專利名稱：含有非再生酶－輔酶復(fù)合體的方法和試劑體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過酶促反應(yīng)檢測樣品中分析物的方法和試劑體系，包括酶-輔酶復(fù)合體作為非再生、特別是化學(xué)計(jì)量量的反應(yīng)物檢測存在于樣品中的分析物的用途。
已知通過酶促方法檢測分析物，如血中的葡萄糖。這需要待分析的分析物與合適的催化量的酶和輔酶接觸。輔酶在還原作用或氧化作用中所產(chǎn)生的氧化還原當(dāng)量傳遞給介質(zhì)，在隨后的步驟中利用電化學(xué)或光度學(xué)方法檢測介質(zhì)。有一個(gè)校準(zhǔn)提供了檢測值和待測分析物濃度之間的直接關(guān)系。
Sierra等(Anal.Chem.69(1997)，1471-1476)描述了一種基于葡萄糖氧化酶內(nèi)在熒光特性的血葡萄糖檢測方法。在該方法中，使用了催化量的酶和它的輔酶FAD，氧化還原當(dāng)量被傳遞給介質(zhì)氧。
Narayanswamy等(Aanlytical letters 21(7)(1988)，1165-1175)描述了一種用于葡萄糖檢測的葡萄糖脫氫酶和NAD熒光測定方法。在此情況下所使用的酶是催化，即非化學(xué)計(jì)量的量。用熒光測定方法檢測溶液中游離的NADH。
在現(xiàn)有技術(shù)檢測體系中，需要電化學(xué)活性物質(zhì)(介質(zhì))來檢測待測的分析物，這是非直接的，即需要通過一系列的化學(xué)反應(yīng)。在此情況下，通常需要對所用物質(zhì)的濃度作出復(fù)雜的調(diào)整以盡量提高反應(yīng)速度。而且，在危險(xiǎn)是較長的貯藏階段，所需的電化學(xué)活性物質(zhì)是不穩(wěn)定的。
而且，相對于酶-輔酶體系，通常不得不使用過量的介質(zhì)。輔酶具有高的反應(yīng)活性，因此介質(zhì)的分解即使是很小的量，如小于1％或暴露于外部物質(zhì)，如物質(zhì)從包裝材料向外的揮發(fā)，也會導(dǎo)致酶活性的急劇下降。這在分析物檢測中會導(dǎo)致錯誤信號的產(chǎn)生。而且還有一個(gè)缺點(diǎn)是，分析物的檢測時(shí)間通常至少要幾秒，對于葡萄糖例如需要大于4秒，并且所需的樣品量是大量的，如大于0.5μl。
本發(fā)明的目的是至少在一定程度上避免上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)。特別是提供一種非敏感和快速的用于分析物酶促檢測的方法，使得即使不存在介質(zhì)或/和指示劑的情況下仍然能夠獲得可靠的測定結(jié)果。
本發(fā)明的目的是通過使用酶-輔酶復(fù)合體作為化學(xué)計(jì)量量的反應(yīng)物，而不是象通常那樣作為催化劑來實(shí)現(xiàn)的。分析物的檢測僅需要唯一的反應(yīng)步驟，因此非?？焖?。在此不再需要介質(zhì)和指示劑以及復(fù)雜的反應(yīng)混合物，因此也不再具有低穩(wěn)定性和對干擾的高度敏感性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了一種通過酶促反應(yīng)檢測樣品中分析物的方法，包含以下步驟；(a)使樣品與包含酶-輔酶復(fù)合體的檢測試劑接觸，其中不發(fā)生輔酶的再生，和(b)通過酶-輔酶復(fù)合體的變化檢測分析物的反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面是提供一種用于檢測樣品中分析物的試劑體系，包含(a)包含酶-輔酶復(fù)合體的檢測試劑，其中不發(fā)生輔酶的再生，和(b)容納檢測試劑的載體。
本發(fā)明使分析物在非常短的時(shí)間內(nèi)，優(yōu)選≤5秒，特別優(yōu)選≤1秒，最優(yōu)選≤0.1秒，進(jìn)行簡單的定性或定量檢測成為可能。反應(yīng)是在檢測過程中不發(fā)生輔酶再生的條件下進(jìn)行的。此外，分子酶-輔酶復(fù)合體可僅和一分子的分析物反應(yīng)。因此，有利的是，反應(yīng)應(yīng)當(dāng)在不存在介質(zhì)或其它能夠?qū)е螺o酶再生的物質(zhì)的條件下進(jìn)行。
根據(jù)所描述的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，檢測試劑包含足夠量的用于定性或/和定量檢測分析物的酶-輔酶復(fù)合體。尤其是對于分析物的定量檢測，所使用的酶-輔酶復(fù)合體的量應(yīng)當(dāng)使酶-輔酶復(fù)合體的反應(yīng)分子數(shù)目與存在于樣品中的分析物的濃度相關(guān)聯(lián)。特別優(yōu)選所使用的酶-輔酶復(fù)合體的量相對于樣品中分析物應(yīng)當(dāng)是至少化學(xué)計(jì)量的量，優(yōu)選相對于分析物是過量的化學(xué)計(jì)量的量。在這里，“至少化學(xué)計(jì)量的量”意味著相對于酶-輔酶復(fù)合體分子的數(shù)目，需要對樣品大小作出調(diào)整，使得根據(jù)預(yù)期的樣品中分析物的濃度，與分析物反應(yīng)的酶-輔酶復(fù)合體的分子數(shù)目與存在于樣品中的分析物濃度相關(guān)聯(lián)?！盎瘜W(xué)計(jì)量的量”優(yōu)選使得指酶-輔酶復(fù)合體的分子數(shù)目與研究樣品中預(yù)期的分析物分子最大數(shù)目相一致。
本方法和檢測體系可以使用最少量的樣品，例如，≤1μl的樣品量，特別是≤0.1μl的樣品量。任選地樣品可以在與檢測試劑接觸前進(jìn)行稀釋。
本發(fā)明的方法和檢測體系適合檢測任何分析物，例如體液參數(shù)，體液如血、血清、血漿或尿，也可以是廢水或食品。該方法可以在濕態(tài)條件下進(jìn)行如在試管中，或者在干態(tài)下有合適反應(yīng)物載體的條件下進(jìn)行。
被檢測的分析物可以是任何能夠與酶-輔酶復(fù)合體進(jìn)行反應(yīng)，特別是氧化還原反應(yīng)的生物或化學(xué)物質(zhì)，例如，葡萄糖、乳酸、蘋果酸、甘油、醇、膽固醇、甘油三脂，抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、肽等。
酶促反應(yīng)優(yōu)選是氧化還原反應(yīng)，其中酶-輔酶復(fù)合體中的輔酶被還原或氧化。在這類反應(yīng)中，優(yōu)選使用的酶是氧化還原酶。特別優(yōu)選使用的酶是脫氫酶，例如選自葡萄糖脫氫酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸脫氫酶(E.C.1.1.1.27，1.1.1.28)、蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脫氫酶(E.C.1.1.1.6)、醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1)或氨基酸脫氫酶，如L-氨基酸脫氫酶(E.C.1.4.1.5)。其它適合的酶是氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)或膽固醇氧化酶(E.C.1.1.3.6)。
用于本發(fā)明目的的輔酶優(yōu)選是有機(jī)分子，其與酶共價(jià)或非共價(jià)連接，并且通過分析物的轉(zhuǎn)化而發(fā)生變化，如被氧化或被還原。優(yōu)選的輔酶例子有黃素、煙堿和苯醌衍生物，如核黃素衍生物，如FAD、FADH2、FMN、FMNH2等，煙堿核苷酸衍生物，如NAD+、NADH/H+、NADP+、NADPH/H+等，或泛醌，如輔酶Q、PQQ等。
輔酶通過與分析物反應(yīng)而發(fā)生的變化，原則上可以通過任何方法得到檢測。原則上可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的所有檢測酶促反應(yīng)的方法。然而，優(yōu)選使用光學(xué)方法來檢測輔酶的變化。光學(xué)檢測方法包括如測定吸收、熒光、圓二色性(CD)、旋光色散(ORD)、折射測定法等。特別優(yōu)選通過測定熒光來檢測輔酶的變化。熒光測定是高度靈敏的并且即使在微型化體系下分析物的濃度很低仍然能夠檢測。
本發(fā)明的方法和檢測體系可以包含液體檢測，在此情況下試劑是以例如溶液或懸浮在水或非水液體中、或以粉末或凍干粉的形式存在。但是本發(fā)明的方法和檢測體系優(yōu)選包含干態(tài)檢測，在此情況下試劑被放置到載體上。載體包括例如含有吸附劑或/和可膨脹材料的、可以被待檢測樣品液體濕潤的檢測條。
在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，所使用的檢測試劑是凝膠基質(zhì)，其中嵌入酶-輔酶復(fù)合體。優(yōu)選凝膠基質(zhì)層厚≤50μm，特別≤5μm，并且被放置到載體上，載體例如至少在一定程度上是光學(xué)透明的。凝膠基質(zhì)可以是含有一種或多種可溶性聚合物的基質(zhì)，同已知的干態(tài)檢測體系相同(如AccuChek Active)，并且可被刀割下并干燥制備?；|(zhì)優(yōu)選基于有可光聚合結(jié)構(gòu)特性的物質(zhì)，如丙烯酸單體如丙烯酰胺或/和丙烯酸酯、如聚乙二醇二丙烯酸酯、或乙烯芳香族單體如4-乙烯苯磺酸、或其組合的聚合物。該類型凝膠基質(zhì)可以通過如下方式制備，將含有酶、可光聚合特性單體和任選的輔酶的試劑、光引發(fā)劑或/和不反應(yīng)成分的液體涂覆到至少部分透明的載體如塑料片上，并且例如用UV光從背面照射，使得一種單體或多種單體在載體上發(fā)生聚合并達(dá)到預(yù)定的層厚。層厚可以通過在試劑中加入吸附劑或/和通過調(diào)節(jié)照射的時(shí)間和強(qiáng)度來控制。可以在聚合后去掉過量的液體試劑，并再利用(參看例如圖2)。
另一方面，凝膠基質(zhì)還可以通過通常的涂覆步驟來制備，其中將液體試劑涂覆到載體上，使用合適的方法如使用刮刀使之達(dá)到所需要的厚度，然后使之完全聚合。
通過聚合或嵌入包含到基質(zhì)后，酶處于被保護(hù)的微環(huán)境中。如果聚合物的凝膠基質(zhì)是充分交聯(lián)的，則酶分子處于不可移動狀態(tài)。然而，低分子量物質(zhì)或葡萄糖或其它分析物或其輔酶則可以在聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中自由擴(kuò)散。
酶既可以通過聚合作用與其輔酶共同包含于基質(zhì)中，也可以在聚合作用后將基質(zhì)與輔酶溶液接觸，使得形成合適的酶-輔酶復(fù)合體。凝膠基質(zhì)中酶的濃度優(yōu)選足夠與待測分析物進(jìn)行化學(xué)計(jì)量反應(yīng)，并且能夠進(jìn)行被反應(yīng)改變了的輔酶的直接檢測。反應(yīng)僅由唯一的催化反應(yīng)組成，如氧化還原反應(yīng)，其可以在毫秒或微秒的時(shí)間間隔內(nèi)完成。被反應(yīng)改變了的輔酶通過結(jié)合到酶的活性中心而得到最適的保護(hù)，使其免受干擾影響，并且任選地還可以將其嵌入凝膠基質(zhì)中。
以下通過附圖
和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
附1表示本發(fā)明檢測體系第一種實(shí)施方式。試劑層(2)，如含有酶-輔酶復(fù)合體的凝膠基質(zhì)，涂布到透明的載體(1)上。酶-輔酶復(fù)合體是以一種在分析物檢測期間使輔酶不能發(fā)生再生的形式存在。樣品(3)如血，加到試劑層上。包含在樣品(3)中的分析物和包含在試劑層(2)中的酶-輔酶復(fù)合體之間發(fā)生酶促反應(yīng)通過光學(xué)方法進(jìn)行檢測。從光源(4)發(fā)出的光，如激光或LED，從后面(穿透載體)射到試劑層(2)。通過檢測器(5)檢測從樣品反射回來的吸收光或熒光。任選地，特別是對于熒光檢測，在檢測器的前面放上光學(xué)過濾元件(6)，目的是防止激發(fā)熒光的泄漏。
圖2表示本發(fā)明檢測體系的制備。將液體試劑(12)如第一個(gè)位置(13)涂到光透明的載體(11)上，如塑料片。從光源(14)發(fā)出的光從后面透過載體(11)照射到位于第二位置的液體試劑(12)。同時(shí)，沿著(15)所示的箭頭方向移動載體。從而在載體(11)上直接形成聚合了的試劑層(16)。在聚合層(16)上有過量的液體試劑。聚合了的反應(yīng)物層(16)的厚度可以通過調(diào)節(jié)試劑的組成、光束的強(qiáng)度和照射時(shí)間和通過載體(11)的性質(zhì)來進(jìn)行控制。
圖3表示從后面的熒光傳感器的實(shí)施方式。聚合了的試劑層，例如通過圖2所示的連續(xù)步驟制備而成，它可以被切下，利用已知技術(shù)放置到載體(21)。將樣品放置到向上的一面，從光源射出的激發(fā)光(23)如UV從下面射入。分析物與試劑層(22)的酶-輔酶復(fù)合體反應(yīng)產(chǎn)生熒光(24)如藍(lán)光，并用檢測器對其進(jìn)行檢測。
將多種試劑(相同或不同)放置到載體上也是可以的。圖4顯示了其中一個(gè)圓盤形式的實(shí)施方式。多個(gè)試劑點(diǎn)(32)排列在光透明的載體(31)上。
圖5A和5B顯示了在CCD攝像機(jī)下本發(fā)明檢測體系的熒光(葡萄糖脫氫酶和NAD+)與葡萄糖濃度增加的關(guān)系。
實(shí)施例實(shí)施例1在試管中葡萄糖脫氫酶(GlucDH)/NAD+體系下葡萄糖化學(xué)計(jì)量量的檢測100mg/ml GlucDH溶解于pH7的緩沖溶液并與適量的NAD+混合。隨著葡萄糖量的增加，將會在紫外燈(激發(fā)波長為366nm)下觀察到熒光強(qiáng)度的增加(圖5A和5B)。
沒有葡萄糖的酶體系的溶液不發(fā)出熒光，并且只有葡萄糖和NAD+的溶液也不發(fā)出熒光。
實(shí)施例2在聚合物薄膜上在GlucDH/NAD+體系下進(jìn)行的葡萄糖檢測在塑料試管中混合如下物質(zhì)的懸浮液配方1
0.5ml的懸浮液與0.5ml的GlucDH(100mg/ml)溶液混合，混合物在超聲水浴鍋中均化去掉氣泡。
澄清的溶液倒入電暈處理的聚碳酸酯片上，其厚度125mm，并用常用的照射裝置(Isel UV照射儀2)照射20分鐘。塑料片短暫地用水沖洗并隨后在空氣中干燥。
制得的層的厚度＜2μm。制備新鮮的葡萄糖/NAD+溶液(GKL-3溶液，300mg/dl的葡萄糖，1ml/6.4mg的NAD+)并倒到薄膜上。在紫外燈下立即可看到強(qiáng)烈的熒光。
實(shí)施例3加紫外吸收劑對層厚的影響制備更能證明試驗(yàn)結(jié)果的包含藍(lán)色染料(最大吸收波長≈650nm)的聚合物層(配方2)。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，在最初的配方中摻入了黃色染料作為UV吸收劑(配方3)。
配方2
攪拌混合物，并經(jīng)過超聲浴處理均化，用吸管分布到140μm的Pokalon片上(電暈處理，步驟4)并用紫外照射儀(Actina U4，W.Lemmen GmbH)照射1分鐘。
用螺旋測定儀(Mikrometerschraube)測量制得的層的厚度，結(jié)果為240.5μm。
配方3
將混合物如上所述分布到薄片上并隨后聚合。用螺旋測定儀測量制得的層的厚度，結(jié)果為79.3μm。
試驗(yàn)結(jié)果表明是可以影響層的厚度的。其它條件相同的條件下，沒有紫外吸收劑的情況下層厚240.5μm；在有紫外吸收劑(黃色媒染劑7)的情況下層厚僅為79.3μm。
權(quán)利要求
1.通過酶促反應(yīng)檢測樣品中分析物的方法，包含如下步驟(a)在不發(fā)生輔酶再生的條件下，使樣品與包含酶-輔酶復(fù)合體的檢測試劑接觸，和(b)通過酶-輔酶復(fù)合體的變化檢測分析物的反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶促反應(yīng)包含氧化還原反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于使用的酶是氧化還原酶，并且檢測輔酶因氧化作用或還原作用而發(fā)生的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所使用的酶是脫氫酶，選自葡萄糖脫氫酶((E.C.1.1.1.47)、乳酸脫氫酶(E.C.1.1.1.27，1.1.1.28)、蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脫氫酶(E.C.1.1.1.6)、醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1)或氨基酸脫氫酶，如L-氨基酸脫氫酶(E.C.1.4.1.5)。
5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所使用的輔酶選自黃素、煙堿和苯醌衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于輔酶選自FAD、FADH2、FMN、FMNH2、輔酶Q、PQQ、NAD+、NADH/H+、NADP+和NADPH/H+。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其特征在于通過光學(xué)方法檢測輔酶的變化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于通過測定吸收、熒光、CD、ORD或折射來檢測輔酶的變化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于通過測定熒光來檢測輔酶的變化。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于使用具有其中嵌入的酶-輔酶復(fù)合體的凝膠基質(zhì)作為檢測試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于凝膠基質(zhì)的層厚≤50μm，尤其≤5μm。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于使用以可光聚合物質(zhì)為基礎(chǔ)的凝膠基質(zhì)。
13.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于檢測體液中的分析物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于進(jìn)行血中葡萄糖的檢測。
15.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于分析物的反應(yīng)時(shí)間≤5秒。
16.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于反應(yīng)是在不存在可與輔酶反應(yīng)的介質(zhì)的情況下進(jìn)行的。
17.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于相對于分析物，使用的酶-輔酶復(fù)合體作為化學(xué)計(jì)量量的反應(yīng)物。
18.一種用于檢測樣品中分析物的試劑體系，包含(a)包含酶-輔酶復(fù)合體的檢測試劑，以不發(fā)生輔酶再生的形式存在，和(b)容納檢測反應(yīng)物的載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑體系，其特征在于酶-輔酶復(fù)合體嵌入凝膠基質(zhì)中。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的試劑體系，其特征在于載體至少部分地是光學(xué)透明的。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)所述的試劑體系，其特征在于載體包含基本平的結(jié)構(gòu)。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)所述的試劑體系，其特征在于載體包含多個(gè)不同的檢測試劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-22任一項(xiàng)所述的試劑體系在權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的方法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過酶促反應(yīng)方法檢測樣品中分析物的方法和試劑體系，包括用酶－輔酶復(fù)合體作為化學(xué)計(jì)量反應(yīng)配偶體來檢測存在于樣品中的分析物。
文檔編號G01N21/78GK1653190SQ03811067
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者C·霍恩, J·赫內(nèi)斯, W·－R·－h(huán)·卡納珀 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司