專利名稱：采用時(shí)間分辨熒光的基于膜的檢測的制作方法
相關(guān)申請本申請是于2002年8月27日申請的美國申請系列號No.10/22837的系列申請。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)研究出了采用熒光標(biāo)記物的檢測方法，從而有利于檢測分析物。熒光通常是三階段過程的結(jié)果。在第一階段，由外部源提供能量，例如白熾燈或激光，能量被熒光化合物吸收，得到激發(fā)的電子單重態(tài)。在第二階段，激發(fā)態(tài)持續(xù)一有限時(shí)間，在此期間，熒光化合物發(fā)生構(gòu)型改變，同時(shí)還與其分子環(huán)境發(fā)生多種相互作用。在此時(shí)間內(nèi)，激發(fā)態(tài)的能量部分被消耗，產(chǎn)生弛豫態(tài)，其是熒光發(fā)射的來源。第三階段為熒光發(fā)射階段，發(fā)射能量，將熒光化合物返回至基態(tài)。發(fā)射出的能量低于其激發(fā)能(燈或激光)，因此具有較長的波長。這種能量或波長的漂移或不同使得發(fā)出的能量能夠被檢測出來，并與激發(fā)能分離開來。
常規(guī)熒光檢測通常利用波長過濾將發(fā)射光子同激發(fā)光子分離開來，以及利用檢測器記錄發(fā)射光子并生成可記錄的輸出，所述輸出通常為電信號或攝影圖像。然而，常規(guī)熒光檢測技術(shù)存在一些問題。例如，大多數(shù)生物液體具有自熒光，其可以降低檢測準(zhǔn)確性。檢測裝置也可以具有某些自熒光。許多常規(guī)熒光標(biāo)記物的小的斯托克司頻移例如20至50納米，增加了干擾。
對于常規(guī)熒光檢測技術(shù)中存在的某些問題，研究出了一種稱為“時(shí)間分辨”熒光的技術(shù)。時(shí)間分辨熒光涉及用短脈沖光激發(fā)熒光標(biāo)記物，在激發(fā)之后以及測量剩余的壽命較長的熒光信號之前，等待一特定時(shí)間(例如大約100至200微秒之間)。這樣，消除了任意壽命較短的熒光背景信號和散射激發(fā)輻射。盡管時(shí)間分辨技術(shù)已經(jīng)成功地在某些類型的檢測裝置中使用，例如基于比色杯的儀器，但是在其它類型的檢測裝置中結(jié)合時(shí)間分辨技術(shù)仍然存在問題，例如基于膜的裝置。
特別是，常規(guī)時(shí)間分辨系統(tǒng)，例如基于單色器的系統(tǒng)涉及非常復(fù)雜而且昂貴的儀器。例如，典型的研究級實(shí)驗(yàn)用熒光計(jì)為雙重的單色器系統(tǒng)，其中一個(gè)單色器用于選擇激發(fā)波長，另一個(gè)單色器用于選擇檢測波長。其復(fù)雜性顯著增加了系統(tǒng)的成本，同時(shí)要求體積較大的、不便于攜帶的、笨重的儀器。此外，當(dāng)常規(guī)的時(shí)間分辨系統(tǒng)與基于膜的檢測裝置結(jié)合使用時(shí)存在問題。特別是，在基于膜的裝置中，分析物的濃度減少了，這是因?yàn)槠浔豢梢粤鹘?jīng)所述多孔膜的液體稀釋了。不幸的是，在如此低的分析物濃度下，背景干擾格外地有問題，其原因是待檢測的熒光強(qiáng)度相對較低。由于膜結(jié)構(gòu)還趨向于反射發(fā)出的光，檢測器精確測量標(biāo)記分析物的熒光強(qiáng)度的能力顯著減少。實(shí)際上，所發(fā)出的熒光信號的強(qiáng)度通常比多孔膜反射的激發(fā)光低3至4個(gè)量級。
因此，目前需要有一種簡單、便宜而且有效的系統(tǒng)用于測量基于膜的檢測裝置的熒光。
本發(fā)明的簡要描述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，公開了一種檢測測試樣品中分析物的存在或者量的方法，其包括i)提供流式檢測裝置，其包括與熒光標(biāo)記物流體連接的多孔膜，所述熒光標(biāo)記物的熒光發(fā)射壽命大于大約1微秒，所述多孔膜限定一檢測區(qū)；ii)將熒光標(biāo)記物與測試樣品接觸，從而形成混合物(例如，溶液、懸浮液等等)；iii)使所述混合物流至檢測區(qū)；iv)在檢測區(qū)附近放置一時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器，所述熒光讀數(shù)器包括脈沖式激發(fā)源和按時(shí)選通檢測器；v)用所述脈沖激發(fā)源激發(fā)檢測區(qū)的熒光標(biāo)記物，其中所述激發(fā)導(dǎo)致熒光標(biāo)記物發(fā)出檢測信號；以及vi)用按時(shí)選通檢測器測量檢測信號的強(qiáng)度。
所述熒光標(biāo)記物包括釤、鏑、銪、鋱的鑭系螯合物或它們的混合物。而且，在某些實(shí)施方式中，熒光標(biāo)記物的發(fā)射壽命大于大約10微秒，在某些實(shí)施方式中大于約50微秒，以及在某些實(shí)施方式中為大約100至大約1000微秒。同樣，熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移可以大于約50納米，在某些實(shí)施方式中，大于約100納米，以及在某些實(shí)施方式中為大約250至大約350納米。如果需要，所述標(biāo)記物可以與微粒結(jié)合使用，所述微粒用所述分析物的特定結(jié)合組分修飾。
可以采用所述熒光讀數(shù)器精確地激發(fā)標(biāo)記物，并檢測基于膜的檢測裝置的熒光，不需要采用昂貴的組件，例如單色器或窄發(fā)射帶寬的濾波器。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，所述脈沖激發(fā)源為硅光電二極管。熒光讀數(shù)器還可以含有與脈沖激發(fā)源和按時(shí)選通的檢測器相連接的定時(shí)電路(例如A/D轉(zhuǎn)換器，微處理器，放大器，分配器，晶體振蕩器，晶體管，觸發(fā)電路等)，從而控制信號脈沖和檢測。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，公開了一種檢測測試樣品中分析物的存在或者量的方法，其包括i)提供流式檢測裝置，其包括與結(jié)合探針流體連接的多孔膜，所述探針含有鑭系螯合物，所述鑭系螯合物的熒光發(fā)射壽命大于約50微米，其斯托克司頻移大于大約100納米，所述多孔膜限定了一檢測區(qū)和校正區(qū)；以及ii)結(jié)合探針與測試樣品接觸從而形成混合物；iii)使混合物流至檢測區(qū)和校正區(qū)；iv)在檢測區(qū)和校正區(qū)附近放置一時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器，所述熒光讀數(shù)器包括脈沖式發(fā)光二極管和按時(shí)選通檢測器，所述檢測器包括硅光電二極管，以及兩者的組合；v)用脈沖式發(fā)光二極管激發(fā)檢測區(qū)和校正區(qū)內(nèi)的鑭系螯合物，其中所述激發(fā)導(dǎo)致檢測區(qū)內(nèi)的鑭系螯合物發(fā)出檢測信號，使校正區(qū)內(nèi)的鑭系螯合物發(fā)出校正信號；vi)用按時(shí)選通檢測器測量檢測信號和校正信號；vii)比較檢測信號和校正信號的強(qiáng)度，其中測試樣品中分析物量與經(jīng)校正信號強(qiáng)度校正的檢測信號強(qiáng)度成比例；。
檢測區(qū)的熒光標(biāo)記物可以與校正區(qū)的熒光標(biāo)記物同時(shí)或分別激發(fā)。同樣，可以同時(shí)或者單獨(dú)測量檢測信號和校正信號。
以下將對本發(fā)明的其它特征和方面進(jìn)行詳細(xì)描述。
附圖的簡要說明參考以下附圖，針對本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在本說明書的以下部分對本發(fā)明進(jìn)行全面的公開，包括最佳實(shí)施方式，其中附

圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的基于膜的裝置的透視圖；
附圖2為可用于本發(fā)明的時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器的一個(gè)實(shí)施方式的示意圖，包括代表性的電子組件；附圖3為可用于本發(fā)明的時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器的另一實(shí)施方式的示意圖，包括代表性的電子組件；附圖4為可用于本發(fā)明的時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器的另一實(shí)施方式的示意圖，包括代表性的電子組件；附圖5為例2中所得結(jié)果的標(biāo)化激發(fā)和發(fā)射光譜的圖形；以及附圖6為例4中所得結(jié)果的標(biāo)化熒光強(qiáng)度對分析物濃度(毫微克每毫升)的圖形。
在本說明書和附圖中重復(fù)使用的附圖標(biāo)記代表本發(fā)明的相同或類似特征或元件。
代表實(shí)施方式的詳細(xì)描述定義在本文中，術(shù)語“分析物”通常是指待檢測物質(zhì)。例如，分析物可以包括抗原性物質(zhì)，半抗原，抗體以及它們的組合。分析物包括但不限于毒素、有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括出于治療目的以及違法目的服用的藥物)、藥物中間物或副產(chǎn)物、細(xì)菌、病毒顆粒、以及上述物質(zhì)的代謝物或者抗體。某些分析物的特定例子包括鐵蛋白；肌酐激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；魯米那；酰胺咪嗪；萬古霉素；慶大霉素；茶堿；丙戊酸；奎尼?。淮冱S體生成素(LH)；卵泡刺激素(FSH)；雌二醇，黃體酮；C-反應(yīng)蛋白；lipocalins；IgE抗體；維生素B2微球蛋白；糖化血紅蛋白(Gly，Hb)；皮質(zhì)醇；洋地黃毒甙；N-乙酰普魯卡因胺(NAPA)；普魯卡因胺；風(fēng)疹病毒抗體，例如風(fēng)疹病毒-IgG和風(fēng)疹病毒IgM；弓形蟲抗體，例如弓形蟲IgG(Toxo-IgG)和弓形蟲IgM(Toxo-IgM)；睪丸激素；水楊酸鹽；對乙酰氨基酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝病毒核心抗原的抗體，例如抗乙肝病毒核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人類免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人類T細(xì)胞白血病毒1和2(HTLV)；乙肝病毒e抗原(HBeAg)；抗乙肝病毒e抗原的抗體(抗-HBe)；甲狀腺刺激素(TSH)；甲狀腺素(T4)；總?cè)饧谞钕侔彼?總T3)；游離三碘甲狀腺氨酸(游離T3)；癌胚抗原(CEA)；和α甲胎蛋白(AFP)。濫用的藥物和經(jīng)控制的物質(zhì)包括但不限于，苯丙胺；甲基苯異丙胺；巴比妥類，例如異戊巴比妥，司可巴比妥，戊巴比妥和巴比妥；苯二氮，例如甲氨二氮卓和安定；大麻成分，例如大麻粉和大麻毒品；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鴉片劑，例如海洛因、嗎啡、可待因、二氫嗎啡酮、氫可酮、美沙酮、14-羥基二氫可待因酮、氧嗎啡酮和鴉片；苯環(huán)己哌啶；和丙氧酚。其它潛在的分析物參見Everhart等的美國專利No.6436651和Tom等的美國專利NO.4366241。
本文中，術(shù)語“測試樣品”通常是指懷疑含有分析物的材料。所述測試樣品可以從其來源直接應(yīng)用，或者對其進(jìn)行預(yù)處理從而修飾樣品的特征。測試樣品可以來自任何生物來源，例如生理液體，包括血液、胞間液、唾液、接觸鏡液體、腦脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹膜液、陰道粘液、羊水等。在使用前可以對測試樣品進(jìn)行預(yù)處理，例如從血液制備血漿、稀釋粘性液體等等。處理的方法涉及過濾、沉淀、稀釋、蒸餾、濃縮、對干擾組分的滅活以及加入試劑。除了生理液體之外，也可以使用其它液體樣品，例如水、食物等等，從而進(jìn)行環(huán)境或食品生產(chǎn)檢測。另外，懷疑含有分析物的固體材料也可以用作測試樣品。在某些情況下，對固體測試樣品進(jìn)行修飾從而形成液體介質(zhì)或釋放分析物是有利的。
詳細(xì)描述現(xiàn)在對本發(fā)明的不同實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)參考，以下描述了一個(gè)或幾個(gè)例子。本發(fā)明對每個(gè)例子進(jìn)行了解釋，但不限制本發(fā)明。實(shí)際上，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，是顯而易見的。例如，舉例或者描述的作為實(shí)施方式一部分的特征可以用于另一實(shí)施方式中，從而得到其它實(shí)施方式。因此，在以下權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)，本發(fā)明包括了上述修改和變化。
總的來說，本發(fā)明涉及基于膜的檢測裝置，用于檢測測試樣品中分析物的存在或量。該裝置利用時(shí)間分辨熒光檢測被激發(fā)的熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的信號。由于標(biāo)記物可以具有較長的發(fā)射壽命，實(shí)際上可以在檢測過程中消除多個(gè)來源的背景干擾，例如散射光和自熒光。此外，本發(fā)明中采用的熒光讀數(shù)器具有簡單而且便宜的設(shè)計(jì)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述讀數(shù)器可以利用脈沖式發(fā)光二極管(LED)和硅光電二極管精確激發(fā)標(biāo)記物并檢測基于膜的檢測裝置的熒光，而不需要使用昂貴的組件，例如單色器或窄發(fā)射帶寬的濾波器。
參照附圖1，例如，現(xiàn)在對根據(jù)本發(fā)明形成的流式檢測裝置20的一個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。如圖所示，裝置20含有多孔膜23，其可選擇地由一剛性材料21支撐。通常，所述多孔膜23可以由多種材料中的任意一種構(gòu)成，測試樣品能夠通過所述材料。例如，用于構(gòu)成多孔膜23的材料可以包括但不限于，天然、合成或者經(jīng)合成修飾的天然形成的材料，例如多糖(例如纖維素材料，例如紙和纖維素衍生物，例如醋酸纖維素和硝酸纖維素)；聚醚砜；尼龍膜；硅土；無機(jī)材料，例如去活性的氧化鋁、硅藻土、MgSO4、或其它均勻分散在多孔聚合物基質(zhì)中的無機(jī)細(xì)小分離材料，聚合物例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物、和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布料，包括天然形成(例如棉花)和合成的(例如尼龍和人造絲)；多孔膠，例如硅膠、瓊脂糖膠、葡聚糖和白明膠；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺；等等。在一特定實(shí)施方式中，所述多孔膜23由硝酸纖維素和/或聚酯砜材料構(gòu)成。應(yīng)這樣理解，術(shù)語“硝酸纖維素”是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨(dú)的硝酸纖維素，或者硝酸和其它酸的混合酯，例如具有1至7個(gè)碳原子的脂肪族羧酸。
裝置20還可以含有芯吸墊28。所述芯吸墊28通常接受遷移經(jīng)過整個(gè)多孔膜23的液體。如本領(lǐng)域所公知的，芯吸墊28可以幫助促進(jìn)毛細(xì)管作用和液體流經(jīng)膜23。
為了開始檢測測試樣品中的分析物，用戶可以直接將測試樣品施加至多孔膜23的一部分，樣品可以經(jīng)過膜遷移?；蛘?，首先將測試樣品施加于加樣墊(未示出)，所述加樣墊與多孔膜23流體連接。可以形成加樣墊的一些適當(dāng)材料包括但不限于，硝酸纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊、和玻璃纖維濾紙。如果需要，所述加樣墊可以含有一個(gè)或多個(gè)檢測預(yù)處理試劑，所述試劑可以擴(kuò)散性地或非擴(kuò)散性地附著在加樣墊上。
在所描述的實(shí)施方式中，測試樣品從加樣墊(未示出)遷移至結(jié)合墊22，所述結(jié)合墊與加樣墊的一端流體連接。結(jié)合墊22由測試樣品能夠通過的材料構(gòu)成。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合墊22由玻璃纖維構(gòu)成。盡管只顯示了一個(gè)結(jié)合墊22，但是應(yīng)這樣理解，在本發(fā)明中也可以采用其它的結(jié)合墊。
為了有利于檢測測試樣品中分析物的存在與否，在裝置20的不同位置施加標(biāo)記物。所述標(biāo)記物可以用于檢測分析物和校正。一般來說，裝置20中使用的至少一部分標(biāo)記物含有熒光化合物。通常，所述熒光化合物可以是熒光分子、聚合物、樹狀物、顆粒等。
根據(jù)本發(fā)明，所述熒光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)允許進(jìn)行“時(shí)間分辨熒光檢測”。時(shí)間分辨熒光涉及用短脈沖光激發(fā)熒光標(biāo)記物，然后在激發(fā)后以及在測量剩余的長壽命熒光信號之前通常等待一特定時(shí)間(例如大約100-200微秒之間)。這樣，消除了任意的壽命較短的熒光背景信號和散射激發(fā)輻射。消除大多數(shù)背景信號的能力可以使靈敏度比常規(guī)熒光高2至4個(gè)量級。因此，通過利用特定熒光材料的熒光特性，時(shí)間分辨熒光檢測設(shè)計(jì)用于減少來自發(fā)射源或散射過程(由激發(fā)輻射散射導(dǎo)致的)的背景信號。
用于時(shí)間分辨熒光的尤其理想的標(biāo)記物的選擇原則包括相對較長的發(fā)射壽命。如上所述，在任一壽命較短的背景信號損耗之后，標(biāo)記物較好地發(fā)出其信號，這是人們所希望的。而且，長熒光壽命能夠采用低成本的電路進(jìn)行按時(shí)選通的熒光測量。例如，本發(fā)明中使用的熒光標(biāo)記物的熒光壽命可以大于約1微秒，在某些實(shí)施方式中大于約10微秒，在某些實(shí)施方式中大于約50微秒，以及在某些實(shí)施方式中在大約100微秒至大約1000微秒之間。此外，熒光標(biāo)記物還可以具有相對較大的“斯托克司頻移”。術(shù)語“斯托克司頻移”通常是指發(fā)光輻射的譜線或波段位移至比激發(fā)線或波段更長的發(fā)射波長。相對較大的斯托克司頻移使得熒光標(biāo)記物的激發(fā)波長與其發(fā)射波長分離開，這是較為理想的，因?yàn)榧ぐl(fā)和發(fā)射波長之間存在較大的差別能夠更加容易地消除來自發(fā)射信號的反射激發(fā)輻射。進(jìn)一步地，大的斯托克司頻移還使由于樣品中的熒光分子和/或由于蛋白或膠體的光散射引起的干擾降至最低，所述蛋白或膠體在某些體液中存在(例如，血液)。此外，大的斯托克司頻移還減少了昂貴而具有高精確性的濾波器的需求，所述濾波器用于消除背景干擾。例如，在某些實(shí)施方式中，熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移大于大約50納米，在某些實(shí)施方式中大于大約100納米，在某些實(shí)施方式中在大約250至大約350納米。
同時(shí)具有相對較長的發(fā)射壽命和相對較大的斯托克司頻移的熒光化合物的一種類型為釤(Sm(III))、鏑(Dy(III))、銪(Eu(III)))和鋱(Tb(III))的鑭系螯合物。用非常短的波長激發(fā)所述螯合物后，所述螯合物明顯顯示出紅移、窄波段、長時(shí)間的發(fā)射。典型地，由于生色團(tuán)靠近分子中的鑭系元素，所述螯合物具有強(qiáng)的紫外激發(fā)波段。在用生色團(tuán)激發(fā)之后，激發(fā)能可以從被激發(fā)的生色團(tuán)轉(zhuǎn)移至鑭系元素。隨后是鑭系元素的熒光發(fā)射特征。例如，與只有約28納米的熒光素相比，銪螯合物具有非常大的斯托克司頻移，大約為250-350納米。而且，與其它熒光標(biāo)記物的大約1-100毫微秒的壽命相比，銪螯合物的熒光時(shí)間較長，其壽命為大約100-1000微秒。此外，這些螯合物具有非常窄的發(fā)射光譜，通常在大約50％發(fā)射處，其帶寬小于約10納米。一個(gè)適當(dāng)?shù)匿B螯合物為N-(對異硫氰基苯)-二乙烯三胺四乙酸-Eu+3)。
另外，惰性、穩(wěn)定而且在水溶液或懸浮液中固有發(fā)出熒光的鑭系螯合物還可以使本發(fā)明不再需要形成微粒的試劑，所述試劑通常用于保護(hù)具有有限溶解力并且在水溶液或懸浮液中存在淬滅問題的螯合物。所述螯合物的一個(gè)例子是4-[2-(4-異氰硫基苯)乙炔基]-2，6-雙([N，N-雙羧甲基氨基]甲基)-吡啶[參考Lovgren T.等；Clin.Chem.42，1196-1201(1996)].某些鑭系螯合物還顯示特別高的信噪比。例如，一種所述螯合物為四配位基的β-二酮-銪螯合物[參考Yuan，J.和Matsumoto，K.；Anal.Chem.70，596-601(1998)]。除了上述熒光標(biāo)記物外，Mullinax等的美國專利No.6030840；Davidson的美國專利No.5585279；Singer等的美國專利5573909；Wieder等的美國專利No.6242268；Hemmila等的美國專利No.5637509中還描述了其它適合用于本發(fā)明的標(biāo)記物，出于所有目的，上述申請的全文在本文中結(jié)合并引用。
可以各種方式使用熒光標(biāo)記物從而形成探針。例如，可以單獨(dú)使用所述標(biāo)記物構(gòu)成探針。另外，所述標(biāo)記物可以與聚合物、脂質(zhì)體、樹狀物和其它微米級或納米級結(jié)構(gòu)結(jié)合使用從而構(gòu)成探針。另外，標(biāo)記物可以與微粒(通常稱為“小珠”或“微珠”)結(jié)合使用構(gòu)成探針。例如可以使用天然形成的微粒，例如核、支原體、質(zhì)粒、質(zhì)體、哺乳動物細(xì)胞(例如，紅細(xì)胞影)、單細(xì)胞微生物(例如細(xì)菌)、聚糖(例如瓊脂糖)、硅石、玻璃、基于纖維素的顆粒等。而且，還可以利用合成微粒。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，采用了標(biāo)記有熒光或彩色染料的乳膠微粒。盡管在本發(fā)明中可以使用任一種乳膠微粒，但是乳膠微粒通常由以下形成，包括聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯三聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙基丙烯酸甲酯、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡啶、聚二乙烯基苯、聚丁烯對苯二甲酸酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或它們的醛基、羧基、氨基、羥基、酰肼衍生物。其它適當(dāng)?shù)奈⒘Ｒ奐ou等的美國專利申請No.5670381和Tarcha等的美國專利No.5252459，出于所有目的，上述申請的全文在本文中結(jié)合并引用。
在某些實(shí)施方式中，微?？梢允谴判缘摹Ｍǔ?，如果材料受施加的磁場的影響，例如如果材料被吸引或排斥或具有可檢測的磁易感性或誘導(dǎo)，則認(rèn)為該材料具有“磁性”。例如，某些適當(dāng)?shù)木哂写彭憫?yīng)的可用于賦予探針磁性能的材料例子包括但不限于，順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料和變磁性材料。特定的例子為金屬，例如鐵、鎳、鈷、鉻、錳等；鑭系元素，例如釹、鉺等；合金，例如鋁、鎳、鈷、銅等的磁性合金；氧化物，例如氧化鐵(Fe3O4)、氧化亞鐵(Fe2O3)、氧化鉻(CrO2)、氧化鈷(CoO)、氧化鎳(NiO2)、氧化錳(Mn2O3)等；復(fù)合材料，例如鐵氧體等；以及固溶體，例如氧化鐵的磁鐵礦等。
當(dāng)采用顆粒時(shí)，例如如上所述，顆粒的平均直徑通常根據(jù)各種因素而改變，例如所選擇的顆粒類型、膜的孔徑和膜組成。例如，在某些實(shí)施方式中，顆粒狀標(biāo)記物的平均直徑可以為大約0.01微米至大約1000微米，在某些實(shí)施方式中為大約0.01微米至大約100微米，以及在某些實(shí)施方式中為大約0.01微米至大約10微米。在一特定實(shí)施方式中，顆粒的平均直徑為大約0.1至大約2微米。通常，顆?；旧蠟榍蛐危瞧渌螤钜策m用于本發(fā)明，包括但不局限于，盤狀、桿狀、條狀、不規(guī)則形狀等等。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，顆粒的組成、形狀、大小和/或密度可以發(fā)生廣泛地變化。
在某些情況下，較為理想的是，以某種方式對探針進(jìn)行修飾，從而這些探針更加易于結(jié)合分析物。在這種情況下，探針可以用特定結(jié)合組分進(jìn)行修飾，所述結(jié)合組份附著在探針上形成結(jié)合探針。特定結(jié)合組分通常是指一特定結(jié)合對中的一個(gè)組分，所述結(jié)合對即兩個(gè)不同分子，其中一個(gè)分子與第二個(gè)分子化學(xué)和/或物理結(jié)合。例如，免疫反應(yīng)性特定結(jié)合組分可以包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基、抗體以及它們的復(fù)合物，包括由重組DNA方法或肽合成形成的復(fù)合物?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白或它們的混合物或片段，以及抗體和其它特定結(jié)合組分的混合物。上述抗體的制備和用作特定結(jié)合組分的適用性的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。其它常見的特定結(jié)合對包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白、生物素和抗生物素蛋白鏈霉素、抗體結(jié)合蛋白(例如蛋白A或G)以及抗體、碳水化合物和凝集素、互補(bǔ)核苷酸序列(包括在DNA雜交檢測中使用的標(biāo)記和捕獲核酸序列，用于檢測靶核酸序列)、互補(bǔ)肽序列(包括用重組方法形成的肽序列)、效應(yīng)物和受體分子、激素和激素結(jié)合蛋白、酶協(xié)同因子和酶、酶抑制劑和酶，等等。而且，特定結(jié)合對包括的組分可以是原始特定結(jié)合組分的類似物。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即分析物類似物，只要其與分析物具有至少一個(gè)相同的表位。
通常可以采用多種已知方法中的任意一種將特定結(jié)合組分附著于探針上。例如，可以采用羧基、氨基、醛基、溴乙?；?、碘乙酰基、硫醇基、環(huán)氧基以及其它反應(yīng)或連接功能團(tuán)將特定結(jié)合組分共價(jià)連接至探針上，以及通過剩余游離基和游離基陽離子發(fā)生蛋白耦合反應(yīng)從而將特定結(jié)合組分共價(jià)連接至探針上。表面功能基團(tuán)還可以結(jié)合作為功能化的共聚用單體，這是由于微粒的表面可以具有相對高的極化基團(tuán)表面濃度。另外，雖然微粒標(biāo)記物通常在合成后進(jìn)行功能化，在特定情況下，例如聚苯硫酚，微粒能夠直接與蛋白共價(jià)連接，不需要進(jìn)一步的修飾。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合的第一步是采用碳化二亞胺活化顆粒表面的羧基。第二步，活化的羧酸基團(tuán)與抗體的氨基反應(yīng)從而形成酰胺結(jié)合?？梢栽诰彌_液中進(jìn)行活化和/或抗體耦合，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)(例如，pH為7.2)或2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES，例如pH5.3)。如所示的，然后用例如乙醇胺封閉所得到的顆粒，從而形成標(biāo)記共軛物。除了共價(jià)結(jié)合之外，本發(fā)明中還可以采用其它連接方法，例如物理吸附。
通常，根據(jù)本發(fā)明可以構(gòu)建多種流式檢測裝置與時(shí)間分辨熒光檢測系統(tǒng)結(jié)合使用。在這方面，將對本發(fā)明的不同實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。然而，應(yīng)當(dāng)這樣理解，下文討論的實(shí)施方式僅僅是舉例，本發(fā)明還可以構(gòu)思出其他的實(shí)施方式。例如，再次參照附圖1，其示意性地描述了檢測測試樣品中分析物存在的一個(gè)系統(tǒng)。開始，將含有分析物的測試樣品施加至加樣墊(未示出)。然后，測試樣品從加樣墊遷移至結(jié)合墊22，在此，分析物與探針混合形成分析物復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，由微粒構(gòu)成探針，所述微粒用鑭系螯合物標(biāo)記物進(jìn)行染色，如上所述，并且探針結(jié)合至待測分析物的特定結(jié)合組分。而且，由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連接，所述復(fù)合物可以從結(jié)合墊22遷移至多孔膜23上的檢測區(qū)31。
檢測區(qū)31可以含有固定的捕獲試劑，所述捕獲試劑通常能夠與探針形成化學(xué)或物理結(jié)合。例如，在某些實(shí)施方式中，結(jié)合劑中可以含有生物捕獲試劑。利用，在某些實(shí)施方式中，所述捕獲試劑可以是生物捕獲試劑。所述生物捕獲試劑是本領(lǐng)域公知的，可以包括但不限于，抗原、半抗原、抗體、蛋白A或G、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈霉素、第二抗體以及它們的復(fù)合物。在許多情況下，較為理想的是，這些生物捕獲試劑能夠結(jié)合微粒上存在的特定結(jié)合組分(例如抗體)。此外，同樣較為理想的是，利用各種非生物材料作為結(jié)合劑。例如，在某些實(shí)施方式中，結(jié)合劑可以包括能夠結(jié)合未捕獲探針的聚合電解質(zhì)。所述聚合電解質(zhì)可以帶有凈的正或負(fù)電荷，以及通常為中性的凈電荷。例如，某些具有凈正電荷的聚合電解質(zhì)的適當(dāng)例子包括但不限于聚賴氨酸(可以從Sigma-Aldrich Chemical公司，Inc.of St.Louis，MO購買得到)、聚氮丙啶；表氯醇功能化的聚胺和/或聚酰胺型胺類，例如聚(二甲胺-共-表氯醇)；聚二烯丙基二甲基-氯化銨；陽離子纖維素衍生物，例如纖維素共聚物或用四銨水溶性單體嫁接的纖維素衍生物；等等。在一特定實(shí)施方式中，可以使用CelQuatSC-230M或H-100(可從National Starch & Chemical公司購得)，為含有四銨水溶性單體的纖維素衍生物。而且，具有凈負(fù)電荷的聚合電解質(zhì)的某些適當(dāng)例子包括但不限于聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，鈉鹽)等。應(yīng)這樣理解，本發(fā)明中還可以采用其它聚合電解質(zhì)，例如兩性聚合電解質(zhì)(即具有極性和非極性部分)。例如，某些適當(dāng)?shù)膬尚跃酆想娊赓|(zhì)的例子包括但不限于，聚(苯乙烯-b-N-甲基2-乙烯吡啶碘化物)和聚(苯乙烯-b-丙烯酸)，兩者均可以從加拿大的Polymer Source，Inc.of Dorval購得。
這些捕獲試劑作為探針結(jié)合物/分析物復(fù)合物的固定結(jié)合位點(diǎn)。在某些情況下，分析物，例如抗體、抗原等，具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測區(qū)31時(shí)，這些結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)被所述復(fù)合探針的特定結(jié)合組分占據(jù)。但是，分析物的游離結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合固定的捕獲試劑。當(dāng)結(jié)合至固定的捕獲試劑時(shí)，所述復(fù)合探針形成新的三元三明治式復(fù)合物。
檢測區(qū)31通常提供任意數(shù)量的不同檢測區(qū)域，從而用戶可以更好地確定測試樣品中特定分析物的濃度。每個(gè)區(qū)域可以含有相同的捕獲試劑，或可以含有不同的捕獲試劑用于捕獲多個(gè)分析物。例如，檢測區(qū)31可以包括兩個(gè)或多個(gè)不同檢測區(qū)域(例如，線、點(diǎn)等)。所述檢測區(qū)域可以線的形式排列，其方向基本垂直于測試樣品沿著檢測裝置20的流動方向。同樣，在某些實(shí)施方式中，檢測區(qū)域可以線的方式排列，其方向基本平行于測試樣品沿著檢測裝置的流動方向。
盡管檢測區(qū)域31可以指示分析物的存在，采用單一的檢測區(qū)域31很難確定測試樣品中分析物的相對濃度。因此，檢測裝置20還可以包括校正區(qū)32。在該實(shí)施方式中，在多孔膜23上形成檢測區(qū)32，并位于檢測區(qū)31的下游。校正區(qū)32具有捕獲試劑，所述試劑能夠結(jié)合任意剩余的未捕獲探針，其通過整個(gè)膜23的長度。尤其是，當(dāng)與測試樣品接觸時(shí)，未結(jié)合分析物的任意未捕獲探針遷移通過檢測區(qū)31，進(jìn)入多孔膜23的校正區(qū)32。在校正區(qū)32處，然后這些未捕獲探針結(jié)合捕獲試劑。校正區(qū)32中使用的捕獲試劑可以與檢測區(qū)31的捕獲試劑相同或不同。而且，類似于檢測區(qū)31，校正區(qū)32還可以提供任意數(shù)量的不同校正區(qū)域，其可以是任意方向，從而用戶可以更好地確定測試樣品中特定分析物的濃度。每個(gè)區(qū)域可以含有相同的捕獲試劑，或者可以含有不同的捕獲試劑用于捕獲不同的熒光標(biāo)記物。
含有不同量結(jié)合劑的校正區(qū)域可以預(yù)先放置于多孔膜23上，從而當(dāng)未捕獲探針遷移時(shí)，每個(gè)校正區(qū)域產(chǎn)生不同的信號強(qiáng)度。通過采用不同大小的校正區(qū)域和/或通過改變每個(gè)校正區(qū)域內(nèi)的結(jié)合劑的濃度或體積，每個(gè)校正區(qū)域內(nèi)的結(jié)合劑總量可以不同。如果需要，在檢測裝置20中可以采用過量的探針分子，從而每個(gè)校正區(qū)域達(dá)到其全部和預(yù)定的信號強(qiáng)度。也就是說，沉積在校正區(qū)域上的未捕獲探針的量是預(yù)定的，這是因?yàn)椋Ｕ齾^(qū)域上結(jié)合劑的量設(shè)定在預(yù)定而且已知的水平。
一旦被捕獲，采用時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器50可以測量檢測和校正區(qū)31和32的探針熒光信號。例如，在該實(shí)施方式中，熒光讀數(shù)器50的構(gòu)建使其能夠同時(shí)發(fā)射脈沖光至檢測和校正區(qū)31和32。讀數(shù)器50還可以同時(shí)接收檢測和校正區(qū)31和32的被激發(fā)標(biāo)記物發(fā)出的熒光信號。另外，熒光讀數(shù)器50的構(gòu)建使其可以連續(xù)發(fā)出脈沖光至檢測區(qū)31和校正區(qū)32。此外，還可以采用單個(gè)熒光讀數(shù)器(未示出)測量校正區(qū)32的熒光信號。
通?？梢愿鶕?jù)多個(gè)因素改變熒光讀數(shù)器50的結(jié)構(gòu)，例如成本、所需要的準(zhǔn)確性水平、感興趣的分析物的性質(zhì)和濃度等。典型地，熒光讀數(shù)器50利用一個(gè)或多個(gè)的脈沖激勵源和光電檢測器，它們相互連接以及與其它可選擇組件連接，例如濾波器。采用脈沖激勵和按時(shí)選通檢測，選擇性地與濾波器結(jié)合，可以對僅僅來自熒光標(biāo)記物的熒光進(jìn)行特定檢測，而排除樣品中存在的其它物質(zhì)的發(fā)射，這些物質(zhì)的發(fā)射通常壽命較短。
例如，參照附圖2，其顯示了示例性的熒光讀數(shù)器50的一個(gè)實(shí)施方式，其包括激勵源52和檢測器54。本發(fā)明中可以使用不同的激勵源52，包括例如，發(fā)光二極管(LED)，閃光燈以及其它適當(dāng)?shù)墓庠?。激發(fā)照明還可以是多路復(fù)用的和/或經(jīng)準(zhǔn)直的；例如，來自多個(gè)相干輻射源(例如激光)的各種不同頻率的光束可以采用分色鏡陣列進(jìn)行準(zhǔn)直和多路復(fù)用。而且，照明可以是連續(xù)的或者脈沖式的，或者可以結(jié)合連續(xù)波(CW)和脈沖照明，其中多個(gè)照明光束為多路復(fù)用的(例如，脈沖光束可以用CW光束進(jìn)行多路復(fù)用)，從而可以對CW源誘發(fā)的熒光和脈沖源誘發(fā)的熒光進(jìn)行信號區(qū)分。例如，砷化鎵LED二極管(例如，鋁砷化鎵紅色二極管、磷化鎵綠色二極管、砷磷化鎵綠色二極管、或氮化銦鎵紫色/藍(lán)色/紫外(UV)二極管)可以用作照明源。適合用于本發(fā)明的適當(dāng)UV LED激發(fā)二極管的一個(gè)商業(yè)上可購得的例子為Model NSHU55OE(Nichia公司)，其發(fā)出光強(qiáng)度為750-1000微瓦、正向電流為10毫安培(3.5-3.9伏特)的全波寬光束，其半最大值為10度，峰波長為370-375納米，光譜半波寬為12納米。
進(jìn)一步地，可以在本發(fā)明中使用的適當(dāng)檢測器54的例子包括但不局限于，光電倍增管裝置；光電二極管，例如雪崩光電二極管、硅光電二極管等；高速、線性電荷耦合裝置(CCD)、CID裝置、或基于CMOS的成像儀；等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述熒光系統(tǒng)利用硅光電二極管進(jìn)行熒光檢測。硅光電二極管較為有利，這是因?yàn)樗鼈冚^為便宜、敏感，能夠進(jìn)行高速操作(短上升時(shí)間、高帶寬)，易于與大多數(shù)的其它半導(dǎo)體技術(shù)和單片電路結(jié)合。此外，硅光電二極管在物理上較小，其能夠與用于基于膜的裝置的系統(tǒng)結(jié)合。如果使用硅光電二極管，熒光發(fā)射的波長范圍應(yīng)在其靈敏度范圍內(nèi)，其為400至1100納米。另一檢測器的選擇為CdS(硫化鎘)光導(dǎo)電池，其優(yōu)點(diǎn)是，其光譜靈敏度類似于人類的視力(適光曲線)，從而更加易于排除反射的激勵輻射。
可選擇地，濾波器(未示出)可以鄰近激勵源52和檢測器54放置。所述濾波器在激勵波長范圍內(nèi)具有高的透過率而在一個(gè)或多個(gè)不合需要的波段具有低透過率，從而將激勵源發(fā)出的不合需要的波長過濾掉。不合需要的波長范圍通常包括那些產(chǎn)生可檢測的樣品自熒光的波長，和/或激勵最大波長位于大約25至大約100納米范圍內(nèi)的波長，因此，上述波長是散射激勵照明發(fā)出的背景噪聲的潛在來源。本發(fā)明可以使用的濾波器的幾個(gè)例子包括但不限于，染色塑料樹脂或明膠濾光片、分色鏡、薄的多層膜干擾濾波器、塑料或玻璃濾片、環(huán)氧或硬透明樹脂濾光片。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測器和/或激勵源可以包埋于或密封于濾波器中。盡管可以采用濾波器，但是本發(fā)明的一個(gè)益處在于，由于采用時(shí)間分辨，因此通常不需要所述濾波器。尤其是，由于熒光發(fā)射的延遲，不需要采用發(fā)射帶寬濾波器將激勵源發(fā)出的任一短壽命的熒光過濾掉。
再次參考附圖2，還可以采用不同的定時(shí)電路控制激勵源52的脈沖激勵，以及控制對所發(fā)出的熒光的測量。例如，在所描述的實(shí)施方式中，采用時(shí)鐘脈沖源56(例如，晶體振蕩器)為熒光讀數(shù)器50的其它電子組件提供經(jīng)控制的頻率源。在該特定實(shí)施方式中，例如，振蕩器56可以產(chǎn)生20MHz信號，將其提供至LED驅(qū)動器/脈沖發(fā)生器55和A/D轉(zhuǎn)換器64。來自振蕩器56并提供至A/D轉(zhuǎn)換器64的時(shí)鐘信號控制A/D轉(zhuǎn)換器64的工作速度。應(yīng)當(dāng)這樣理解，如果A/D轉(zhuǎn)換器64的工作頻率或如果時(shí)鐘輸入至LED驅(qū)動器/脈沖發(fā)生器55的所需頻率不同于20MHz，可以在上述各自的信號通道中利用分頻器。因此，應(yīng)當(dāng)這樣理解，來自振蕩器56的信號可以適當(dāng)?shù)乇恍揎?，從而提供所需頻率的信號。在某些實(shí)施方式中，來自振蕩器56的信號還可以提供至微處理器60，從而控制其運(yùn)行速度。根據(jù)本發(fā)明，在其它信號通道中還可以采用額外的分頻器。
微處理器60提供控制輸入至脈沖發(fā)生器55，這樣，可編程地對來自振蕩器56的20MHz信號進(jìn)行調(diào)整，從而提供需要的脈沖持續(xù)時(shí)間和重復(fù)頻率(例如，具有50％工作周期的1kHz源)。然后，可以將來自脈沖發(fā)生器55的信號提供至激勵源52，控制其脈沖重復(fù)頻率和照明的工作周期。在某些實(shí)施方式中，可以在至激勵源52的信號通道上提供晶體管，以提供轉(zhuǎn)換裝置，從而在激勵源52處實(shí)現(xiàn)脈沖光信號。
如上所述，脈沖光激發(fā)附屬的檢測裝置的熒光標(biāo)記物。在所需要的響應(yīng)時(shí)間之后(例如大約100至大約200微秒)，檢測器54檢測激發(fā)的熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光信號，并產(chǎn)生代表所述信號的電流。然后，將所述電流通過高速跨阻抗前置放大器78轉(zhuǎn)化為電壓水平，其可以通過相對低的設(shè)定時(shí)間和從飽和狀態(tài)快速回復(fù)進(jìn)行表征。然后，將前置放大器78的輸出提供至A/D轉(zhuǎn)換器64的數(shù)據(jù)輸入。在前置放大器78之后以及A/D轉(zhuǎn)換器64之前，可以在信號通道上提供額外的放大器元件(例如可編程的增益放大器)，從而在激勵脈沖的后沿產(chǎn)生適當(dāng)電壓范圍內(nèi)的信號，并提供至A/D轉(zhuǎn)換器64。A/D轉(zhuǎn)換器64可以是高速轉(zhuǎn)換器，其抽樣率足夠在附屬熒光標(biāo)記物的熒光壽命范圍內(nèi)獲取多個(gè)點(diǎn)?？梢栽O(shè)置前置放大器78的增益，從而數(shù)據(jù)值降至激勵脈沖后沿的最大A/D計(jì)數(shù)(例如對于12位轉(zhuǎn)換器為2047)。然后，A/D轉(zhuǎn)換器的動態(tài)范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)主要代表所需要的熒光信號。如果與激勵脈沖的上升時(shí)間和下降時(shí)間相比，抽樣間隔較短，則可以設(shè)置前置放大器78的增益，從而確保A/D轉(zhuǎn)換器78的上1/2或3/4的動態(tài)范圍內(nèi)的信號值對應(yīng)于發(fā)射脈沖的后沿。
A/D轉(zhuǎn)換器64從前置放大器78抽取信號，將其提供至微處理器60，其中構(gòu)建軟件指令對數(shù)字信號進(jìn)行不同的處理。來自微處理器60的輸出提供至A/D轉(zhuǎn)換器64，從而當(dāng)被檢測的熒光信號被抽樣時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步的控制?？梢赃B續(xù)對提供至前置放大器78(未示出)和A/D轉(zhuǎn)換器64的控制信號進(jìn)行修改，從而得到最適當(dāng)?shù)脑鲆?、抽樣間隔和觸發(fā)偏移。應(yīng)當(dāng)這樣理解，盡管A/D轉(zhuǎn)換器64和微處理器60被描繪成不同的組件，在本發(fā)明中還可以采用商業(yè)上可以購買得到的在單個(gè)模塊上包括上述兩個(gè)組件的芯片。處理后，微處理器60可以提供至少一個(gè)被指示檢測器54檢測的熒光水平的輸出。將一個(gè)所述范例性的輸出提供至顯示器86，從而向用戶提供關(guān)于標(biāo)記物所生成的熒光信號的視覺指示。顯示器86可以提供額外的交互式特征，例如用戶可以提供程序可控輸入至微處理器60的控制界面。
附圖3中還描述了用于熒光讀數(shù)器50的代表性特定電子組件的另一實(shí)施方式。附圖3中的許多組件類似于附圖2的組件，從而在上述情況下采用相同的附圖標(biāo)記。例如，附圖3的讀數(shù)器50與附圖2相比，其中一個(gè)區(qū)別是在相位延遲模塊57中生成選通信號。將來自微處理器60的控制信號提供至相位延遲模塊57，從而對所提供的時(shí)鐘信號的有效相移進(jìn)行編程。然后，將偏移的時(shí)鐘信號(也稱為選通信號)提供至混頻器58，在此，所述信號經(jīng)檢測器54接收的周期性檢測器信號進(jìn)行倍增，并通過前置放大器78。然后，在提供至A/D轉(zhuǎn)換器64之前，將所得到的混頻器58的輸出經(jīng)過低通濾波器62。A/D轉(zhuǎn)換器64可以測量低通濾波器62的輸出，從而得到選通信號所限定的間隔期間的熒光量度。
附圖4描述了示例性熒光讀數(shù)器實(shí)施方式50的其它特征。例如，顯示了抽樣/保持放大器88(有時(shí)也稱為跟蹤和保持放大器)，其在外部信號控制下及時(shí)捕獲并保持特定點(diǎn)的電壓輸入信號。本技術(shù)所采用的抽樣/保持放大器的一個(gè)特定例子是SHC5320芯片，例如Burr-Brown公司所出售的。附圖4實(shí)施方式中的所述抽樣/保持放大器外部控制信號來自延遲電路92，其可以是例如數(shù)字延遲電路，采用計(jì)數(shù)器、基礎(chǔ)邏輯門和觸發(fā)電路從時(shí)鐘衍生出預(yù)定延遲。延遲電路92從振蕩器56接收時(shí)鐘信號，并從分頻器90接收起動信號，其簡單提供周期性信號，所述信號的頻率低于振蕩器56產(chǎn)生的信號的頻率。延遲電路92還可以從微處理器60接收控制輸入，從而啟動延遲的可程序控制，以確保抽樣/保持放大器88的正確抽樣。當(dāng)激勵源52關(guān)閉之后，來自延遲電路92并提供至抽樣/保持放大器88的所述延遲脈沖控制信號啟動在預(yù)定時(shí)間間隔獲取來自檢測器54的熒光信號。
不論所采用的讀數(shù)器50的結(jié)構(gòu)，可以將在檢測區(qū)31捕獲的標(biāo)記物發(fā)出的熒光信號Is與預(yù)定的分析物濃度相互關(guān)聯(lián)起來，從而確定分析物的量。在某些實(shí)施方式中，強(qiáng)度信號Is還可以與校正區(qū)32捕獲的標(biāo)記物發(fā)出的熒光強(qiáng)度信號Ic進(jìn)行比較。熒光強(qiáng)度信號Is可以與熒光強(qiáng)度信號Ic比較。在該實(shí)施方式中，校正區(qū)32的標(biāo)記物總量是預(yù)先確定的而且已知的，其由此可以用作校正目的。例如，在某些實(shí)施方式中(例如三明治式檢測)，分析物的量與Is和Ic的比率成正比。在其它實(shí)施方式中(例如競爭性檢測)，分析物的量與Is和Ic的比率成反比?；跈z測區(qū)31的強(qiáng)度范圍，可以確定分析物的總的濃度范圍。因此可以在近乎相同的條件下同時(shí)進(jìn)行校正和樣品檢測，從而提供可靠的定量或半定量結(jié)果，而且靈敏度增加。
如果需要，就Is和Ic的比率對在已知分析物濃度范圍內(nèi)的分析物濃度進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。為了確定未知測試樣品中的分析物量，根據(jù)校正曲線，將信號比率轉(zhuǎn)化為分析物濃度。應(yīng)注意的是，可以就Is和Ic的另外數(shù)學(xué)關(guān)系對分析物濃度作圖，從而得到校正曲線。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以就Is/(Is+Ic)的值對分析物濃度進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。
如上所述，裝置20可以采用三明治形式、競爭性形式等等。三明治式檢測形式通常涉及將測試樣品與分析物的抗體混合。這些抗體是移動的并與標(biāo)記物連接，例如染色乳膠、膠體狀金屬溶膠或放射性同位素。然后，所述混合物與色譜分離介質(zhì)接觸，所述介質(zhì)含有分析物的固定抗體的帶或區(qū)域。所述色譜分離介質(zhì)通常為類似于量桿的條狀物。當(dāng)分析物和標(biāo)記抗體的復(fù)合物到達(dá)色譜分離介質(zhì)上的固定抗體區(qū)域，發(fā)生結(jié)合，所結(jié)合的標(biāo)記抗體定位在所述區(qū)域內(nèi)。其指示了分析物的存在。該方法可以用于獲得定量或半定量結(jié)果。所述三明治式檢測方法的例子參見Grubb等的美國專利申請No.4168146和Tom等的美國專利申請No.4366241，出于所有目的，所述申請的全文在本文中結(jié)合并引用。
在競爭性檢測中，標(biāo)記物通常為標(biāo)記的分析物或分析物類似物，其與樣品中存在的任意未標(biāo)記分析物競爭結(jié)合抗體。競爭性檢測通常用于檢測例如半抗原的分析物，每個(gè)半抗原為單價(jià)，儀能結(jié)合一個(gè)抗體分子。競爭性免疫檢測裝置的例子參見Deutsch等的美國專利No.4235601，Liotta的美國專利No.4442204和Buechler等的美國專利No.5208535，出于所有目的，所述申請的全文在本文中結(jié)合并引用。Lambotte等的美國專利申請No.5395754；Jou等的美國專利No.5670381；和Malich等的美國專利No.6194220中還公開了不同的其它裝置結(jié)構(gòu)和/或檢測方式，出于所有目的，所述申請的全文在本文中結(jié)合并引用。
盡管上文已經(jīng)描述了裝置結(jié)構(gòu)的不同實(shí)施方式，但是應(yīng)當(dāng)這樣理解，本發(fā)明的裝置通常可以具有任意所需的結(jié)構(gòu)，不需要包含上述的所有組件。
參照以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1其顯示了形成用于基于膜的裝置中的結(jié)合熒光探針顆粒的能力。用100微升PBS緩沖液(0.1摩爾)清洗500微升的0.5％羧化銪螯合物封閉的顆粒(0.20微米，EU-P顆粒，來自Molecular Probes公司)。然后對40微升清洗過的顆粒施加3毫克碳化二亞胺(來自Polysciences公司)。所述混合物在室溫(RT)下在振蕩器上反應(yīng)30分鐘。然后，用硼酸鹽緩沖液通過離心對活化的顆粒進(jìn)行清洗。將活化的顆粒通過2分鐘的浴化超聲處理再次懸浮于200微升的硼酸鹽緩沖液中。
之后，在活性顆粒中加入30微升C反應(yīng)蛋白(CRP)(4.9毫克每毫升，Mab1 A58110228P，來自BiosPacific，Emeryville公司，CA)。所述反應(yīng)混合物在室溫下在振蕩器上反應(yīng)2.5小時(shí)。然后收集活化顆粒并在0.25毫升的0.25摩爾乙醇胺中孵化，輕微振蕩30分鐘。用PBS清洗顆粒兩次。然后在冰浴中用PBS對顆粒進(jìn)行探針超聲處理10秒、三次，然后存儲于4℃。
實(shí)施例2用常規(guī)的FluoroLog III分光熒光計(jì)(購自Horiba基團(tuán))在370納米的激發(fā)波長和615納米的發(fā)射波長確定實(shí)施例1中形成的結(jié)合探針顆粒的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。
結(jié)果示于附圖5中。如圖所示，探針顆粒的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜類似于未結(jié)合探針顆粒的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，但是，結(jié)合探針顆粒的430納米峰對615納米峰的相對強(qiáng)度較高。結(jié)合探針顆粒在350納米左右具有強(qiáng)的激發(fā)峰，在430和615納米處具有兩個(gè)強(qiáng)的發(fā)射峰。430納米處的發(fā)射峰認(rèn)為是來自配體，而615納米處的峰認(rèn)為來自銪金屬離子的d-d轉(zhuǎn)換，其是從配體至銪金屬中心的能量轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3顯示了形成基于膜的檢測的能力。開始，由硝酸纖維素構(gòu)成的Millipore SX多孔膜樣品層壓至相應(yīng)的支撐卡片上，長度大約為30厘米。C反應(yīng)蛋白(CRP)單克隆抗體(Mab A58040136P，2.3mg/ml，來自BiosPacific，Emeryville公司，CA)在膜上形成條帶，從而構(gòu)成檢測線。然后將Goldline(從British Biocell International得到的聚賴氨酸溶液)劃在膜上從而形成校正線。在37℃干燥所述膜一個(gè)小時(shí)。
將纖維素纖維芯吸墊(Millipore公司)附著于膜的一端。在膜的另一端層壓兩個(gè)來自Millipore公司的玻璃纖維墊(樣品和結(jié)合墊)。所述結(jié)合墊和芯吸墊與膜直接接觸，樣品墊與結(jié)合墊直接接觸。結(jié)合墊和樣品墊每個(gè)的寬度為4毫米。用1％聚氧化乙烯山梨聚糖單月桂酸酯(來自SigmaAldrich的非離子表面活性劑，商品名為“Tween 20”)處理樣品墊，并在37℃干燥2小時(shí)。用200微升實(shí)施例1中的結(jié)合探針顆粒處理所述結(jié)合墊，所述結(jié)合墊與PBS緩沖液、200微升的2％Tween 20和200微升的20％蔗糖混合。在干燥爐中在37℃下對浸濕的結(jié)合墊進(jìn)行干燥1.5小時(shí)。
所得到的裝置密封于袋中并儲存。
實(shí)施例4確定實(shí)施例3的裝置檢測分析物存在的能力。尤其是，提供實(shí)施例3裝置的8個(gè)全樣品。將40微升不同濃度的CRP的PBS溶液(即，0，1，2，5，10，20，50和100毫微克每毫升)分別直接施加至每個(gè)樣品的樣品墊上。讓所述裝置反應(yīng)30分鐘，在370納米和611.5納米的激發(fā)波長處分別測量檢測線和校正線的熒光。用常規(guī)FluoroLog III分光熒光計(jì)(購自Horiba Group)采用正面模式測量熒光。將激發(fā)光束相對于裝置的曲面法線定位于大約70°，將發(fā)射光束相對于裝置的曲面法線定位于大約45°。盡管視覺觀察在大約15分鐘內(nèi)反應(yīng)完全，但是在進(jìn)行熒光測量之前應(yīng)有足夠的時(shí)間以完全反應(yīng)。
表I給出校正線和檢測線的熒光數(shù)據(jù)。
表I熒光數(shù)據(jù)


附圖6顯示了Is/(Is+Ic)的標(biāo)化強(qiáng)度比率對CRP濃度的曲線。將樣品的測量熒光強(qiáng)度除以對照樣品的熒光強(qiáng)度得到標(biāo)化強(qiáng)度。如圖所示，劑量反應(yīng)曲線經(jīng)校正線校正成線性，特別是當(dāng)CRP濃度低于20毫微克每毫升。
實(shí)施例5確定了實(shí)施例3裝置檢測分析物存在的能力。特別是，提供了五組，每組均含有實(shí)施例3裝置的四個(gè)全樣品。將40微升不同濃度的CRP的PBS溶液(即，0，1，2和5毫微克每毫升)直接施加至樣品墊。讓所述裝置反應(yīng)30分鐘，在370納米和611.5納米的激發(fā)波長處分別測量檢測線和校正線的熒光。用常規(guī)FluoroLog III分光熒光計(jì)采用正面模式測量熒光。將激發(fā)光束相對于裝置的曲面法線定位于大約70°，將發(fā)射光束相對于裝置的曲面法線定位于大約45°。盡管視覺觀察在大約15分鐘內(nèi)反應(yīng)完全，但是在進(jìn)行熒光測量之前應(yīng)有足夠的時(shí)間以完全反應(yīng)。
表II和III給出校正線和檢測線的熒光數(shù)據(jù)。
表II熒光數(shù)據(jù)(Is/Ic)

表III平均熒光強(qiáng)度/標(biāo)準(zhǔn)差(Is/Is+Ic)

因此，本發(fā)明的結(jié)果是在檢測期間可以實(shí)際上將多個(gè)來源的背景干擾消除掉，例如散射光和自熒光。此外，本發(fā)明中使用的熒光讀數(shù)器可以具有簡單且便宜的設(shè)計(jì)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述讀數(shù)器可以利用脈沖發(fā)光二極管(LED)和硅光電二極管，從而精確激發(fā)標(biāo)記物，并在基于膜的檢測裝置上檢測熒光，而不需要使用昂貴的組件，例如單色器或窄發(fā)射帶寬的濾波器。
盡管已經(jīng)就特定實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)注意的是，當(dāng)理解上述內(nèi)容時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以非常容易地構(gòu)思出這些實(shí)施方式的變化、修改以及等同物。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)由以下所附的權(quán)利要及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供流式檢測裝置，其包括與熒光標(biāo)記物流體連接的多孔膜，所述熒光標(biāo)記物的熒光發(fā)射壽命大于約1微秒，所述多孔膜限定了檢測區(qū)；ii)所述熒光標(biāo)記物與測試樣品接觸，形成混合物；iii)使所述混合物流至所述檢測區(qū)；iv)將時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器鄰近所述檢測區(qū)放置，所述熒光讀數(shù)器包括脈沖激勵源和按時(shí)選通的檢測器；v)用所述脈沖激勵源激發(fā)檢測區(qū)的熒光標(biāo)記物，其中所述激發(fā)使得熒光標(biāo)記物發(fā)出檢測信號；以及vi)用所述按時(shí)選通檢測器測量檢測信號的強(qiáng)度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的發(fā)射壽命大于約10微秒。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的發(fā)射壽命在大約100至大約1000微秒之間。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移大于約50納米。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移大于約100納米。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移在大約250納米至大約350納米之間。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物包括釤、鏑、銪和鋱的鑭系螯合物，或它們的組合。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為銪螯合物。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物與微粒、納米顆粒、脂質(zhì)體、樹狀物、聚合物及它們的組合結(jié)合使用。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物與經(jīng)分析物的特定結(jié)合組分修飾的微?；蚣{米顆粒結(jié)合使用。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測區(qū)包括多個(gè)檢測區(qū)域。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述檢測區(qū)域含有多個(gè)用于結(jié)合多種分析物的捕獲試劑。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多孔膜進(jìn)一步限定了校正區(qū)，其中所述混合物還可以流至所述校正區(qū)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述校正區(qū)包括多個(gè)檢測區(qū)域。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述校正區(qū)域含有多個(gè)用于結(jié)合多種熒光標(biāo)記物的捕獲試劑。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器鄰近校正區(qū)放置；用所述脈沖激勵源激發(fā)所述校正區(qū)的熒光標(biāo)記物，其中所述激發(fā)使熒光標(biāo)記物發(fā)出校正信號；用按時(shí)選通檢測器測量校正信號的強(qiáng)度；以及比較檢測信號和校正信號的強(qiáng)度，其中測試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號強(qiáng)度校正的檢測信號強(qiáng)度成比例。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中檢測區(qū)的熒光標(biāo)記物與校正區(qū)的熒光標(biāo)記物同時(shí)被激發(fā)。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述檢測信號和校正信號同時(shí)被測量。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述脈沖激勵源為發(fā)光二極管。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述按時(shí)選通檢測器為硅光電二極管。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述熒光讀數(shù)器含有與所述脈沖激勵源和按時(shí)選通檢測器相連接的定時(shí)電路，所述定時(shí)電路控制脈沖激勵和檢測。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述濾波器鄰近所述脈沖激勵源、按時(shí)選通檢測器或它們的組合放置。
23.一種檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供流式檢測裝置，其包括與含有熒光標(biāo)記物的結(jié)合探針流體連接的多孔膜，所述熒光標(biāo)記物的熒光發(fā)射壽命大于約10微秒，所述多孔膜限定了檢測區(qū)和校正區(qū)；ii)所述結(jié)合探針與測試樣品接觸，形成混合物；iii)使所述混合物流至所述檢測區(qū)和校正區(qū)；iv)將時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器鄰近所述檢測區(qū)和校正區(qū)放置，所述熒光讀數(shù)器包括脈沖激勵源和按時(shí)選通檢測器；v)用所述脈沖激勵源激發(fā)檢測區(qū)和校正區(qū)的熒光標(biāo)記物，其中所述激發(fā)使得熒光標(biāo)記物在檢測區(qū)發(fā)出檢測信號，使熒光標(biāo)記物在校正區(qū)發(fā)出校正信號；以及vi)用所述按時(shí)選通檢測器測量檢測信號和校正信號的強(qiáng)度；vii)比較檢測信號和校正信號的強(qiáng)度，其中測試樣品中的分析物的量與經(jīng)校正信號強(qiáng)度校正的檢測信號強(qiáng)度成比例。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的發(fā)射壽命大約為100至1000微秒。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移大于約50納米。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移在約250至350納米之間。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物包括釤、鏑、銪和鋱的鑭系螯合物，或它們的組合。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為銪螯合物。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中檢測區(qū)的熒光標(biāo)記物與校正區(qū)的熒光標(biāo)記物同時(shí)被激發(fā)。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其中同時(shí)測量所述檢測信號和校正信號。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述脈沖激勵源為脈沖發(fā)光二極管。
32.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述按時(shí)選通檢測器為硅光電二極管。
33.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熒光讀數(shù)器含有與所述脈沖激勵源和按時(shí)選通檢測器相連接的定時(shí)電路，所述定時(shí)電路控制脈沖激勵和檢測。
34.一種檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供流式檢測裝置，其包括與含有鑭系螯合物的結(jié)合探針流體連接的多孔膜，所述鑭系螯合物的熒光發(fā)射壽命大于約50微秒，其斯托克司頻移大于約100納米，所述多孔膜限定了檢測區(qū)和校正區(qū)；ii)所述結(jié)合探針與測試樣品接觸，形成混合物；iii)使所述混合物流至所述檢測區(qū)和校正區(qū)；iv)將時(shí)間分辨熒光讀數(shù)器鄰近所述檢測區(qū)和校正區(qū)放置，所述熒光讀數(shù)器包括脈沖發(fā)光二極管和按時(shí)選通檢測器，所述檢測器包括硅二極管；v)用所述脈沖發(fā)光二極管激發(fā)檢測區(qū)和校正區(qū)的鑭系螯合物，其中所述激發(fā)使得檢測區(qū)的鑭系螯合物發(fā)出檢測信號，使校正區(qū)的鑭系螯合物發(fā)出校正信號；以及vi)用所述按時(shí)選通檢測器測量檢測信號和校正信號的強(qiáng)度；vii)比較檢測信號和校正信號的強(qiáng)度，其中測試樣品中的分析物的量與經(jīng)校正信號強(qiáng)度校正的檢測信號的強(qiáng)度成比例。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述鑭系螯合物選自由以下構(gòu)成的組，包括釤、鏑、銪和鋱的鑭系螯合物，或它們的組合。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述鑭系螯合物為銪螯合物。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述脈沖發(fā)光二極管為紫外發(fā)光二極管。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述熒光讀數(shù)器含有與所述脈沖激勵源和按時(shí)選通檢測器相連接的定時(shí)電路，所述定時(shí)電路控制脈沖激勵和檢測。
39.如權(quán)利要求34所述的方法，其中檢測區(qū)的熒光標(biāo)記物與校正區(qū)的熒光標(biāo)記物同時(shí)被激發(fā)。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其中同時(shí)測量所述檢測信號和校正信號。
41.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的發(fā)射壽命為大約100至1000微秒。
42.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物的斯托克司頻移在約250至350納米之間。
全文摘要
提供了一種基于膜的檢測裝置，用于檢測測試樣品中分析物的存在和量。所述裝置采用時(shí)間分辨熒光檢測被激發(fā)的熒光標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號。由于所述標(biāo)記物具有相對較長的發(fā)射壽命，通過延遲的熒光檢測實(shí)際上可以消除壽命較短的背景干擾。此外，所得到的熒光讀數(shù)器可以具有簡單而且便宜的設(shè)計(jì)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式，讀數(shù)器利用硅光電二極管和脈沖發(fā)光二極管(LED)，精確激發(fā)標(biāo)記物和檢測基于膜的檢測裝置上的熒光，而不需要使用昂貴的組件，例如單色器或窄發(fā)射帶寬濾波器。
文檔編號G01N33/58GK1675545SQ03819391
公開日2005年9月28日 申請日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月27日
發(fā)明者宋旭東, R·凱洛, M·克諾茨, 衛(wèi)寧 申請人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司