV的E7蛋白的單克隆抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)圖9發(fā)育異常細(xì)胞與p16INK4a特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例3；細(xì)胞明顯與p16INK4a的抗體發(fā)生了反應(yīng)圖10發(fā)育異常細(xì)胞與HPV的E7特異性抗體的免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例3；清楚地顯示了細(xì)胞與直接針對HPV的E7蛋白的抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)圖11發(fā)育異常細(xì)胞與HPV的E7特異性抗體和p16INK4a特異性抗體的雙重免疫化學(xué)染色；試驗細(xì)節(jié)見實(shí)施例3；細(xì)胞明顯與HPV的E7和p16INK4a蛋白的抗體都發(fā)生了反應(yīng)；下面給出的例子僅僅是為了闡述在此公開的發(fā)明，而不是希望限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1子宮頸樣本中HPV的E2、L1和p16INK4a表達(dá)的免疫化學(xué)檢測用p16INK4a的特異性抗體和HPV中E2蛋白的多克隆抗體對子宮頸涂片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
在搖動裝置上將噴射固定的涂片在新鮮的50％乙醇(EtOH)中孵育進(jìn)行再水化。通過徹底地漂洗去除固定操作中所產(chǎn)生的聚乙二醇(PEG)膜。接下來在蒸餾水中漂洗涂片。用10mM枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)。就此，載玻片在95℃下水浴加熱40分鐘，室溫冷卻20分鐘，轉(zhuǎn)移到漂洗緩沖液中(PBS(磷酸緩沖鹽溶液)/0.1％吐溫20)，最后用脂質(zhì)筆(lipid-pencil)環(huán)繞。
為了滅活樣本的內(nèi)源性過氧化物酶，樣本在室溫下用3％的H2O2孵育20分鐘，然后用PBS/0.1％吐溫20漂洗5分鐘。用馬血清(Vectastain-試劑盒)(用PBS/0.1％吐溫20按1∶50稀釋)進(jìn)行蛋白質(zhì)封閉。涂片室溫下孵育20分鐘，然后仔細(xì)清洗。接下來封閉非特異性結(jié)合的抗生物素蛋白，試劑操作如下室溫下，樣本在抗生物素蛋白封閉溶液(現(xiàn)成的/載體)中孵育15分鐘，然后用移液管仔細(xì)清洗。為了封閉非特異性結(jié)合的生物素，涂片室溫下在生物素封閉溶液(現(xiàn)成的/載體)中孵育15分鐘，然后仔細(xì)清洗。
然后樣本與p16INK4a特異性第一抗體，或針對HPV的E2蛋白的多克隆抗體，或?qū)Ω呶ｋU亞型HPV(HPV16)的L1蛋白的多克隆抗體一起孵育；樣本在室溫下孵育60分鐘，用PBS/0.1％吐溫20清洗5分鐘(兩次)，隨后，與生物素?；牡诙贵w(馬-抗-小鼠的IgG)(Vectastain-試劑盒/用PBS/0.1％吐溫20按1∶200稀釋+馬血清)室溫下共同孵育30分鐘，用PBS/0.1％吐溫20清洗5分鐘(兩次)；接下來是與AB復(fù)合物(抗生物素蛋白-生物素-辣根過氧化物酶)(Vectastain-試劑盒/用PBS/0.1％吐溫20按1∶50稀釋)室溫下孵育30分鐘，然后用PBS/0.1％吐溫20清洗5分鐘(兩次)。
使用底物-色原體復(fù)合物(H2O2/AEC)進(jìn)行信號檢測，如下首先，樣本與底物-色原體復(fù)合物在室溫下孵育30分鐘，反應(yīng)在蒸餾水(aqua dest.)中停止。最后，用Mayers蘇木精復(fù)染，載玻片用甘油明膠封固。
用顯微鏡檢查載玻片，結(jié)果表明只有在樣本中同時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與p16INK4a和HPV的E2蛋白都發(fā)生了化學(xué)免疫反應(yīng)，這樣的樣本才能被顯微鏡識別為癌病變的樣本。細(xì)胞被p16INK4a特異性反應(yīng)染色，而沒有被HPV的E2蛋白的特異性反應(yīng)染色，則是由組織化生引起的。對HPV的L1的染色載玻片進(jìn)行的顯微鏡觀察顯示，組織化生細(xì)胞不與直接針對HPV的L1蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。相反，含有發(fā)育異常細(xì)胞的樣本含有能夠與HPV的L1蛋白和p16INK4a發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。因此，與發(fā)育異常的細(xì)胞相比，在組織化生中沒有細(xì)胞能被HPV的L1蛋白的特異性抗體染色。
結(jié)果表明，用HPV的E2或L1特異性的試劑可以區(qū)別組織化生與發(fā)育異常的p16INK4a過度表達(dá)。
實(shí)施例2通過原位雜交檢測子宮頸樣本中表達(dá)HPV的E2、HPV的L1或p16INK4a的細(xì)胞用原位染色反應(yīng)，對子宮頸涂片進(jìn)行半定量的分析，分析p16INK4a和HPV的E2和L2的mRNA水平。染色反應(yīng)操作如下在搖動裝置上將噴射固定的涂片在新鮮的50％乙醇(EtOH)中孵育進(jìn)行再水化。通過徹底地漂洗去除固定操作產(chǎn)生的PEG膜。接下來在蒸餾水中漂洗涂片。37℃下涂片與蛋白酶K(在PBS中10μg/ml)一起孵育10分鐘。然后，將涂片轉(zhuǎn)移到漂洗緩沖液中(PBS/0.1％吐溫20)，最后用lipid-pencil環(huán)繞。
雜交混和劑的制備，將50μl現(xiàn)成的雜交緩沖液(DAKOA/S，Glostrup，Danmark)與大約5-10pmol的探針混和。探針是經(jīng)熒光標(biāo)記的、分別與待測的各個分子的mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸序列。
雜交混合劑加熱到95℃，然后保持在37℃。在沸騰過程后，在42℃下涂片分別與每50μl雜交混合劑一起孵育4個小時。在37℃下樣本用超量的清洗液2×SSC清洗15分鐘兩次，37℃下用1×SSC清洗15分鐘一次，然后室溫下涂片用2×SSC漂洗兩次。接著清洗操作后，室溫下組織標(biāo)本用封閉緩沖液(NEN，Blockingpugger)孵育30分鐘。然后，在經(jīng)1∶100稀釋過的反-堿性熒光素磷酸酶(用封閉緩沖液稀釋，見上)(DAKOA/S)中孵育1小時。然后室溫下用1×PBS/0.1％Triton X-100清洗涂片兩次，每次10分鐘，接下來在室溫下用1×PBS 50mMMgCl2(pH9.2)清洗10分鐘。然后，室溫下用NBT/BCIP(Sigma)進(jìn)行染色反應(yīng)2小時30分鐘。染色反應(yīng)在涂片與1mM EDTA在PBS中進(jìn)行短暫孵育后停止。最后，涂片用H2Odest浸泡，然后包埋在AquaTex(Merck)中。隨后對被染色的組織標(biāo)本進(jìn)行鏡檢分析。
顯微鏡分析顯示，組織化生含有表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞，但不含有表達(dá)HPV的L1或E2的mRNA的細(xì)胞。在子宮頸的異常發(fā)育病變中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞，此外也發(fā)現(xiàn)了表達(dá)HPV的L1或E2的mRNA的細(xì)胞。
結(jié)果表明，按照本發(fā)明的方法可以用作區(qū)別組織化生和癌病變。
實(shí)施例3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測子宮頸樣本中HPV的E7和p16INK4a的表達(dá)用p16INK4a的特異性抗體和HPV E7蛋白的特異性單克隆抗體對子宮頸ThinPrep薄層涂片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
在搖動裝置上將噴射固定的涂片在新鮮的50％乙醇中孵育進(jìn)行再水化。通過徹底地漂洗去除固定操作產(chǎn)生的PEG膜。接下來在蒸餾水中漂洗涂片。用10mM枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)。就此，涂片在95℃-98℃下水浴加熱40分鐘，室溫冷卻20分鐘，將涂片轉(zhuǎn)移到漂洗緩沖液中(PBS/0.1％吐溫20)，最后用lipid-pencil環(huán)繞。
為了滅活樣本的內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下，樣本用3％的H2O2(Dakocytomation；S2023)孵育5分鐘，隨后在漂洗緩沖液(Dakocytomation；S3006)中漂洗5分鐘。然后將樣本與p16INK4a的特異性第一抗體或直接針對高危險亞型(HPV16)的E7蛋白的單克隆抗體一起孵育；室溫下孵育樣本30分鐘，用漂洗緩沖液清洗5分鐘，隨后室溫下與EnVision系統(tǒng)(Dakocytomation；K4001)孵育30分鐘，EnVision系統(tǒng)由山羊抗小鼠抗體結(jié)合右旋糖苷多聚體及過氧化物酶組成，隨后在漂洗緩沖液中清洗5分鐘(三次)。
信號檢測使用底物-色原體復(fù)合物(DAB+，Dakocytomation，K3468)進(jìn)行，操作如下首先，樣本與底物-色原體復(fù)合物在室溫下孵育10分鐘，反應(yīng)在蒸餾水中停止。最后，用Mayers蘇木精復(fù)染，載玻片用Faramount(Dakocytomation，S3025)封固。
用顯微鏡檢查載玻片，結(jié)果顯示，只有發(fā)現(xiàn)樣本中細(xì)胞同時與p16INK4a和HPV的E7蛋白發(fā)生了化學(xué)免疫反應(yīng)，這樣的樣本才被顯微鏡識別為癌變損害的樣本。細(xì)胞被p16INK4a特異性反應(yīng)染色，而沒有被HPV的E7蛋白的特異性反應(yīng)染色，則是由組織化生引起的。為了驗證此結(jié)果，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的HPV E7抗體(如上給定的抗體)結(jié)合上面所用的p16INK4a抗體進(jìn)行雙重染色。按照上面給出的適合的兩次染色程序進(jìn)行染色，必要的變化是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知道的。
在經(jīng)過雙重染色程序的樣本中，沒有發(fā)現(xiàn)雙重染色的組織化生細(xì)胞，相反，發(fā)育異常細(xì)胞顯示了被p16INK4a和HPV E7蛋白雙重染色。
結(jié)果表明，用對HPV E7特異性的試劑進(jìn)行染色可用于區(qū)別組織化生和異常發(fā)育的p16INK4a過度表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種區(qū)別細(xì)胞學(xué)試驗過程中在生物樣本中過度表達(dá)的p16INK4a的組織化生與過度表達(dá)的p16INK4a的癌變或癌前病變的方法，包括a.測定在所述的生物樣本中是否存在過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞；b.測定在所述的生物樣本中是否存在至少表達(dá)一種高危HPV基因產(chǎn)物的細(xì)胞；c.確定表達(dá)高危險亞型HPV基因產(chǎn)物的細(xì)胞和過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞同時存在或只有過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞單獨(dú)存在；d.其中表達(dá)高危HPV基因產(chǎn)物的細(xì)胞和過度表達(dá)p16INK4a的細(xì)胞同時存在表示是癌變或癌前病變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中高危HPV基因產(chǎn)物在癌變和/或癌前病變早期表達(dá)較多。
3.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中至少一種HPV基因產(chǎn)物是由HPVE7基因編碼的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一種HPV基因產(chǎn)物是由HPVE2和/或E6基因編碼的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一種HPV的基因產(chǎn)物是由HPV的L1和/或L2基因編碼的。
6.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中HPV的基因產(chǎn)物是多肽或RNA分子。
7.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中的癌變或癌前病變是肛門與生殖道病變。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中的肛門與生殖道病變是子宮頸病變。
9.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中的生物學(xué)樣本是包含來源于肛門與生殖器的細(xì)胞的樣本。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的細(xì)胞是來源于子宮頸的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中的生物學(xué)樣本是巴氏涂片或子宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。
12.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中對HPV的基因產(chǎn)物和p16INK4a分子的檢測使用至少一種待測分子的特異性探針。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中探針已被可檢測的標(biāo)記過。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中標(biāo)記選自放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物或酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項所述的方法，其中的探針是蛋白質(zhì)和/或核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中至少有一種探針是針對高危HPV編碼的基因產(chǎn)物或p16INK4a分子的抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，包含了一個免疫細(xì)胞化學(xué)染色過程。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中至少有一種探針是能特異性地與高危HPV基因產(chǎn)物雜交的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，包含一個原位雜交反應(yīng)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，包含一個核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)是PCR或LCR。
22.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中使用核酸探針和多肽探針的同時進(jìn)行檢測反應(yīng)。
23.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中高危HPV基因產(chǎn)物是與癌癥相關(guān)的HPV亞型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56和58的基因產(chǎn)物。
24.胼胝前面權(quán)利要求任一項所述的方法，其中確定至少一個單細(xì)胞過度表達(dá)p16INK4a分子的同時還表達(dá)至少一種高危HPV基因產(chǎn)物。
25.進(jìn)行前面權(quán)利要求任一項所述的方法的試劑盒，其是診斷試劑盒或研究試劑盒，包括a.用于檢測生物樣本中存在或不存在過度表達(dá)的p16INK4a的探針；b.用于檢測生物樣本中存在或不存在表達(dá)一種或一種以上HPV的基因產(chǎn)物的一種或一種以上探針。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其進(jìn)一步包括a.一種用于陽性對照反應(yīng)的p16INK4a樣本b.一種或一種以上用于進(jìn)行陽性對照反應(yīng)的HPV基因產(chǎn)物樣本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種區(qū)別過度表達(dá)p1文檔編號G01N33/574GK1643378SQ03806332
公開日2005年7月20日 申請日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月9日
發(fā)明者P·馬丁, R·賴德, M·馮克內(nèi)貝爾德貝里茨 申請人:Mtm實(shí)驗室公司